2018, Vol. 53
肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是指肺动脉压力超过一定界值的一种血流动力学异常状态。患者伴有体乏无力和呼吸困难等主要症状, 不经治疗病程发展较快, 往往发展为右心衰竭进而导致死亡。其特征包括肺血管重构, 血管阻塞引起肺血管阻力(pulmonary vascular resistance, PVR)、肺动脉压力增高和右心室肥厚[1]。目前最有效的治疗方法是药物治疗, 包括前列环素、内皮素-1受体拮抗剂、5型磷酸二酯酶抑制剂等3大类药物。这些药物虽然可以改善病情, 但没有从根本上改善肺血管重构, 且总体而言价格较高, 不能满足长期治疗的需要[2]。
近10余年来, 基因修饰的干细胞治疗显示出巨大潜力。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)等细胞治疗在动物实验中取得了突破性的研究成果[3-5]。越来越多的研究证明, 一些干/祖细胞治疗对于治疗肺动脉高压有一定的效果, 但也有相关研究显示, 特定的干/祖细胞分型会参与发病过程, 诱导肺动脉高压[5]。本文将对当前正在进行的干细胞治疗方案进行介绍, 并根据这些研究方案中存在的不足进行阐述和讨论。
1 EPCsEPCs主要分布在骨髓、脐带和外周血区域, 细胞间尚未形成细胞层, 表面不表达成熟内皮细胞特征标志物, 可通过增殖和分化形成成熟的内皮细胞[6]。目前定义EPCs主要有两种方法:第一种是检测单核细胞的特定表面标记物, 最常用的标记物为CD34+ CD133+ VEGFR2+。但是这种分类方法是否能够代表“真正”EPCs仍存在争议[7]; 第二种是根据外周血分离培养的不同阶段将其分为早期EPCs和晚期EPCs[8]。
最近的研究认为, EPCs是一类肺循环系统中的固有细胞, 可作为标记物鉴定血管的正常功能[9]。由于分离培养方法以及表面标记物没有明确统一的标准, 不同实验针对肺动脉高压患者中外周血EPCs细胞数量测定的结果有一定的差异[10, 11]。此外, 游离的EPCs的迁徙和黏合功能可能受损, 形成正常血管网络的功能有所下降[12]。目前普遍认为EPCs治疗PH的机制主要存在于两个方面: ① EPCs可能参与肺血管重构。在PH大鼠和PH患者中, 由于肺血管微环境的变化, 游离EPCs的功能出现严重损伤, 失去了形成血管的能力。注入正常的EPCs后可显著恢复肺血管的功能; ② EPCs可以通过释放旁分泌因子对肺功能起到保护作用。具有特定分子标志的EPCs能够分泌多种细胞因子, 包括血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胎盘生长因子和粒细胞集落刺激因子等能抑制肺微血管内皮细胞异常增殖和凋亡[13, 14]。
通过移植EPCs修复内皮细胞损伤, 对于预防及治疗PH都具有潜在的价值。近10年内, 研究人员已成功建立了不同的PH动物模型。Long等[14, 15]发现EPCs对野百合碱(monocrotaline, MCT)引起的PH大鼠具有显著的疗效。Zhao等[16]发现骨髓来源的EPCs治疗能够阻止右室收缩压的上升。外周血来源的EPCs也能改善和逆转MCT诱导的PH。注射EPCs甚至能逆转脱氢野百合碱诱导的PH实验狗肺血管的损伤[17]。近年来, 移植基因改造EPCs是治疗PH的新方法。转导携带有肾上腺髓质素基因质粒的EPCs能够改善MCT引起的PH大鼠的心肺功能, 且与单一的EPCs治疗相比, 移植基因改造EPCs能提高患者的生存率[18]。Sun等[19]报道采用西洛他唑、西地那非和自体EPCs移植共同治疗PH大鼠, 其疗效远优于EPCs或西洛他唑/西地那非单一治疗的效果。总体来说, 临床前研究证明了基于EPCs的治疗是一种潜在的干预肺动脉高压进程的方法。
虽然EPCs的治疗在实验动物身上已经取得了巨大的成功, 但是临床治疗的方案还有待完善。Wang等[20]进行了为期12周的临床预试验, 随机抽取数名PH患者分组进行自体EPCs治疗及常规治疗。研究结果表明, EPCs治疗与钙离子阻断剂治疗相比, 患者运动能力和血流动力学均有较好的改善, 但是还有一些心肺参数未达到常规治疗的效果。由于此试验未严格按照随机双盲标准设计, 这一EPCs注射的治疗方法尚未得到领域内的认可。但是最近几年里, 以加拿大渥太华医院Stewart教授为首的的科研团队一直在推进基因改造的EPCs临床研究的进程。Granton等[21]通过注射内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)基因转染的自体EPCs进行靶向治疗。Ⅰ期临床试验(Phacet试验)确定了临床试验的安全细胞剂量, 并针对血液动力学和严重不良反应进行检测, 初步评价了这种基因改造的EPCs对PH患者治疗效果及安全性。Ⅱ期临床试验(Sapphiret试验)招募了来自北美7个不同地区的45个患有严重PH的患者参与, 该项目目前正在进行。采用随机双盲标准筛选患者, 经一个疗程(6个月周期, 分4次注射eNOS基因改造自体早期EPCs)治疗后, 观察患者的6 min步行距离是否能显著提高, 从而为临床Ⅲ期提供研究基础。前不久的第12届国际肺血管研究会议上, Stewart教授针对现有的数据分析了这种基因改造的EPCs相较于未改造的EPCs治疗的优势, 并称该研究项目已得到FDA认证, 具体的数据还未公开发表。将EPCs用于正式的临床治疗需经过更为严格的审核和试验, 但是目前研究已经证明了基于EPCs治疗PH的可行性和潜在应用价值。
2 MSCs在各种类型的干细胞中, MSCs是一类研究最为广泛, 最具有再生医学研究价值的干细胞。MSCs在骨髓、脐带和脂肪组织等多种成熟组织中广泛存在[22]。20世纪60年代后期Friedenstein等[23]首先提出了MSCs的存在。后来, 其他一些学者进一步证明了MSCs具有增殖、自我更新和分化的潜能。MSCs的优势总结为以下5个方面: ① MSCs可以通过多种组织获得; ② MSCs可以迁移到受损组织; ③ MSCs具有分化、增殖潜能; ④ MSCs免疫原性较低, 可以避免移植时发生免疫排斥; ⑤ MSCs治疗伦理学的争议较少[24, 25]。
过去的10年内研究人员对MSCs的趋化性等生理功能进行了深入的研究。MSCs可以选择性地迁移到受损组织, 并分泌抗凋亡、抗炎和促血管生成因子, 如基质细胞衍生因子1 (SDF-1)、TGF-β1、血管内皮生长因子(VEGF)等。MSCs刺激血管生成, 为宿主细胞的恢复建立了一个保护环境, 从而保护甚至挽救受损组织[26, 27]。研究表明, MSCs在心肌梗死、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和肝功能衰竭等多种临床疾病中都具有巨大的治疗潜力[28, 29], 部分国家以及地区已经批准MSCs相关产品的上市[30]。2012年, 新西兰和加拿大首次批准MSC药物上市, 治疗儿童移植物抗宿主病(GVHD)[31]。2015年, Temcell HS注射液成为日本第一个获批的同种异体MSC药物, 用于治疗急性GVHD[32]。这意味着MSC治疗具有较好的应用前景。
相对于其他疾病而言, 目前MSCs应用于治疗PH的研究仍停留在动物实验阶段。使用MSCs治疗MCT诱导的PH大鼠可改善血流动力学, 改善肺血管重构[33]。与EPCs相似, 将MSCs移植与基因修饰相结合可以产生更好的治疗效果。Takemiya等[34]发现基因修饰的MSCs可通过分泌降钙素基因相关肽减轻MCT诱导的PH内皮功能失调。Guo等[35]也报道了移植HGF基因修饰的MSCs到MCT诱导的PH大鼠体内后心肺动力学指数得到显著改善, 优于MSC单一治疗。目前对于MSCs的研究取得了阶段性的结果, 但在治疗PH方面, 与EPCs相比其未知的干预机制成为限制MSCs临床应用的主要因素。
3 多能性干细胞目前用于PH治疗的多能性干细胞主要分为两类——诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)。
3.1 IPSCsIPSCs是一类新发现的具备分化多能性的干细胞。2006年日本研究者通过慢病毒转染的方式将4种转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入小鼠成纤维细胞, 使体细胞重编程产生了性状类似于ESCs的IPSCs[36]。近10余年来, IPSCs技术日渐成熟, 致畸率和稳定性都得到了很大的改善。IPSCs的优势如下: ① IPSCs可大量制备, 过程方便; ②干性较高, 远超过MSCs, 更易于分化得到内皮细胞, 便于后续操作; 2016年, Hayashi等[37]首次成功地利用IPSCs培育出部分角膜、晶体和视网膜, 为后续的临床研究带来了福音。
目前IPSCs已广泛应用于PH发病机制的研究, 例如, 研究人员利用不同PH患者的IPSCs定向分化形成内皮细胞去代替难以获取的内皮细胞进行信号通路研究[38]。Gu等[39]首先得到了来源于3个不同家庭(包括家族性肺动脉高压患者、BMPR2基因突变未发病者以及性别相同的正常人)的IPSCs, 然后定向分化形成内皮细胞。与家族性肺动脉高压患者相比, BMPR2基因突变的未发病者内皮细胞黏附性增强, 生存率大大提高。这一“恢复性”表型是由于BIRC3这个基因的表达上调, 而非BMPR2表达的恢复。这一发现也揭示了家族性肺动脉高压BMPR2信号促进剂的作用机制, 有利于针对性进行临床治疗。Kiskin等[40]完善了患者IPSCs定向分化形成平滑肌细胞的方法, 采用自体IPSCs引入突变的方法排除了不同IPSCs之间生物差异的因素, 可以更好地评估BMPR2突变对于线粒体膜超极化的影响, 完善对PH发病机制的现有认识。
目前IPSCs靶向治疗PH的相关研究仍处于初期阶段, Huang等[41]在MCT诱导的PH大鼠上注入IPSCs后, 减轻了炎症反应, 改善了血管与右心功能, 表明IPSCs具有治疗PH的潜力。不管是动物实验还是临床研究, 如何选择IPSCs的来源, 提高IPSCs的稳定性以及避免成瘤性是当前需要解决的3个核心问题[42, 43]。
3.2 ESCs与IPSCs相似, ESCs也是一类具有完全多能性的干细胞, 可以分化为特定类型的细胞进行细胞治疗, 在再生医学中具有巨大的潜在价值。目前将ESCs应用于临床上依旧存在不同程度的伦理学争议, 但不同国家和地区已展开了人ESCs相关的临床治疗。2017年10月, 美国干细胞公司Asterias Biotherapeutics研究显示, 6名因脊髓损伤而瘫痪的患者接受ESCs移植治疗1年后, 其中4名患者手臂的移动和基本行为能力出现了改善。该实验目前已进行到临床Ⅰ期, 并获得了FDA授予的再生医学先进疗法(RMAT)认定资格[44]。2012年, Schwartz等[45]将人ESCs分化而来的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)移植治疗年龄相关性黄斑变性患者取得了成功, 移植后右眼RPE细胞明显增多, 视力情况趋于稳定。2018年, da Cruz等[46]同样将人ESCs转化成了RPE来治疗年龄相关性黄斑变性患者, 术后最佳矫正视力以及阅读速度逐渐提高, 视力明显改善。
相较于ESCs在其他疾病上的广泛应用, ESCs用于PH治疗的相关研究及报告亟待深入。利用ESCs具有多能性的特征可以解决某些疾病动物模型的局限性。通过基因敲除相关技术改造人的ESCs, 模拟相关疾病模型, 并用于新型药物发现[47]。本课题组采用人胚胎干细胞系(携带荧光报告基因)分化得到的内皮细胞筛选出一种新型哌啶类化合物BMP上调剂1 (BMP upregulator 1, BUR1), 它能够有效地恢复突变细胞的BMPR2信号和功能(利用CRISPR/Cas9技术导致内皮细胞BMPR2+/R899X关键致病突变, 同时通过患者来源的内皮细胞进行药效验证)[48]。在动物实验研究上, 该先导化合物能够平衡花生四烯酸向前列素内环氧化物合成酶2 (prostaglandin endoperoxide synthase 2, PTGS2)的代谢过程, 从而驱动抗炎效果, 有效预防和逆转MCT诱导、Sugen/缺氧诱导的肺动脉高压。小鼠和斑马鱼毒性实验均证明了口服用药的安全性, 药代动力学实验也显示了其稳定性和实用性。这项研究为干细胞靶向治疗的药物研究提供了新思路。
4 总结常规的药物治疗仅能缓解PH患者症状, 而干细胞治疗能够修复或替换受损肺血管结构, 改善心肺功能。目前国内外研究着重于利用EPCs、MSCs、IPSCs、ESCs这几类干(祖)细胞进行PH干预性研究。
大量的动物实验和临床试验证明了EPCs治疗的可行性。一方面, EPCs能够修复心肺组织区域凋亡的内皮细胞, 重新构建血管; 另一方面, EPCs在体内定向分化为成熟的内皮细胞并释放具有保护功能的旁分泌因子, 可以减缓PH进一步恶化。近年来, EPCs结合基因改造以及EPCs与药物联合两种治疗方式已成为干细胞治疗领域一大突破。由于PH的致病机制复杂, 未来研究需要进一步解决以下几点: ①明确EPCs表面特征标志物。过去的研究并未准确地定义EPCs, 找到正确的表面标记物将有助于进一步的探索研究; ② EPCs移植体内的影响以及潜在的机制; ③ EPCs联合辅助治疗的优势; ④基因改造的EPCs的安全性以及稳定性。
MSCs在PH治疗相关研究目前还停留在动物实验研究阶段, 仍有很多问题需要解决。相关研究已经初步证实MSCs能够缓解MCT诱导的大鼠PH, 但是治疗效果不如EPCs移植, 心肺指标并未取得明显的改善。结合之前MSCs治疗慢性阻塞性肺疾病相关研究结果, MCT大鼠治疗效果不理想可能是由于外源性骨髓间充质干细胞抗炎和免疫调节作用相对较低, 不足以改善广泛受损的肺结构[49]。未来的研究中将进一步探索MSCs潜在的治疗机制, 通过选择合理的细胞状态、剂量、给药方法、给药频率为临床试验打下坚实的基础。
多能干细胞在PH的相关研究主要集中于以下几方面:利用患者IPSCs和基因修饰的ESCs定向分化成为内皮细胞, 取代难以从机体获取的内皮细胞进行PH发病机制的研究。虽然IPSCs、ESCs已经被证实对于很多疾病具有显著的疗效, 但是IPSCs的不稳定性、致畸性以及ESCs的伦理学争议直接限制了多能干细胞在PH的临床应用。在PH复杂的病理结构和体内环境下, 目前研究需首要解决的问题是IPSCs、ESCs如何通过定向分化形成特定细胞群, 以阐明重构血管的具体机制。
随着基因修饰以及联合用药技术的日渐成熟, 以干/祖细胞为载体的联合治疗将会为PH患者带来新的希望。
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