药学学报  2018, Vol. 53 Issue (10): 1726-1735   PDF    
促进雷洛昔芬口服吸收的纳米乳处方设计、吸收机制及生物利用度研究
黄传利1, 吴永秋2, 黄蓓2, 杨健峰2, 万君晗1, 张彩凤1, 龙晓英2,3     
1. 广东药科大学药学院, 广东 广州 510006;
2. 广东药科大学中药学院, 广东 广州 510006;
3. 广东药科大学广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心, 广东 广州 510006
摘要: 系统进行口服纳米乳(nanoemulsions,NE)处方设计,并研究其对雷洛昔芬(raloxifene,RAL)口服吸收的影响及吸收机制。考察RAL水溶解度及NE各种辅料成分中的饱和溶解度、油水分配系数[oil-water partition coefficient,P(O/W)],并通过乳化能力确定NE的乳化剂与油的最佳配伍;由伪三元相图确定NE各成分比例,并由载药量确定最终RAL-NE处方;通过测定NE粒径、zeta电位、形态和RAL-NE在模拟胃肠液中的稳定性及包封率等评价其质量。采用MDCK细胞模型对RAL-NE体外跨膜转运及机制进行研究;最后测定RAL-NE的大鼠口服生物利用度。根据其溶解度及P(O/W),RAL可归为BCSⅡ,RAL-NE最佳处方为亚油酸(LOA):棕榈酸异丙酯(IPP):聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40):乙醇=1.67:3.33:3:2,预纳米乳的载药量为15 mg·g-1;RAL-NE包封率为(79.4±0.4)%,在模拟胃肠液中的粒径、zeta电位及药物含量基本保持不变;RAL在MDCK细胞水平的转运机制为网格蛋白介导内吞;RAL-NE相对于RAL混悬剂的口服生物利用度为171.9%,吸收显著提高(P < 0.05)。体内外研究证明,经过系统研究的RAL-NE最佳处方能显著提高RAL的口服吸收。本文为口服NE研究与产品开发提供参考。
关键词: 雷洛昔芬     纳米乳     处方设计     细胞转运     生物利用度    
Formulation design, absorption mechanism and bioavailability of nanoemulsions for enhancing oral absorption of raloxifene
HUANG Chuan-li1, WU Yong-qiu2, HUANG Bei2, YANG Jian-feng2, WAN Jun-han1, ZHANG Cai-feng1, LONG Xiao-ying2,3     
1. School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;
2. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;
3. Guangdong Engineering and Technology Research Center of Topical Precise Drug Delivery System, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
Abstract: Oral formulations of nanoemulsions (NE) were systematically designed, and then their effects on oral absorption of raloxifene (RAL), including their absorption mechanisms were investigated. RAL solubility in water and various excipients of NE and oil-water partition coefficient[P(O/W)] of RAL were examined. Next the optimal compatibility between emulsifiers and oils in NE were ascertained by emulsification ability. Proportions of each component and optimal RAL-NE were fully confirmed by a pseudo-ternary phase diagram and drug loading, respectively. RAL-NE quality was evaluated by particle size, zeta potential, morphology, entrapment efficiency and stability in simulated gastrointestinal fluid. A MDCK cell model was used to study the in vitro transport mechanism of RAL-NE. Oral bioavailability of RAL-NE was eventually performed in SD rats. RAL can be classified as BCSⅡ based on the solubility and P(O/W). The best formulation of RAL-NE was composed of linoleic acid (LOA):isopropyl palmitate (IPP):cremophor RH40 (RH40):alcohol as 1.67:3.33:3:2. Drug loading in pre-nanoemulsion was 15 mg·g-1 andentrapment efficiency of RAL in NE was (79.4 ±0.4)%. The particle size, zeta potential and drug content of RAL-NE were maintained in the simulated gastrointestinal fluid. The in vitro transport mechanism of RAL-NE in MDCK cells was mainly clathrin-mediated endocytosis. The oral bioavailability of RAL in RAL-NE relative to RAL-suspension was 171.9%. The best formulation of RAL-NE studied systematically was confirmed to significantly improve the RAL absorption by in vitro and in vivo evaluations (P < 0.05). This paper provides references for oral NE research and development.
Key words: raloxifene     nanoemulsion     formulation design     transcellular cell migration     bioavailability    

微粒给药系统通过改变药物的理化性质及生物学性质, 为实现更好递送药物的目的, 在新药的研究与开发中一直都受到国内外学者的极大关注。其中, 口服纳米乳(nanoemulsions, NE)具有增加药物溶解度[1]、增强药物胃肠道黏膜渗透性、避免药物在胃肠道的首过代谢、从而达到提高生物利用度的特点[2-4]。同时, NE是由油、乳化剂、助乳化剂和水组成的热力学稳定分散体系, 制备工艺简单、易于大规模生产, 加之口服给药途径顺应性高, 这些优点使NE成为难溶性药物的理想载体和微粒给药系统的研究热点。

近年来, 关于口服NE的研究虽然越来越多, 但NE上市品种比较少, 原因是多方面的。NE稳定性是原因之一, 而奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald ripening coalescence)和合并是导致NE不稳定主要机制[5, 6]。NE进入胃肠道后, NE稳定性还会受到胃肠液pH、酶和胆盐等影响, 使其包裹药物的吸收重复性较差。最后由于药物性质的多样性[水溶解度与P(O/W)等], 导致口服NE的处方随之呈现出多样性的变化, 然而可供选择并能满足安全性、NE成乳能力, 具有较高药物载药率的NE辅料并不多, 因此需要精心设计。

本文以雷洛昔芬(raloxifene, RAL)为模型药物, 根据其本身性质, 对口服NE进行系统性设计, 并对相关的稳定性进行评价; 然后对RAL-NE提高RAL的口服吸收机制及生物利用度进行研究。RAL是第二代选择性雌激素受体调节剂, 对绝经期或绝经后妇女的骨质疏松症疗效显著, 如Jiang等[7]通过RAL对患者进行12个月的治疗, 发现其骨密度有所升高。同时, 具有改善妇女焦虑和惊恐情绪等[8]。然而, 虽然口服后RAL约60%被快速吸收, 但绝对生物利用度仅为2%[9, 10]。本文旨在为口服NE系统性研究与开发提供有价值的参考。

材料与方法

仪器   Zetaszier Nano ZS90粒度仪(英国马尔文仪器有限公司); UV-6100s型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司); TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); RCT basic S025恒温磁力搅拌器(德国IKA仪器设备有限公司); SPH-200B恒温培养摇床(上海世平实验设备有限公司); 倒置显微镜(OLYMPUS公司); 酶联免疫监测仪(西化仪科技有限公司); 120 kV高反差型透射电镜(JEM-1400, 日本电子株式会社); Millicell-ERS电阻测定仪(上海蜀人生物科技有限公司); Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)等。

药品与试剂   RAL (武汉鸿睿康试剂有限公司, 批号: 14RL0410, 纯度 > 99.8%); 柠檬油(lemon oil, LMO, 吉安市国光香料厂); 卵磷脂(phosphatidyl choline, PC, 德国Lipoid公司); 二乙二醇单乙基醚(ethoxydiglycol, Transcutol HP, 法国嘉法狮有限公司); 大豆油(soybean oil, SBO)和棕榈酸异丙酯(isopropyl palmitate, IPP) [阿拉丁试剂(上海)有限公司]; DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(美国GIBCO公司); 制霉菌素(nystatin)、氯丙嗪(chlorpromazine)和阿米洛利(amiloride) (Solarbio公司); 聚氧乙烯氢化蓖麻油(cremophor RH40, RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL, EL35)、泊洛沙姆188 (poloxamer 188, P188)和泊洛沙姆407 (poloxamer 407, P407) (德国巴斯夫有限公司); 1, 2-丙二醇(1, 2-propanediol)、油酸(oleic acid, OA)、亚油酸(linoleic acid, LOA)和无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂); 牛磺脱氧胆酸钠(sodium taurodeoxycholate hydrate, NaTDC, 美国Sigma公司)。其余未标明的试剂都为分析纯或色谱纯。

细胞株与动物  犬肾细胞(MDCK)购置于GIBCO公司。健康雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠, 体重180~220 g, 由中山大学实验动物中心提供[许可证号: SCXK (粤) 2016-0029]。动物分笼饲养于12 h昼夜交替的环境中, 温度约20~24 ℃, 湿度(60 ± 5) %, SPF级条件下适应性饲养1周, 动物福利和实验过程遵循广东药科大学动物伦理委员会的规定。

色谱条件与方法学考察

色谱柱为Phenomenex Kinetex® C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); 流动相:乙腈-20 mmol·L-1醋酸铵(35:65, pH 4.0);流速: 1.0 mL·min-1; 检测波长289 nm; 柱温30 ℃; 进样量10 μL。

分别取空白NE、空白细胞样品和空白血浆, 加入相应浓度的RAL标准溶液, 分别配制如下系列浓度为0.10、0.25、1.0、2.0和3.0 μg·mL-1的NE样品溶液, 0.01、0.02、0.08、0.10和1.00 μg·mL-1细胞样品溶液和0.10、0.20、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00和2.50 μg·mL-1的血浆样品溶液, 按样品处理方法处理后采用HPLC测定, 以RAL峰面积对RAL浓度作线性回归, 建立NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品的标准曲线。NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品中RAL的低、中、高浓度(n = 6)分别为0.1、1、3 μg·mL-1, 0.02、0.1、1 μg·mL-1, 0.2、1、2 μg·mL-1, 并进行精密度、回收率、重复性和稳定性等方法学考察。

RAL紫外含量测定方法  精密吸取RAL标准液适量, 于10 mL量瓶中, 用磷酸盐缓冲液(PBS)、水或乙醇稀释定容, 制定标准溶液, 289 nm处测定吸光度值(A), 绘制标准曲线。配制RAL在PBS (3、7、11 μg·mL-1)、蒸馏水(3、7、11 μg·mL-1)及辅料组成(4、8、12 μg·mL-1)的低、中、高RAL标准溶液(n = 3), 在289 nm处测定A, 重复3次, 按标准曲线计算回收率与日内精密度; 于1周内第1、4、7天的同一时间, 取重新配制的标准溶液进行测定, 重复3次, 计算日间精密度。

RAL在胃肠液不同pH的溶解度及P(O/W)测定  PBS (pH 1.2、5.0和6.8)及蒸馏水于西林瓶中, 加入过量RAL, 超声溶解30 min后, 37 ℃恒温振荡(100 r·min-1) 72 h, 静置后经0.45 μm滤膜过滤, 续滤液分别用相应溶液稀释定容, 紫外分光光度计289 nm处测定A, 并计算RAL在不同上述介质的溶解度。

精密移取RAL正辛醇溶液5.0 mL (30.08 µg·mL-1), 按油水比例为1:3加入正辛醇饱和的各pH值缓冲液及蒸馏水, 于37 ℃水浴恒温振荡(100 r·min-1) 24 h后静置, 精密移取上清液2.0 mL, 乙醇定容至10 mL, 在289 nm处测定A, 并计算RAL在油层中的质量, 按下列公式计算RAL在上述介质中的P(O/W)

$ {P_{\left( {{\rm{O/W}}} \right)}} = {m_油}/{m_水} = {m_油}/({m_总} - {m_油}) $

式中, m为RAL在水饱和正辛醇中的质量, m为RAL在正辛醇饱和水中的质量, m为药物初始加入时的总质量。

RAL在NE成分中的溶解度测定  RAL-NE处方设计选取的油、乳化剂及助乳化剂等辅料见图 1。同上测定RAL溶解度。

n = 6, x±s Figure 1 The solubility of raloxifene (RAL) in water, pre- nanoemulsion and different components of nanoemulsions (NE).

乳化剂与油的配伍性能   将4种乳化剂(RH40、EL35、P407、P188)与5种油(LMO、LOA、IPP、SBO、OA)分别混合均匀, 保持预纳米乳(油与乳化剂)总量1 g, 油含量在5%~90%内的比例逐渐增加、乳化剂则相应减少, 用磁力搅拌器(25 ℃, 1 000 r·min-1)将油与乳化剂充分混合均匀, 然后滴加纯水进行乳化获得5 mL NE。《中国药典》2015版规定NE的粒径在1 000 nm内[11], 但一般认为NE的粒径应为50~200 nm[12-14]。本文以粒径≤100 nm与多分散系数(polydispersity index, PDI) < 0.3为指标, 考察乳化剂与油相互配伍的能力。结合油对药物的溶解度与乳化剂的配伍性能, 加上LOA益于健康[15]的性质, 选择LOA和IPP作为复合油, 并按1:2、1:1和2:1比例, 与乳化剂(EL35和RH40)组合, 通过粒径及PDI进一步考察乳化剂与混合油的最佳组合, 确定NE的油及乳化剂种类。

NE伪三元相图的绘制   根据对RAL溶解度和较强的助乳化能力(数据未显示), 选择乙醇作为助乳化剂; 选择复合油(LOA:IPP = 1:2, v/v)和RH40, 按上述方法制备NE, 并绘制伪三元相图, 确定NE的乳化区域。

RAL-NE最佳处方确定   在保证NE稳定(粒径及PDI)、载药量最大和辅料最低原则的前提下, 于伪三元相图实际乳化区域中, 选取油量较高和乳化剂较低的两种比例, 即混合油:RH40:乙醇的比例分别为5:3:2 (NE 1)和4:4:2 (NE 2), 并测定RAL在最佳处方预纳米乳中的溶解度(图 1), RAL的载药量为15 mg·g-1 (根据RAL在预纳米乳的溶解度及预实验结果, 数据未显示), 以电位、粒径及RAL析出为指标对两种处方进行考察, 确定最佳RAL-NE处方。

RAL-NE粒径、zeta电位与形态测定  测定最佳RAL-NE粒径、PDI和zeta电位; 采用透射电子显微镜观察RAL-NE显微结构。

RAL-NE质量评价

RAL-NE在模拟胃肠液中的稳定性研究  制备含0.2% NaCl和0.7%盐酸的模拟胃液(simulated gastric fluid, SGF, pH 1.2)及含PC (1.25 mmol·L-1)、NaTDC (5.00 mmol·L-1)、150 mmol·L-1 NaCl和50 mmol·L-1 Trizma maleate的模拟肠液(simulated intestinal fluid, SIF, pH 6.8)。6 mL RAL-NE分别用SGF或SIF稀释至50 mL, 37 ℃水浴100 r·min-1搅拌, 并于0、1、2 h或0、2、4、6 h取样, 测RAL-NE在SGF及SIF中的粒径和PDI。当液体变浑浊时, 取样于12 000 r·min-1离心15 min, 上清液经甲醇破乳并过滤后采用HPLC测定RAL含量。

RAL-NE分离考察、包封率和载药率的测定  取充分溶胀后的葡聚糖凝胶填充至注射器并离心, 获得葡聚糖凝胶柱。将RAL溶液100 μL滴于凝胶柱顶端, 持续洗脱至RAL被洗出, 收集洗脱液采用HPLC测定含量。取同体积RAL-NE加入凝胶柱顶端, 1 500 r·min-1离心0.5 min, 获得第1次洗脱液, 其余操作同游离RAL洗脱。根据分离洗脱后RAL-NE中的RAL含量(W)与未分离的RAL-NE中RAL的总量 (W), 由下式计算RAL-NE的包封率(entrapment efficiency, EE, mg·mg-1)和载药率(drug loading, DL, mg·g-1)。其中NE中的辅料总量为WNE辅料量

$ \begin{array}{*{20}{l}} {{\rm{EE }}\left( \% \right) = {W_包}/{W_总} \times 100\% }\\ {{\rm{DL }}\left( \% \right) = {W_包}/({W_{{\rm{NE辅料量}}}} + {W_包}) \times 100\% } \end{array} $

RAL-NE体外细胞跨膜转运及其抑制剂的影响   将MDCK细胞以每毫升3×104个接种于Transwell板(滤膜直径6.5 mm, 孔径0.4 μm), 在肠腔侧(apical side, AP)加入200 μL细胞混悬液, 基底侧(basolateral side, BL)加高糖培养基600 μL作为接收液。37 ℃细胞培养箱中孵育, 当细胞单层模型的电阻值达到180 Ω·cm2[16, 17], 用PBS洗净AP培养基, 分别加入适宜浓度的游离RAL和RAL-NE高糖培养基溶液, 于30、60、90、120、150和180 min分别从BL侧取适量体积的接收液, 经0.22 μm滤膜过滤后采用HPLC测定含量, 按下式计算累积转运量(Q)。

$ Q = {C_n} \cdot {V_1} + \sum\limits_{m - 1}^{n - 1} {{C_m} \cdot {V_2}} $

其中, Cn为第n个时间点所取样品的浓度(μg·mL-1), 为第1至n-1个时间点所取样品浓度之和(μg·mL-1), C0为药物初始浓度(μg·mL-1), V1为药物接收端的体积(mL), V2为各个时间点的取样体积(mL)。

抑制转运实验前分别加入3种抑制剂(阿米洛利100 mmol·L-1、氯丙嗪30 mmol·L-1和制霉菌素30 mmol·L-1); 在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min后用PBS洗净抑制剂, 其余操作同上。

SD大鼠口服生物度实验  健康SD雌性大鼠12只, 随机分成2组。给药前禁食12 h, 自由饮水, 分别灌胃(ig)给予60 mg·kg-1剂量的RAL-NE和RAL混悬剂(0.5%羧甲基纤维素)。给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、12和24 h经眼球后静脉丛取血约0.4 mL, 至含肝素钠的离心管中, 4 000 r·min-1离心15 min分离血浆, 保存在-20 ℃待测。

血浆样品处理   精密吸取血浆样品100 μL, 置1.5 mL离心管, 加入两倍体积乙腈, 涡旋混合2 min, 4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min, 上清液经0.22 µm滤膜过滤后采用HPLC测定含量。

计算及统计学分析  实验结果以平均值±标准差(x±s)表示, CmaxTmax为实测值, AUC0-t由梯形法计算, 相对生物利用度用Fr = (AUC(0-t) NE) / (AUC(0-t) 对照组) × 100%表示。采用SPSS 22.0软件进行统计学数据分析, 参数之间进行单因素方差分析和t检验, 显著性水平设为0.05。

结果 1 RAL含量测定方法学 1.1 RAL-HPLC

NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品的内源性杂质不干扰RAL测定, 且峰型良好, 保留时间分别为8.6、9.2和9.3 min。NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品的标准曲线分别为y = 39 606x + 762.23 (R2 = 1)、y = 43 658x - 24.934 (R2 = 0.999 9)和y = 24 084x - 371.44 (R2 = 0.999 5), RAL在0.10~3.00 μg·mL-1 (质量评价样品)、0.01~1.00 μg·mL-1 (细胞样品)和0.10~2.50 μg·mL-1 (血浆样品)均具有良好的线性关系, 信噪比S/N = 10时定量限为0.10 μg·mL-1。NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品对应的RAL低、中、高浓度(n = 6)的日内、日间RSD均小于0.6%、回收率在96.11%~99.75% (RSD < 2%)、重复性RSD在0.3%~0.4%和稳定性RSD均小于3.0%, 符合样品分析要求。

1.2 RAL紫外分光光度计

3.00~11.00 µg·mL-1 RAL在pH 1.2、5.0和6.8 PBS及蒸馏水中呈良好的线性关系, 标准曲线方程分别为A = 0.062 9C + 0.006 9 (R2 = 0.999 7)、A = 0.063 4C + 0.006 7 (R2 = 0.999 8)、A = 0.063 1C + 0.027 4 (R2 = 0.999 9)及A = 0.060 6C + 0.009 2 (R2 = 0.999 4), RAL低、中、高质量控制浓度的回收率在95%~105%, RSD均 < 2%, 日内、日间RSD均 < 2%, 符合方法学要求。同样, 在2.0~12.0 μg·mL-1内RAL在辅料组成中呈良好的线性关系, 标准曲线为A = 0.063 9C - 0.001 4 (R2 = 0.999 4), 低、中、高质量控制浓度的日内、日间RSD均 < 3%, 回收率在95%~104% (RSD < 3%), 方法学结果均符合实验要求。

2 RAL在胃肠液不同pH溶解度及lgP(O/W)

表 1可知, RAL在不同pH的PBS中平衡溶解度极小, 在pH 1.2~7.12内随pH值的升高而降低。lgP(O/W)在pH 1.2~7.12内却随pH值的升高而升高, 当pH≥5.0时, lgP(O/W) > 1。

Table 1 Solubility and oil-water partition coefficient [P(O/W)] of RAL in water and phosphate buffer solution (PBS) at different pH. n = 3, x±s
3 RAL-NE的处方设计 3.1 RAL在NE成分中饱和溶解度

图 1可见, RAL在预纳米乳、OA、LOA、Transcutol HP、EL35和RH40中的溶解度均较高, 其中在乙醇中最高, 达到90.5 mg·mL-1, 而在其他辅料中的溶解度均较低。

3.2 乳化剂与油的配伍性能

在满足粒径≤100 nm、PDI < 0.3前提下, 同量乳化剂能乳化油量越大, 说明两者配伍能力越强, 结果见图 2。RH40与EL35对IPP乳化能力均明显强于SBO、LOA、LMO和OA; 而P407与P188对5种油的乳化能力均非常弱。结合NE各成分对RAL的溶解度(图 1)及乳化剂与油的配伍性(图 2), 进一步考察RH40、EL35与混合油中LOA和IPP不同比例的配伍性, 结果见图 3。RH40对3种混合油的乳化能力明显强于EL35, 同时LOA和IPP按1:2混合时, RH40对混合油的乳化能力最强, 由此确定为NE的油及乳化剂组成。

n = 6, x±s Figure 2 Emulsification efficiency of surfactants for using various oils.

n = 6, x±s Figure 3 The emulsifying efficiency between RH40 and EL35 with mixed oils.
3.3 伪三元相图

NE满足粒径≤100 nm、PDI < 0.3的区域较大。但只有当乙醇小于20%时(图 4), 24 h内NE未出现药物析出的情况。因此, 实际NE区域内NE未出现药物析出的情况, 实际NE区域为: 0%~20%乙醇、30%~90% RH40和10%~50%混合油相。

Hollow circle represents no drug precipitation from RAL-NE within 24 h. Solid circle represents drug precipitation from RAL-NE within 24 h Figure 4 The pseudo ternary phase diagram of NE.
3.4 RAL-NE最佳处方

图 5显示, NE1粒径大于NE2 (P < 0.05)。载药后(15 mg RAL)与空白NE比较, RAL-NE1的粒径与电位绝对值均有所下降, 但放置后粒径有所增大。而RAL-NE2与空白NE的粒径与电位在0 h与24 h时无明显变化, 但24 h内有药物析出。因此, 确定RAL-NE最佳处方即混合油:RH40:乙醇比例为5 (LOA:IPP = 1:2):3:2。

n = 6, x±s Figure 5 The effects of drug loading on particle sizes and zeta potential of NE.
4 RAL-NE的质量评价 4.1 RAL-NE粒径、zeta电位与形态

RAL-NE粒径为52.9 ± 0.9 nm, zeta电位为-0.09 ± 0.16, PDI为0.09 ± 0.02 (< 0.30), 粒径小且分布均匀。透射电镜结果见图 6, RAL-NE乳滴为分布较均匀的类球形。

Figure 6 Transmission electron microscopy photograph of RAL-NE (×15 000)
4.2 RAL-NE在模拟胃肠液中的稳定性

图 7表明, RAL-NE在SGF 2 h内(PDI < 0.2)和SIF 4 h内的粒径大小及PDI都无明显变化, 溶液体系也无药物析出。同时RAL-NE在SIF加入前、后0和4 h的RAL含量分别为(2.3 ± 0.1)、(2.4 ± 0.2)和(2.1 ± 0.1) mg·mL-1。说明RAL-NE在模拟胃肠液中稳定。

n = 6, x±s Figure 7 The particle size and polydispersity index (PDI) of raloxifene nanoemulsions (RAL-NE) in simulated gastric fluid (SGF) and simulated intestinal fluid (SIF).
4.3 RAL-NE包封率和载药率

游离RAL在微型凝胶柱中洗脱至11次时才被洗出, 而RAL-NE在第4次洗脱时已经被完全洗出。因此, 两者在微型凝胶柱中的分离互不干扰, 测得RAL-NE的包封率为(79 ± 0.4) %, 载药率为(161.7 ± 2.4) %。

5 RAL-NE的MDCK细胞转运 5.1 RAL-NE在MDCK细胞模型的转运

接种后随着培养时间的增加, MDCK细胞模型的跨膜电阻值逐渐增加, 第5天时单位面积跨膜电阻值为398 Ω·cm2 (> 180 Ω·cm2), 连续至第6、7天, 跨膜电阻值趋于稳定, 因此MDCK细胞转运实验的培养时间为5~7天。由图 8A可以看出, 3 h内RAL的MDCK细胞的累积转运量逐渐增加, 但从2 h开始, RAL混悬剂的RAL累积转运量明显高于RAL-NE (P < 0.05)。

n = 6, x±s Figure 8 The cumulative transport volume of RAL-suspension and RAL-NE in MDCK cell monolayer(A), RAL-NE in 2 h after adding inhibitors (B).
5.2 抑制剂对RAL-NE跨膜转运的影响

图 8B可以看出, 与不加抑制剂的RAL-NE比较, 3种抑制剂均导致RAL-NE中RAL累积转运量不同程度降低, 其中氯丙嗪使RAL-NE中RAL累积转运量最低。

6 RAL-NE的大鼠体内口服生物利用度

以RAL混悬剂为对照, 比较RAL-NE口服给药后的血药浓度-时间曲线见图 9。RAL-NE与RAL混悬剂的TmaxCmax、AUC0-24 h分别为(4.0 ± 1.3) h、(0.4 ± 0.9) µg·mL-1、(4.9 ± 0.5) mg·h·L-1及(1.9 ± 0.9) h、(0.4 ± 0.1) µg·mL-1、(2.9 ± 0.8) mg·h·L-1, RAL-NE的Fr为171.9%, RAL-NE显著提高了RAL的口服吸收(P < 0.05)。

n = 6, x±s Figure 9 Plasma concentration-time profiles of raloxifene following peroral administration of RAL-suspension or RAL-NE at 60 mg·kg-1 to rats.
讨论

RAL的平衡溶解度和lgP(O/W)与Lu等[18]报道相一致, 水溶解度与lgP(O/W)随pH变化规律由其自身结构决定。RAL分子结构中含有叔氨基, 具有一定的弱碱性, 低pH有利其成盐而使得溶解度较高, lgP(O/W)则相反。RAL的特殊结构同样可以解释酸性的OA与LOA可提高RAL在油中溶解度。根据溶解度及lgP(O/W), RAL可归为低溶解度、高生物膜渗透的BCSII类。因此, 可采用NE来增加其口服吸收。

RAL在不同NE辅料中的溶解度差异较大。4种乳化剂均为NE常用乳化剂, 与聚氧乙烯蓖麻油类相比, 氧乙烯氧丙烯类乳化剂P407和P188无论对RAL的溶解性还是对所用油的乳化能力均较差, 这可能与这类乳化剂的分子质量大[19, 20]、黏度高有关, 而本文在室温制备NE不利于乳化剂的分散及对RAL的溶解。NE1与NE2的粒径相比具有显著性差异(图 5), 因为NE1中油含量高及表面活性剂含量低, 所以粒径大。有趣的是, 与空白NE1相比, RAL-NE1粒径反而显著降低。一般而言, 在NE处方不变的条件下, 加入药物会撑大油相, 使得粒径增加。这可能是因为弱碱性RAL与弱酸性LOA的电性中和(图 5也显示RAL-NE1的电位绝对值确实降低了), 不仅增加了RAL在油中的溶解度, 而且二者的结合物形成类似于两亲性物质(图 10), 聚集在油水界面起到一定的弱乳化剂的作用, 增强了乳化能力从而使得粒径变小, 这也与24 h后RAL-NE1无药物析出有关。而RAL-NE2含油量较低, 虽然粒径小, 但载药量也低且24 h后有药物析出。放置24 h后NE1粒径稍有增加, 这可能与体系电位值较低、乳滴聚集有关。而NE2在24 h后粒径变小则与RAL析出、乳滴收缩有关。

Figure 10 The schematic diagram of blank-NE and RAL-NE

比较图 3图 4, 未加入助乳化剂时, 乳化剂最大乳化油量仅为30%, 但加入乙醇后乳化区域扩大到油量为50%。根据溶解度结果, 加入乙醇作为助乳化剂, 不仅增加RAL溶解度, 还增加了油与乳化剂的互溶、进一步降低体系黏度及表面张力, 提高了乳化效率。因此, NE中选择合适的助乳化剂也同样很重要。但因为乙醇为水溶性, 如果用量过大, 形成NE后, 由于乙醇分配至水相, 会影响NE稳定性, 包括NE粒径变大、药物析出等, 根据研究结果, 乙醇在预纳米乳中含量低于20%时, RAL-NE最稳定(图 4)。

转运结果表明, RAL-NE在MDCK细胞中可能涉及多种内吞途径的转运, 包括网格蛋白(chlor promazine)、小窝蛋白(nystatin)和巨饱饮(amilo ride), 但主要通过网格蛋白介导的内吞机制, 这与文献[21, 22]报道相一致。粒径小于40 nm的粒子不能产生足够的自由能包裹在细胞膜表面, 从而避免被细胞内吞。而45~76 nm均可能被网格蛋白和小窝介导的内吞作用所内化, 这个双吸收途径可以解释其优越的细胞吸收性能。除此之外, 内吞还与微粒表面电荷有关[23], 这将在今后进行深入研究。

特别值得关注的是, RAL混悬剂的RAL体外细胞累积转运量明显高于RAL-NE, 与体内吸收结果相反, 这也被一些类似微粒的体外转运结果所证明[24, 25]。如雌二醇和孕酮在NE液中的溶解度增加400多倍, 但当使用合成半透膜进行转运实验时, Papp仅为其饱和水溶液的0.8%[26, 27]。Bibi等[28]也发现桂利嗪在预纳米乳中的溶解度增加了约600倍, 但4 h仅有总剂量的0.000 12%桂利嗪透过亲水聚合膜。这些结果可能与体内外转运机制不同有关。在体外模型中, RAL主要是以游离的小分子被动扩散地转运, RAL混悬剂的药物处于饱和溶解状态, 可不断补充游离RAL, 而RAL-NE中药物大多包裹于油滴中, 好比一个大分子, 甚至比多数的大分子更大[29-33], 显然吸收效率较低; 文献[34]报道, 直径每增加0.8 nm将导致50% Papp的降低。然而, NE体内吸收环境与细胞不同。本文已证明NE是通过包吞途径转运。体内模型中, 口服RAL-NE与含油的食物类似, 在胃肠道可能也先要经历胰脂肪酶的脂解, 导致RAL-NE瓦解与破裂而释放药物, 药物也可能以游离形式被吸收; 同时, 淋巴转运途径可能参与脂质制剂中药物转运, 对提高生物利用度也有贡献[35-37]。总之, 药物在整体动物胃肠道的吸收要比体外复杂得多, 是多种因素共同影响的结果。因此, 体外模型预测NE吸收具有局限性。当然, 体外细胞模型也有助于NE的研究, 特别是面对大量候选药物的选择、动物保护等因素使动物实验受限等问题时, 细胞水平的研究是有益的补充, 但NE促进药物吸收的结论应以整体动物为准。

图 9可知, 两者的血药浓度-时间曲线明显不同, RAL-NE比较符合大部分口服药物吸收的血药浓度-时间曲线, 但RAL混悬剂的Tmax持续近10 h, 即出现了一个吸收的平台区, 这主要是RAL在胃肠液中溶解度低, 长时间处于饱和的溶解状态, RAL被吸收的同时也不断从RAL混悬剂的溶解而得到补充, 以至吸收量与消除量相当, 所以相当长时间血药浓度维持不变, 直至RAL混悬剂中的药物全部溶解并被吸收。本文主要是评价NE对RAL吸收的影响, 加之吸收曲线不典型, 因此未做有关药动学模型及参数处理, 仅通过生物利用度参数评价两种剂型中RAL的吸收。相对于RAL混悬剂, 虽然RAL-NE显著提高了RAL的口服吸收, 但吸收增加的程度并不高, 这与RAL本身的性质有关。RAL虽然可归为BCSII类, 然而其溶解度极低、lgP(O/W)也不高, 并不是非常典型的BCSII类, 同时还存在肠壁首过代谢[38]。今后还需通过进一步优化NE以保护RAL不被肠道代谢来进一步提高RAL的吸收。

本文以RAL为模型药物, 对影响其口服吸收的主要理化性质溶解度、油水分配系数进行测定, 明确其BCS分类, 对其在NE成分溶解度测定、乳化剂与油之间的配伍及载药率等确定NE处方, 然后对NE质量、体内外吸收进行了评价。采用NE提高药物的口服吸收, 需要对药物的基本性质包括水溶性、油水分配系数进行测定, 特别是NE处方采用多个指标进行精心设计, 再对吸收的促进评价。本文对采用NE促进难溶性药物的研究开发具有一定意义。

参考文献
[1] Yao J, Zhou JP, Ping QN. Characteristics of nobiletin-loaded nanoemulsion and its in vivo distribution in mice[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2007, 42: 663–668.
[2] Shafiq S, Shakeel F, Talegaonkar S, et al. Development and bioavailability assessment of ramipril nanoemulsion formulation[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2007, 66: 227–243. DOI:10.1016/j.ejpb.2006.10.014
[3] Vyas TK, Shahiwala A, Amiji MM. Improved oral bioavailability and brain transport of saquinavir upon administration in novel nanoemulsion formulations[J]. Int J Pharm, 2008, 347: 93–101. DOI:10.1016/j.ijpharm.2007.06.016
[4] Yu H, Huang Q. Improving the oral bioavailability of curcumin using novel organogel-based nanoemulsions[J]. J Agric Food Chem, 2012, 60: 5373–5379. DOI:10.1021/jf300609p
[5] Taylor P. Ostwald ripening in emulsions[J]. Colloids Surf A, 1995, 99: 175–185. DOI:10.1016/0927-7757(95)03161-6
[6] Capek I. Degradation of kinetically-stable o/w emulsions[J]. Adv Colloid Interface Sci, 2004, 107: 125–155. DOI:10.1016/S0001-8686(03)00115-5
[7] Jiang HY, Wang R, Sun LJ. Effect of raloxifene on postmenopausal osteoporosis[J]. Pract Prev Med (实用预防医学), 2010, 17: 551–552.
[8] Strickler R, Stovall DW, Merritt D, et al. Raloxifene and estrogen effects on quality of life in healthy postmenopausal women:a placebo-controlled randomized trial[J]. Obst Gynecol, 2000, 96: 359–365.
[9] Jeong EJ, Liu Y, Lin H, et al. Species-and disposition model-dependent metabolism of raloxifene in gut and liver:role of UGT1A10[J]. Drug Metab Dispos, 2005, 33: 785–794. DOI:10.1124/dmd.104.001883
[10] Ravi PR, Aditya N, Kathuria H, et al. Lipid nanoparticles for oral delivery of raloxifene:optimization, stability, in vivo evaluation and uptake mechanism[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2014, 87: 114–124. DOI:10.1016/j.ejpb.2013.12.015
[11] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2015) Vol Ⅳ[S]. 2015 ed. Beijing: China Medical Science Press, 370.
[12] Rao J, Mcclements DJ. Formation of flavor oil microemulsions, nanoemulsions and emulsions:influence of composition and preparation method[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59: 5026–5035. DOI:10.1021/jf200094m
[13] Anton N, Vandamme TF. Nano-emulsions and micro-emulsions:clarifications of the critical differences[J]. Pharm Res, 2011, 28: 978–985. DOI:10.1007/s11095-010-0309-1
[14] Lu B. New Drug Formulation and New Technology (药物新剂型与新技术)[M]. Beijing: People's Health Publishing House, 1998: 59-60.
[15] Shepherd J, Packard CJ, Patsch JR, et al. Effects of dietary polyunsaturated and saturated fat on the properties of high density lipoproteins and the metabolism of apolipoprotein A-I[J]. J Clin Invest, 1978, 61: 1582–1592. DOI:10.1172/JCI109078
[16] Khatri P, Shao J. Transport of lipid nano-droplets through MDCK epithelial cell monolayer[J]. Colloids Surf B, 2017, 153: 237–243. DOI:10.1016/j.colsurfb.2017.02.024
[17] Khatri P, Shao J. Impact of digestion on the transport of dextran-loaded self-emulsified nanoemulsion through MDCK epithelial cell monolayer and rat intestines[J]. Int J Pharm, 2018, 536: 353–359. DOI:10.1016/j.ijpharm.2017.12.009
[18] Lu YM, Chen CQ, Yang FP, et al. Determination of equilibrium solubility and apparent oil/water partition coefficient of raloxifene hydrochloride[J]. J Guangdong Pharm Univ (广东药学院学报), 2014, 30: 269–273.
[19] Rowe RC, Sheskey PJ, Weller PJ, et al. Handbook of Pharmaceutical Excipients[M]. 4th ed. London: Pharmaceutical Press, 2003.
[20] Gelderblom H, Verweij J, Nooter K, et al. Cremophor EL:the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation[J]. Eur J Cancer, 2001, 37: 1590–1598. DOI:10.1016/S0959-8049(01)00171-X
[21] Abdelbar HM, El Basset Sanad RA. Endocytic pathways of optimized resveratrol cubosomes capturing into human hepatoma cells[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 93: 561–569. DOI:10.1016/j.biopha.2017.06.093
[22] Bao H, Zhang Q, Xu H, et al. Effects of nanoparticle size on antitumor activity of 10-hydroxycamptothecin-conjugated gold nanoparticles:in vitro and in vivo studies[J]. Int J Nanomedicine, 2016, 11: 929–940.
[23] Sadat SMA, Jahan ST, Haddadi A. Effects of size and surface charge of polymeric nanoparticles on in vitro and in vivo applications[J]. J Biomater Nanobiotechnol, 2016, 7: 91–108.
[24] Zhang Q, He N, Zhang L, et al. The in vitro and in vivo study on self-nanoemulsifying drug delivery system (SNEDDS) based on insulin-phospholipid complex[J]. J Biomater Nanobiotechnol, 2012, 8: 90–97.
[25] Fischer SM, Brandl M, Fricker G. Effect of the non-ionic surfactant Poloxamer 188 on passive permeability of poorly soluble drugs across Caco-2 cell monolayers[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2011, 79: 416–422. DOI:10.1016/j.ejpb.2011.04.010
[26] Land LM, Li P, Bummer PM. Mass transport properties of progesterone and estradiol in model microemulsion formulations[J]. Pharm Res, 2006, 23: 2482–2490. DOI:10.1007/s11095-006-9014-5
[27] Miller JM, Beig A, Krieg BJ, et al. The solubility-permeability interplay:mechanistic modeling and predictive application of the impact of micellar solubilization on intestinal permeation[J]. Mol Pharm, 2011, 8: 1848–1856. DOI:10.1021/mp200181v
[28] Bibi AH, Holm R, Bauerbrandl A. Simultaneous lipolysis/permeation in vitro model, for the estimation of bioavailability of lipid based drug delivery systems[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2017, 117: 300–307. DOI:10.1016/j.ejpb.2017.05.001
[29] Wang S, Chen K, Li L, et al. Binding between proteins and cationic spherical polyelectrolyte brushes:effect of pH, ionic strength, and stoichiometry[J]. Biomacromolecules, 2013, 14: 818–827. DOI:10.1021/bm301865g
[30] Dembczynski R, Jankowski T. Determination of pore diameter and molecular weight cut-off of hydrogel-membrane liquid-core capsules for immunoisolation[J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2001, 12: 1051–1058. DOI:10.1163/156856201753252552
[31] Stadalius MA, Ghrist BFD, Snyder LR. Predicting bandwidth in the high performance liquid chromatographic separation of large biomolecules. Ⅱ. A general model for the four common high-performance liquid chromatography methods[J]. J Chromatogr A, 1987, 387: 21–40. DOI:10.1016/S0021-9673(01)94511-X
[32] Reddy ST, Berk DA, Jain RK, et al. A sensitive in vivo model for quantifying interstitial convective transport of injected macromolecules and nanoparticles[J]. J Appl Physiol, 2006, 101: 1162–1169. DOI:10.1152/japplphysiol.00389.2006
[33] Drisko GL, Cao L, Kimling MC, et al. Pore size and volume effects on the incorporation of polymer into macro-and mesoporous zirconium titanium oxide membranes[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2009, 1: 2893–2901. DOI:10.1021/am9006098
[34] Lane ME, O'Driscoll CM, Corrigan OI. The relationship between rat intestinal permeability and hydrophilic probe size[J]. Pharm Res, 1996, 13: 1554–1558.
[35] Garg B, Beg S, Kaur R, et al. Long-chain triglycerides based self-nanoemulsifying oily formulations (SNEOFs) of darunavir with improved lymphatic targeting potential[J]. J Drug Target, 2018, 26: 252–266. DOI:10.1080/1061186X.2017.1365875
[36] Murota K, Cermak R, Terao J, et al. Influence of fatty acid patterns on the intestinal absorption pathway of quercetin in thoracic lymph duct-cannulated rats[J]. Br J Nutr, 2013, 109: 2147–2153. DOI:10.1017/S0007114512004564
[37] Imada C, Takahashi T, Kuramoto M, et al. Improvement of oral bioavailability of N-251, a novel antimalarial drug, by increasing lymphatic transport with long-chain fatty acid-based self-nanoemulsifying drug delivery system[J]. Pharm Res, 2015, 32: 2595–2608.
[38] Tran TH, Poudel BK, Marasini N, et al. Preparation and evaluation of raloxifene-loaded solid dispersion nanoparticle by spray-drying technique without an organic solvent[J]. Int J Pharm, 2013, 443: 50–57. DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.01.013