托品烷生物碱(tropane alkaloids, TAs)是一类具有重要医疗价值的抗胆碱药, 收录入《中国药典》并在临床上大量使用的包括3种:莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。作为一类基础用药, 这3种生物碱广泛应用于镇痛、麻醉、戒毒脱瘾、抗晕动药、改善微循环、治疗农药中毒和帕金森症等, 市场需求巨大^[1]。由于化学合成的高成本和环境污染问题, 目前, 市场上的TAs供应仍主要依赖于从茄科植物中提取。然而在大多数资源植物中, TAs含量偏低, 导致生产成本高, 如颠茄是TAs商业药源, 2015版《中国药典》要求其干草中莨菪碱含量不得低于0.3%, 而野生颠茄中莨菪碱含量大约仅为干重的0.02%~0.17%, 东莨菪碱含量更低, 约为0.01%~0.08%^[2]。开发高TAs含量的新植物资源和利用代谢工程技术提高植物中TAs尤其是东莨菪碱含量是相关领域的研究热点。

植物代谢工程的开展依赖于对代谢产物合成途径的认识和改造。茄科植物中TAs生物合成途经的大体脉络已经清晰(图 1), 其合成起始于鸟氨酸和精氨酸的脱羧, N-甲基腐胺转移酶(PMT)是上游第一个关键酶^[3], 负责催化生成TAs特异的合成前体N-甲基腐胺。莨菪碱6β-羟化酶(H6H)是合成东莨菪碱的最后一个限速酶, 直接催化莨菪碱羟基化生成山莨菪碱和环氧化生成东莨菪碱^[4]。在途径中游存在一个代谢分支点, 分别由两个托品酮还原酶(TR)主导: TRI催化托品酮还原为托品, 为TAs合成提供原料; 而TRII竞争底物托品酮, 将其还原为假托品, 并进一步代谢分流生成无用的代谢产物打碗花精A3。所以, TRI是TAs合成途径中游重要的关键酶基因, 其表达量的高低和酶活性的强弱决定TAs的合成和积累水平, 是研究TAs生物合成的关键靶标^[5]。目前, TRI基因已从7种TAs资源植物中得到了克隆, 并进行了酶活性分析, 包括曼陀罗(D. stramonium)^[6]、天仙子(H. niger)^[7]、三分三(A. acutangulus)^[8]、睡茄(Withania coagulans)^[9]、南非醉茄(Withania somnifera)^[10]、木本曼陀罗(D. arborea)^[11]和铃铛子(A. lurida)^[12]。在颠茄、三分三和铃铛子三种草本资源植物中的研究均表明, 超量表达TRI基因能显著地提高莨菪碱的含量, 同时极大地促进东莨菪碱的积累。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The biosynthetic pathway of tropane alkaloids in Solanaceae

木本曼陀罗是少有的木本TAs资源植物, 之前的研究发现其相比草本资源植物, 生物量大, 东莨菪碱含量高, 是一种有较大开发利用价值的TAs新种质资源^{[11, 13]}。本文作者前期已在木本曼陀罗中鉴定到了一条DaTRI基因, 体外重组酶活力测定表明DaTRI比同属的草本曼陀罗的DsTRI具有更高的底物亲和性和催化效率, 是一个优秀的代谢工程靶标基因^[11]。后续的研究中, 发现每次PCR都能克隆到一条与DaTRI高度相似但又存在显著差异的基因序列。本研究克隆到了这条新的TRI基因, 命名为DaTRI2。对DaTRI2基因进行了详细的生物信息学分析和组织表达分析, 进而进行了大肠杆菌异源重组表达和重组蛋白的酶动力参数测定, 以期在生化和分子水平上为阐明木本曼陀罗中TAs的生物合成奠定基础, 同时为TAs代谢工程提供新的候选靶标。

材料   供试木本曼陀罗为西南大学校园保护植物, 材料的鉴定、采集与处理方法与先前的研究报道^[14]一致。

试剂   总RNA提取试剂盒为RNAsimple Total RNA Kit (TIANGEN), RNA反转录试剂盒为RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa), 高保真Taq DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNA Polimerse (TaKaRa), 质粒提取及胶回收试剂盒为BioSpin Gel Extraction Kit、BioSpin plasmid DNA Extraction Kit (BioFlux), T载体、连接试剂盒、荧光定量相关试剂分别为pMD19-T Vector、DNA Ligation 2.0、PrimeScipt^TM RT-PCR Kit和SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Perfect Real Time) (TaKaRa), 蛋白纯化用Ni柱为ProteinIso^®Ni-NTA Resin (全式金)。本研究所用引物及测序服务由上海英骏生物技术有限公司提供, 所有引物序列见表 1。其他试剂均为分析纯国产试剂。

表1(Table 1)

Table 1 Primers designed for gene cloning, vector construction and real-time PCR detection Primer name Primer sequence (5'-3') Annealing temperature/℃ F-DaTRI2-full CCCATCCCAAAATAGTTG 51 R-DaTRI2-full GTGATGATAATAACAGAGAAC F-qPGK TCGCTCTTGGAGAAGGTTGAC 59.5 R-qPGK CTTGTCCGCAATCACTACATCAG F-q18S CAGATACCGTCCTAGTCTCAAC 57 R-q18S CAGCCTTGCGACCATACTC F-qDaTRI2 CGTGAGAAGCTTATGCAGACTG 58 R-qDaTRI2 CTTCAATAATGGATAAGCAATTTGG F-DaTRI2-pro CGGATCCATGGAAGAATCAAAAGTGTCC 52 R-DaTRI2-pro CGAGCTCGTGATGATAATAACAGAGAAC

Table 1 Primers designed for gene cloning, vector construction and real-time PCR detection

cDNA的合成与DaTRI2基因克隆   以木本曼陀罗的须根为样品, 按RNAsimple Total RNA Kit说明书提取RNA, 用RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒反转录获得第一链互补DNA(cDNA)。根据已鉴定的DaTRI基因序列^[11], 在5′和3′UTR区域设计全长扩增引物F-DaTRI2-full和R-DaTRI2-full, 以获得的cDNA为模板, 用高保真酶进行PCR扩增。产物经电泳检测后, 回收亚克隆入pMD19-T载体, 转化大肠杆菌后送公司测序, 测序结果可发现两条存在较大差异的TRI序列, 一条为之前报道的DaTRI, 另一条命名为DaTRI2。

DaTRI2的生物信息学分析   在InforMax软件包的Vector NTI Suite 8.0软件中进行ORF查找和推导假定的氨基酸序列。在ExPASy Proteomics Server提供的在线工具Protparam中进行DaTRI2编码蛋白的理化性质分析。采用SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构同源比对建模, 并在Weblab ViewerLite40软件中进行编辑。应用BLAST程序检索相似蛋白, 用Clustal W对氨基酸序列进行多重比对, 进而用MEGA NJ法(Bootstrap 1000)构建系统进化树。

DaTRI2的大肠杆菌重组表达和纯化   在DaTRI2基因编码区设计一对全长引物F-DaTRI2-pro和R-DaTRI2-pro, 分别在两条引物5′端引入BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点, 亚克隆入蛋白表达载体pET28a, 然后导入大肠杆菌Rosseta (DE3)中进行诱导表达。菌液二活至OD₆₀₀=0.6~0.8时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol·L^-1, 28 ℃继续诱导培养6 h。超声破碎菌体, 离心获得粗酶液, 按照ProteinIso^®Ni-NTA Resin试剂盒说明进行亲和层析, 收集的DaTRI2蛋白洗脱液用biosharp公司的透析袋(截留分子量为14 000 Da)进行透析除咪唑, 最终获得纯化的DaTRI2蛋白。

DaTRI2的酶动力参数测定   DaTRI2酶活测定采用强玮等的方法^[11], 简单来说, 托品酮还原反应体系为: 1 mL反应液中包含0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH 6.4)、200 μmol·L^-1 NADPH、5 mmol·L^-1 Tropinone和20 μg TRI重组蛋白; 托品氧化反应体系为: 1 mL反应液中包含0.1 mol·L^-1甘氨酸(pH 9.6)、300 μmol·L^-1 NADP⁺、5 mmol·L^-1 Tropine和20 μg TRI重组蛋白, 在HITACHI U-3010紫外分光光度计中检测OD340 nm处吸光度变化。

实时荧光定量PCR (qPCR)   同上方法提取木本曼陀罗的主根、须根、老茎、嫩茎、老叶和嫩叶6个部位的总RNA, 按PrimeScript^®RT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒说明书进行反转录, 得到cDNA第一链作为qPCR模板。使用BIO-RAD IQTM5 Multicolor Real-Time PCR仪, 参照SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Perfect RealTime)试剂盒说明书进行qPCR反应。反应条件及程序同强玮等的报道^[11]。以PGK、18S双基因作为内参, 根据Pfaffl Method方法计算基因的相对表达量。

在DaTRI基因cDNA的5′和3′UTR区域设计全长扩增引物F-DaTRI2-full和R-DaTRI2-full, 以木本曼陀罗须根cDNA为模版, 用高保真酶成功克隆到一条新TRI基因, 该基因全长1 135 bp, 包含69 bp的5′UTR、247 bp的3′UTR和816 bp的编码区序列, 预测编码272个氨基酸。将该基因命名为DaTRI2, GenBank登陆号为MH705164。DaTRI2与DaTRI在核苷酸序列水平上一致性为96.8%, 差异碱基主要集中在编码区和3′UTR, 编码区有24个碱基的差异, 3′UTR有11个碱基的差异, 编码的蛋白质水平上仅有8个氨基酸不同(图 2中天蓝色高亮显示)。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Comparison of tropinone reductase-Ⅰ 2 from D. arborea (DaTRI2) with other known tropinone reductases by multiple sequence alignment. Identical and the conserved amino acids are shown in white on a black or grey background, respectively, and the non-conserved amino acids are shown in black on a white background

DaTRI2蛋白由272个氨基酸组成, 预测分子质量为29.562 9 kD, 理论等电点为pI为6.06。

BLASTp分析表明DaTRI2编码蛋白与其等位基因编码的DaTRI序列一致性最高, 达到97%, 与D. stramonium的TRI序列一致性也较高, 为95%, 其次为W. somnifera (88%)、A. luridus (88%)、A. acutangulus (88%)、H. niger (88%)、W. coagulans (86%), 这些物种的TRIs蛋白均进行了功能鉴定, 蛋白质序列的高度一致暗示DaTRI2也具有相应的托品合成催化功能。DaTRI2具备必需的功能基序和保守氨基酸残基, 包括结合底物NADPH的TGXXXGXG基序、短链脱氢酶SDRs特征性的NNAG基序(TRI属于SDR家族) (图 2中红色高亮)、托品酮还原酶TRs的催化活性四连体基序N-S-Y-K (图 2中绿色高亮) (其中酪氨酸残基对催化活性是必需的)以及与底物托品酮结合的11个保守氨基酸残基(在DsTRI中其位置分别为Val110、His112、Ile159、Ala160、Leu165、Val168、Val203、Leu208、Val209、Ile223和Phe226) (图 2中黄色高亮)。

以曼陀罗的DsTRI晶体结构(1ae1. pdb)为模板, 在SWISS-MODEL Workspace在线分析工具中对DaTRI2进行三维结构同源建模, 结果见图 3。预测的DaTRI2三维结构呈同源二聚体, 在亚基的表面具有一个深的裂口, 构成了底物结合“口袋”, 这是酶与底物托品酮的结合部位。在“口袋”内部, 5个保守的氨基酸残基(His111、Ala160、Val168、Ile223和Phe226)与托品酮分子相互作用使之采取正确的方向与酶分子结合, 从而决定了产物的立体特异性, 该三维结构与预测的DaTRI三维结构基本相同。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Three-dimensional structure of deduced DaTRI2

在NCBI的非冗余蛋白数据库中选取各种TAs资源植物的TRs序列和一些假定的TR或SDR类似蛋白序列, 序列登录号为: D. stramonium TRI (AAA33281.1)、D. stramonium TRI (AIN39992.1)、D. arborea TRI (AIN39993.1)、H. niger TRI (BAA85844.1)、A. acutangulus TRI (ACB71202.1)、A. luridus TRI (AGL76989.1)、W. coagulans TRI (AGB56644.1)、W. somnifera TRI (AGY46257.1)、S. tuberosum TRI (CAC34420.1)、D. stramonium TRII (AAA33282.1)、H. niger TRII (AAB09776.1)、S. tuberosum TRII (CAB52307.1)、A. acutangulus TRII (ACB71203.1)、A. luridus TRII (AGL76990.1)、Dendrobium nobile TRI (AFD23287.1)、Zea mays (ACG34080.1)、Dendrobium nobile TRII (AFD23289.1)、Arabidopsis thaliana (AAM10204.1)和Cochlearia officinalis (CAO02390.1)。采用neighbor-joining法构建DaTRI2的系统进化树(图 4)。DaTRI2与茄科TAs资源植物的TRI聚入Group Ⅰ分支, 并且和Datura属TRI的亲缘关系最近。所有茄科TAs资源植物的TRII聚入另一个Group Ⅱ分支, 而非TAs资源植物的TR类似序列全部归于第三个分支Goup Ⅲ。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Phylogenetic relationship of DaTRI2 with other plant TRs. DaTRI2 was indicated with a black circle. The tree was constructed with maximum likelihood method in MEGA5.0

为了研究DaTRI2的催化功能, 对DaTRI2基因进行了大肠杆菌原核重组表达, 结果如图 5。含150 mmol·L^-1咪唑的洗脱液能有效地洗脱下重组DaTRI2酶蛋白, 在SDS-PAGE胶上, 重组蛋白分子质量接近29.6 kD, 与预测一致。纯化的DaTRI2经透析除盐后用于酶活性测定。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 SDS-PAGE analysis of affinity purified His-tagged recombinant DaTRI2

用不同pH值的缓冲液测定DaTRI2的最适pH值, 结果见图 6。DaTRI2在体外可以催化可逆的氧化还原反应, 还原反应可以将托品酮还原为托品, 为TAs的合成提供前体, 氧化反应则将托品氧化为托品酮, 导致底物积累。对还原反应来说, DaTRI2在酸性和碱性范围内(pH 4.0~pH 10.6)均有催化活性, 其最适pH值为8.0, 而氧化反应只在中性和碱性条件下才能发生, 且最适pH值为9.6。在各自最适pH值下, 氧化活性要显著高于还原活性。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 Effect of pH on catalytic activity of DaTRI2 for both reduction and oxidation reaction of tropinone and tropine, respectively

本研究分别测定了pH 6.4 (细胞生理条件)和pH 9.6两个pH条件下DaTRI2的还原反应和氧化反应酶动力参数(表 2)。酶的氧化反应无论在底物亲和性(K_m值越小, 亲和性越高)、最大反应速度(V_max)和催化常数(K_cat)上, 都要高于还原反应。在碱性条件下, DaTRI2对底物的K_m值为188 μmol·L^-1, 而偏酸条件下, K_m值为210 μmol·L^-1, DaTRI2对托品的亲和性略高于托品酮, 但是对托品的反应速度(V_max值为114)却显著高于托品酮(V_max值为69.6)。综合来看, DaTRI2对托品有很高的氧化反应催化效率(K_cat/K_m值为17 819), 而对托品酮的还原反应催化效率要低45%, K_cat/K_m值仅为9 714。体外的酶活力测定表明DaTRI2是一个有功能的托品酮还原酶, 但其在体内的实际催化方向还要依赖于具体的生理pH条件。

表2(Table 2)

Table 2 Kinetic parameters of DaTRI2 and DaTRI catalyzed reaction Enzyme Substrate pH Assay Vmax/nkat·mg-1 protein Km/μmol·L-1 Kcat/s-1 Kcat/Km/s-1/(mol·L-1)-1 DaTRI2 Tropinone 6.4 69.6±1.2 210.05±7.54 2.04±0.35 9 714 Tropine 9.6 114±3.6 188.03±1.84 3.35±0.11 17 819 DaTRI[11] Tropinone 6.4 88.30±1.81 2.65±0.19 2.93±0.06 1 106 Tropine 9.6 171.62±5.42 560±0.04 5.69±0.18 10 161

Table 2 Kinetic parameters of DaTRI2 and DaTRI catalyzed reaction

采用实时荧光定量PCR技术(qPCR), 18S和PGK双基因作为内参, 检测DaTRI2基因在木本曼陀罗不同组织部位的表达量:在转录水平上, DaTRI2在幼叶中表达量最高, 在须根中其次, 约为幼叶的50%, 主根、幼茎和成熟叶中表达量微弱, 而在成熟茎中几乎检测不到表达(图 7)。

Figure 7

Figure 7

Figure 7 Real time PCR based comparative of the expression of DaTRI2 gene in different tissues of D. arborea

利用植物代谢工程技术是实现植物中有价值次生代谢产物大量获取的最有潜力的方法, 通过对代谢途径的遗传改造或调控机制的遗传修饰, 已经实现了对青蒿^[15]、长春花^[16]、三七^[17]、丹参^[18]和颠茄^[19]等药用植物中目标代谢产物含量的有效提高, 展现出诱人的前景。托品酮还原酶Ⅰ (TRI)是TAs代谢工程中的有效的靶标基因:在颠茄植株中超表达曼陀罗的TRI基因, 莨菪碱含量提高了3倍, 东莨菪碱含量提高了5倍^[20]; 三分三发根中超表达内源TRI基因, 使莨菪碱和东莨菪碱含量分别提高了1.87倍和8倍^[8]; 最新报道在藏药铃铛子发根中超表达弱活性的内源TRI基因, 分别也使莨菪碱和东莨菪碱含量达到了对照的2.9倍和3.2倍^[12]。上述研究中, 不同来源的TRI具有不同的催化效率, 导致对TAs提高的幅度有明显差异, 这一点在以H6H为靶标基因的TAs代谢工程中体现的尤为明显。东莨菪碱是比莨菪碱药用价值和市场需求更高的原料药, H6H可以催化莨菪碱转化为东莨菪碱, 在颠茄发根中超表达内源的PMT (另一靶标基因)和H6H基因, 虽然东莨菪碱含量提高了8倍, 但底物莨菪碱仍有大部分残留^[21], 而在颠茄植株中超表达更高活性的烟草PMT和莨菪H6H基因, 叶中几乎全是东莨菪碱^[19]。因此, 优秀靶标基因的筛选是植物代谢工程成功的关键, 获取高催化效率的TRI基因对TAs代谢工程具有十分重要的意义。

传统的TRI基因来源于各种草本TAs资源植物, 而木本资源植物来源的TRI还没有研究。本实验室近期从木本曼陀罗根中克隆到一条DaTRI基因, 重组蛋白酶活性表明DaTRI比DsTRI具有更高的底物亲和性, 其催化效率是DsTRI的2倍^[11]。本研究进一步发掘木本曼陀罗的功能基因, 又分离到一条新的TRI序列, 命名为DaTRI2。DaTRI2具备功能性TRI所要求的所有保守基序和位点, 包括两个底物结合中心和四连体催化残基; 在序列上与曼陀罗属的TRI高度一致; 预测的DaTRI2三级结构也具备结合底物的“口袋”结构和保守氨基酸残基。这些结果均强烈暗示DaTRI2编码一个有功能的TRI酶蛋白。

为进一步验证DaTRI2的酶催化功能并研究其活性的强弱, 通过大肠杆菌重组表达和亲和层析, 成功获得了纯化的重组DaTRI2蛋白。DaTRI2能催化可逆的托品酮还原反应和托品氧化反应。还原反应的最适pH值为8.0, 这和已报道的草本TRIs最适pH偏酸性不一致(莨菪HnTRI、曼陀罗DsTRI和醉茄WsTRI的最适pH值分别为6.1、6.4和6.7)^[11], 但却和DaTRI和辣根菜CoTRI的相同^[22], 表明不同科属、木本和草本的TRI间存在一定差异。DaTRI2在碱性条件下能够反向催化托品氧化为托品酮, 最适pH值为9.6, 与DsTRI的最适pH=9.9接近。细胞质是偏酸性的环境, TRI在细胞质中参与代谢且DsTRI和DaTRI均是在pH=6.4进行酶动力参数测定, 为便于比较, 本研究也选择pH=6.4作为测定条件。DaTRI2比DaTRI对托品酮具有更高的亲和力(K_m值分别为0.210 mmol·L^-1和2.65 mmol·L^-1), 但最大反应速度要稍低(V_max分别为69.6和88.3), 综合来看, DaTRI2的体外催化效率是DaTRI的8.8倍, 而DaTRI的已报道催化活性要高于DsTRI, 所以DaTRI2是一个更高效的托品酮还原酶蛋白。尽管在氧化反应的最适pH=9.6下, DaTRI2对托品的亲和性和催化效率要高于还原反应, 但在细胞质的生理酸性条件下, 氧化反应不大可能发生, 还原托品酮生成托品才是DaTRI2的催化方向。

在草本的资源植物中, TAs一般在植物的须根中合成, 包括TRI在内的TAs合成途径基因均特异性地在须根中表达^{[6, 7, 12]}。从木本曼陀罗中克隆的第一条DaTRI虽然在须根中表达量最高, 但是在植株其他部位均有不同程度的组成性表达^[11], 本研究中DaTRI2却呈现不同的表达模式, 在幼叶中表达量最高, 须根中其次, 表明在木本曼陀罗中须根并不是TAs合成的唯一部位。有趣的是, DaTRI2的表达模式与本曼陀罗中另一个合成途径基因DaH6H的表达模式非常相似。H6H位于TRI下游, 直接催化东莨菪碱的合成。在草本资源植物中, H6H也是在须根中特异性表达, 而近期报道的DaH6H却主要在叶中表达, 须根中其次^[14], 新近报道的澳洲茄属植物Duboisia myoporoides的DmH6H基因也在叶中表达量最丰富^[23]。这两个基因相似的组织表达模式正好相互印证: TAs在木本曼陀罗中的合成可能是多部位的, 其中最主要的是须根和叶。

根据已有信息来看, DaTRI2可能是DaTRI的等位基因, 两者序列相似性极高, 但组织表达存在较大差异。在药用植物青蒿中, 青蒿素合成途径下游基因cyp71av1 ^[24]和参与调控的转录因子AaWRKY1也存在等位基因^[25]的报道, 这主要是因为栽培青蒿有不同的品种或生态型。木本曼陀罗也存在白花、黄花和红花等不同的品种, 其是否还存在其他活性不同的TAs合成途径基因的等位基因, 还有待后续的研究。

本研究首次在TAs资源植物中克隆到了一条高活性的TRI等位基因DaTRI2, 重组酶动力学测定表明其相比已报道的DaTRI和DsTRI具有更高的催化效率, 结合其下游DaH6H基因的组织表达谱, DaTRI2在幼叶中的高水平表达暗示TAs在木本曼陀罗中的合成不同于草本资源植物, 叶也是重要的TAs合成部位。DaTRI2的克隆为研究木本植物中TAs的生物合成机制奠定了基础, 同时也提供了新的强有效靶标基因。