2. 中药资源教育部工程研究中心, 北京 100193;
3. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700
2. Engineering Research Center of Chinese Medicine Resources, Ministry of Education, Beijing 100193, China;
3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis (BerK.) Sacc.)侵染蝙蝠蛾科昆虫幼虫而形成的幼虫尸体与真菌子座的复合体[1], 在我国是一种传统的名贵中药材, 具有较高的药用价值。其性平, 味甘, 归肺、肾经, 具有补肾益肺、止血化痰的功效, 主治肾虚精亏、阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘、劳嗽咯血[1]。目前发现其分布在中国的西藏、青海、云南、四川和甘肃五省(区), 以及不丹、印度、尼泊尔的喜马拉雅山南麓的部分地区[2, 3]。近年来, 冬虫夏草分布区生态环境破坏严重, 市场的巨大需求导致过度开发, 使得野生资源萎缩, 价格不断飙升[4, 5]。因此, 市场上常出现下垂虫草Ophiocordyceps nutans、古尼虫草Cordyceps gunnii、凉山虫草Cordyceps liangshanensis、蛹虫草Cordyceps militaris、新疆虫草Cordyceps gracilis、蝉花Cordyceps cicadae等[6]混伪品假冒冬虫夏草的现象, 极大地损害了消费者的利益。所以, 有必要开展冬虫夏草真伪鉴定研究。
冬虫夏草及其混伪品的鉴定主要依赖于传统的生药学方法, 此法主要从样品的虫体色泽、环纹数、子座表面结构、子座着生位置、腹足、长短以及气味等特征进行观察比较[7-11], 需要丰富的鉴定经验, 且常见混伪品经加工修饰与冬虫夏草形态高度相似, 区分难度大, 一般需要结合其他分析鉴定技术进行鉴别。化学方法如高效液相色谱以及液质联用技术, 耗费材料多, 且需要大型仪器支持[12-15], 推广难度大。DNA条形码技术是指利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段作为物种标记而建立的一种分子鉴定方法, 能准确进行物种鉴别, 已成为近年来生物分类和鉴定的研究热点, 其标准操作流程包含DNA提取、PCR扩增、电泳、测序、数据分析及结果判定等[16-18], 尚未能实现对待检样品的即时监测, 因此, 仍需开发更加便捷、快速的检测方法以满足药材市场监控需求。
实时荧光PCR技术以其特异灵敏、快速准确、操作简便等优点在基因表达分析、食品检测、环境监测、医学检测和诊断等方面得到广泛应用[19]。TaqMan探针法是具有高度特异性的荧光PCR技术, 工作原理是在PCR反应体系中引入一对引物和探针, 探针的5'端标记有荧光基团, 3'端标记有淬灭基团, 利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性切断位于两条引物之间仅与模板特异性结合的探针, 导致荧光基团荧光能量不能被淬灭基团吸收, 产生荧光信号, 仪器通过收集信号进行结果判定, 结果准确、分辨率高[20]。本研究利用TaqMan探针技术, 建立了一种快速、准确鉴定冬虫夏草的实时荧光PCR方法, 为中药材市场的管理和中药生产企业的原料监管提供技术支撑。
材料与方法药材 本研究通过采集和市场购买两种方式共收集40份冬虫夏草和60份混伪样品, 其中下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草、新疆虫草各10份, 来自青海、西藏、四川、江苏、安徽、北京等地, 研究样本经中国中医科学院中药研究所向丽副研究员鉴定, 详细信息见表 1。另外, 184条来自文献的冬虫夏草及其混伪品ITS序列被用于TaqMan探针和特异性引物设计[18, 21-24]。
实验仪器 Genesig q16便携式快速分子鉴定系统(北京科奥明公司)、CFX96实时荧光PCR仪(美国Bio-Rad公司)、MM400组织研磨仪(德国Retsch公司)、AL204-IC分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)、5424R小型高速离心机(德国Eppendorf公司)、基因扩增仪(德国Analytik Jena公司)、NanoDrop2000紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)、数显恒温水浴锅(北京陆希公司)、ABI 3730 XL测序仪(美国Applied Biosystems公司)。
试剂 DP305-03植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化公司)、2×Taq PCR Mix (北京艾德莱公司)、2×MasterMix (英国Primer design公司)、琼脂糖(西班牙Biowest公司)、通用扩增引物ITS5F: 5'-GGAA GTAAAAGTCGTAACAAGG-3'; ITS4R: 5'-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3' (苏州金唯智公司)[21]、灭菌超纯水。
DNA提取 用75%酒精棉球将冬虫夏草及其混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草和新疆虫草表面擦拭干净, 晾干, 称取子座部分30 mg左右, 用组织研磨仪研磨2 min (30次/s)后, 按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取总DNA[6]。
DNA浓度及纯度检测 分别将提取的DNA使用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测, 用灭菌超纯水作空白对照, 记录DNA的浓度、OD260/280比值及OD260/230比值。
PCR扩增及测序 PCR反应体系25 μL: 2×Taq PCR Mix为12.5 μL, 通用扩增引物ITS5F/ITS4R (2.5 μmol·L-1)各1 μL, DNA模板2 μL, 最后用灭菌超纯水补足至25 μL。PCR扩增程序:预变性94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.5 min+3 s/cycle, 30个循环; 最后延伸72 ℃ 7 min[21]。琼脂糖凝胶电泳:使用1%琼脂糖凝胶进行电泳, 电压140 V, 约30 min。PCR反应产物经纯化后, 使用ABI 3730 XL测序仪进行双向测序。
数据处理 对双向测序峰图采用CodonCode Aligner 7.1.24 (CodonCode Co., USA)进行序列拼接和图谱分析, 去除引物区, 将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统(http://www.tcmbarcode.cn)进行结果判定, 结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种[25]。
TaqMan探针和引物设计 根据冬虫夏草及其混伪品ITS序列, 利用MEGA 7.0软件对上述序列进行比较及一致性分析, 找出冬虫夏草及其混伪品的变异位点。用Primer Premier 6.0软件分析设计引物和探针, 筛选得到针对冬虫夏草的特异性引物探针(表 2)。引物和探针由上海生工生物工程股份有限公司合成, 探针5'端标记荧光基团FAM, 探针3'端标记淬灭基团BHQ1。
实时荧光PCR反应 PCR反应体系为20 μL: 2×MasterMix为10 μL, 正反向引物DXF/DXR (10 μmol·L-1)各0.5 μL, 探针DXP (10 μmol·L-1) 0.5 μL, DNA模板1 μL, 灭菌超纯水补足体积至20 μL。Genesig q16实时荧光PCR反应条件: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃ 10 s~60 ℃ 1 min收集荧光信号, 40个循环。Bio-Rad CFX96实时荧光PCR反应条件: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃ 10 s~60 ℃ 1 min收集荧光信号, 30或50个循环。
实时荧光PCR的灵敏度研究 随机选取1个冬虫夏草基因组DNA用灭菌超纯水10倍稀释成6个梯度, 每个浓度梯度各取1 μL作为模板, 按照实时荧光PCR反应的方法进行灵敏度检测。
实时荧光PCR的特异性研究 以冬虫夏草及其混伪品样本基因组DNA为模板, 包括下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草和新疆虫草, 以冬虫夏草基因组DNA作为阳性对照, 进行实时荧光PCR反应, 分析该方法的特异性。
结果 1 样品DNA质量从100份冬虫夏草及其6种混伪品中成功提取DNA。分光光度法结果显示, 冬虫夏草光密度比OD260/280处于1.83~2.13范围, OD260/230处于1.88~2.30之间, 浓度大多在1 156.1~7 473.1 ng·μL-1之间, 仅有一个样品浓度为730.9 ng·μL-1, 符合后续PCR扩增要求。6种混伪品(包括下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草、新疆虫草)光密度比OD260/280处于1.85~2.11之间, OD260/230处于1.72~2.26之间, DNA浓度在678.8~2 963.3 ng·μL-1之间, 比正品冬虫夏草浓度低。PCR产物凝胶电泳显示, 每个样品都有单一明亮的条带, 片段大约在550 bp。测序数据经处理后, 在中药材DNA条形码鉴定系统进行BLAST比对, 结果显示, ITS序列能够成功鉴定所有样品, 且与形态学鉴定结果一致。
2 实时荧光PCR鉴定的灵敏度研究将选取的1个冬虫夏草基因组DNA (质量浓度为1 552.7 ng·μL-1) 10倍稀释得到6个梯度浓度, 分别为1552.7、155.27、15.527、1.553、0.155、0.016 ng·μL-1, 进行灵敏度研究。图 1A结果显示:在Genesig q16鉴定系统中, 当模板DNA质量浓度为1 552.7~15.527 ng·μL-1时, 3个梯度浓度都出现S型扩增曲线, 获得较强荧光信号, Ct (cycles, Ct)值分别是20、26、32;而当质量浓度为1.553~0.016 ng·μL-1时, 未出现典型扩增曲线。图 1B及表 3结果表明:在Bio-Rad CFX96鉴定系统中, TaqMan探针实时荧光PCR方法具有较佳的线性检测范围, 当DNA质量浓度为0.016 ng·μL-1时, 仍能产生良好的特异性荧光扩增曲线, Ct值最大为38。可见, 该鉴定方法具有较高的灵敏度, 并且Bio-Rad CFX96系统的灵敏度高于Genesig q16系统1 000倍。
图 2鉴定结果显示, TaqMan探针实时荧光PCR方法鉴定冬虫夏草呈典型的阳性反应, Ct值分别在14~20 (图 2A)、17~20 (图 2B)、13~15 (图 2C)、11~14之间(图 2D, 只有一个样品Ct值为19), 呈特异性S型荧光扩增曲线; 鉴定下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草和新疆虫草6种伪品均为典型的阴性反应, 未见特异性荧光扩增曲线, 均未检测到荧光信号增加。两种仪器Genesig q16和Bio-Rad CFX96鉴定结果表明, 本研究所用的引物(DXF/DXR)及探针(DXP)直接针对冬虫夏草检测, 所建立的冬虫夏草TaqMan探针实时荧光PCR方法具有很强的特异性。
根据以上研究, 确定TaqMan探针实时荧光PCR法快速鉴别冬虫夏草的标准流程(图 3), 主要包括待测样品采集、样品基因组DNA提取、TaqMan探针实时荧光PCR反应等步骤, 供其他科研人员和实验人员参考。其中, Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪应用于实验室进行基础科学研究, 而Genesig q16便携式快速分子鉴定系统应用于市场快速鉴定研究。
TaqMan探针实时荧光PCR法由于其灵敏、特异等特点, 自推出以来得到了迅速发展和广泛应用, 现已成为核酸分子检测的核心技术[26], 但在中药材检测领域应用较少, 目前尚无冬虫夏草及其混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草和新疆虫草鉴定研究相关报道。He等[27]针对雨燕属、金丝燕属和其他物种细胞色素b基因的序列进行分析, 设计一对特异靶向雨燕属和金丝燕属物种细胞色素b基因的引物探针, 实现了对燕窝的鉴定, 并指出生物体内线粒体DNA的含量和稳定性高于细胞核DNA, 在使用TaqMan探针法进行物种鉴别时, 可以选择线粒体DNA作为靶标。Wu等[28]采用该技术以常见掺伪动物猪、牛、羊的特异性基因作为引物, 准确鉴别了紫河车及猪、牛、羊物种掺伪样品, 并且3个物种间无交叉反应, 最小检出浓度分别为3.313、3.375、3.281 ng·μL-1。
本研究针对100份冬虫夏草及其混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草和新疆虫草样品, 在特异性引物DXF/DXR、探针DXP及反应条件均相同的情况下, 在Genesig q16和Bio-Rad CFX96两种鉴定系统中, 采用TaqMan探针实时荧光PCR方法进行灵敏度和特异性分子鉴定研究。灵敏度研究结果显示, 两种鉴定系统对冬虫夏草DNA模板的浓度响应不同, Genesig q16系统对冬虫夏草DNA模板的检测下限是15.527 ng·μL-1, 而Bio-Rad CFX96系统的检测下限是0.016 ng·μL-1, 比Genesig q16系统灵敏度高1 000倍, 因此Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪在实验室进行基础性科学研究过程中推荐使用。特异性分子鉴定结果表明, 本研究所设计的冬虫夏草特异性引物DXF/DXR和TaqMan探针DXP分子标记序列, 均只能与正品冬虫夏草样本产生专一性反应, 出现典型S型荧光扩增曲线; 而不与其混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草和新疆虫草产生交叉反应, 由此, 可以将冬虫夏草与其混伪品明显区分, 具有很强的特异性。另外, 鉴于Genesig q16便携式快速分子鉴定系统尺寸小巧, 操作简单, 升降温速度快实验时间短, 可轻松携带, 能够随时随地进行实验, 所以, 在市场需进行快速鉴定研究时推荐使用。
冬虫夏草因资源稀缺, 已成为研究热点。DNA条形码技术基于不同物种遗传信息载体DNA差异性来进行物种鉴别, 具有稳定性高、重复性好的特点, 作为一种物种鉴定的新兴技术, 在多个领域具有重要作用和研究价值[29-32]。ITS是核糖体RNA基因的非转录区, 进化速率较快, 一般用于研究属间、种间甚至居群间等较低分类等级的系统关系, 有研究人员分析该DNA区域同样适用于虫草属的种间鉴别。Xiang等[18]对冬虫夏草、罗伯茨虫草、下垂虫草、蝉花、蛹虫草、古尼虫草等多种混伪虫草进行了DNA条形码分析, 表明它们之间在ITS序列上存在很大差异, 准确鉴定了131份冬虫夏草及其常见近缘伪品样本。Zhang等[2]采用通用引物ITS5F/ITS4R对冬虫夏草及其近缘种提取DNA进行扩增测序后发现, 冬虫夏草ITS1序列种内差异不大, 而与虫草属其他种种间差异较大, 最大种内距离0.039远小于与种间距离0.154;在系统进化树中, 冬虫夏草聚为一支, 可与其他虫草明确区分, Bootstrap值为100%, 达到借助ITS1序列鉴定冬虫夏草及其同属混伪品的目的。Ma等[33]采用在菌物条形码中应用较多的ITS、18S两种核酸序列对冬虫夏草和新疆虫草进行鉴定研究, 对20个样品提取DNA后进行PCR扩增, 发现ITS序列作为冬虫夏草和新疆虫草的条形码较18S序列更为适合, ITS序列的扩增与测序成功率为100%, 能够从种属水平上将青海冬虫夏草和新疆虫草成功鉴别。虽然ITS和ITS1序列可以鉴别冬虫夏草及其混伪品虫草, 但该技术基于DNA序列分析需测序仪等大型仪器, 实验投入大, 周期较长, 且对NCBI等数据库依赖性强。
此外, 基于PCR的分子鉴定技术也被用于冬虫夏草及其混伪品鉴定研究, 通过设计高特异性的引物, 序列经PCR扩增后, 通过琼脂糖凝胶电泳法检测扩增片段的有无, 从而实现鉴别物种的目的。Zhang等[34]根据rDNA中ITS1区序列设计一对特异性引物, 通过PCR反应对虫草样品进行扩增, 并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测, 结果冬虫夏草和部分市售虫草样品能扩增出255 bp大小的目的片段, 而蛹虫草、人工伪制虫草等样品无扩增条带。Liang等[35]以冬虫夏草及其伪品的ITS区作为研究对象, 设计冬虫夏草的特异性引物, 并从DNA提取方法、提取部位、PCR扩增条件等方面进行了考察研究, 建立了冬虫夏草真伪鉴别的PCR检测体系, 该方法只对冬虫夏草样品在162 bp处有单一的扩增条带, 而伪品在相应位置无扩增条带。基于PCR的分子鉴定技术特异性强, 省去了测序分析步骤, 但电泳图谱分辨率和灵敏度都不高, 并且需使用电泳仪及凝胶成像仪等仪器, 推广应用有一定的难度, 仍需要继续研究和改良。
本研究设计了一对针对冬虫夏草的特异性引物DXF/DXR和TaqMan探针DXP, 可以扩增冬虫夏草ITS区独特的130 bp序列, 成功用于冬虫夏草及其混伪品下垂虫草、古尼虫草、蛹虫草、蝉花、凉山虫草、新疆虫草的分子鉴定研究, 精度高、特异性强。因此, 本研究为中药材市场冬虫夏草真伪鉴别提供了一种快速简便、准确有效的技术方法, 使冬虫夏草的现场鉴定成为可能。
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