2. 广东药科大学中药学院, 广东 广州 510006;
3. 广东药科大学广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心, 广东 广州 510006
2. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;
3. Guangdong Engineering and Technology Research Center of Topical Precise Drug Delivery System, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
微粒给药系统通过改变药物的理化性质及生物学性质, 为实现更好递送药物的目的, 在新药的研究与开发中一直都受到国内外学者的极大关注。其中, 口服纳米乳(nanoemulsions, NE)具有增加药物溶解度[1]、增强药物胃肠道黏膜渗透性、避免药物在胃肠道的首过代谢、从而达到提高生物利用度的特点[2-4]。同时, NE是由油、乳化剂、助乳化剂和水组成的热力学稳定分散体系, 制备工艺简单、易于大规模生产, 加之口服给药途径顺应性高, 这些优点使NE成为难溶性药物的理想载体和微粒给药系统的研究热点。
近年来, 关于口服NE的研究虽然越来越多, 但NE上市品种比较少, 原因是多方面的。NE稳定性是原因之一, 而奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald ripening coalescence)和合并是导致NE不稳定主要机制[5, 6]。NE进入胃肠道后, NE稳定性还会受到胃肠液pH、酶和胆盐等影响, 使其包裹药物的吸收重复性较差。最后由于药物性质的多样性[水溶解度与P(O/W)等], 导致口服NE的处方随之呈现出多样性的变化, 然而可供选择并能满足安全性、NE成乳能力, 具有较高药物载药率的NE辅料并不多, 因此需要精心设计。
本文以雷洛昔芬(raloxifene, RAL)为模型药物, 根据其本身性质, 对口服NE进行系统性设计, 并对相关的稳定性进行评价; 然后对RAL-NE提高RAL的口服吸收机制及生物利用度进行研究。RAL是第二代选择性雌激素受体调节剂, 对绝经期或绝经后妇女的骨质疏松症疗效显著, 如Jiang等[7]通过RAL对患者进行12个月的治疗, 发现其骨密度有所升高。同时, 具有改善妇女焦虑和惊恐情绪等[8]。然而, 虽然口服后RAL约60%被快速吸收, 但绝对生物利用度仅为2%[9, 10]。本文旨在为口服NE系统性研究与开发提供有价值的参考。
材料与方法仪器 Zetaszier Nano ZS90粒度仪(英国马尔文仪器有限公司); UV-6100s型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司); TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); RCT basic S025恒温磁力搅拌器(德国IKA仪器设备有限公司); SPH-200B恒温培养摇床(上海世平实验设备有限公司); 倒置显微镜(OLYMPUS公司); 酶联免疫监测仪(西化仪科技有限公司); 120 kV高反差型透射电镜(JEM-1400, 日本电子株式会社); Millicell-ERS电阻测定仪(上海蜀人生物科技有限公司); Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)等。
药品与试剂 RAL (武汉鸿睿康试剂有限公司, 批号: 14RL0410, 纯度 > 99.8%); 柠檬油(lemon oil, LMO, 吉安市国光香料厂); 卵磷脂(phosphatidyl choline, PC, 德国Lipoid公司); 二乙二醇单乙基醚(ethoxydiglycol, Transcutol HP, 法国嘉法狮有限公司); 大豆油(soybean oil, SBO)和棕榈酸异丙酯(isopropyl palmitate, IPP) [阿拉丁试剂(上海)有限公司]; DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(美国GIBCO公司); 制霉菌素(nystatin)、氯丙嗪(chlorpromazine)和阿米洛利(amiloride) (Solarbio公司); 聚氧乙烯氢化蓖麻油(cremophor RH40, RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL, EL35)、泊洛沙姆188 (poloxamer 188, P188)和泊洛沙姆407 (poloxamer 407, P407) (德国巴斯夫有限公司); 1, 2-丙二醇(1, 2-propanediol)、油酸(oleic acid, OA)、亚油酸(linoleic acid, LOA)和无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂); 牛磺脱氧胆酸钠(sodium taurodeoxycholate hydrate, NaTDC, 美国Sigma公司)。其余未标明的试剂都为分析纯或色谱纯。
细胞株与动物 犬肾细胞(MDCK)购置于GIBCO公司。健康雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠, 体重180~220 g, 由中山大学实验动物中心提供[许可证号: SCXK (粤) 2016-0029]。动物分笼饲养于12 h昼夜交替的环境中, 温度约20~24 ℃, 湿度(60 ± 5) %, SPF级条件下适应性饲养1周, 动物福利和实验过程遵循广东药科大学动物伦理委员会的规定。
色谱条件与方法学考察
色谱柱为Phenomenex Kinetex® C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); 流动相:乙腈-20 mmol·L-1醋酸铵(35:65, pH 4.0);流速: 1.0 mL·min-1; 检测波长289 nm; 柱温30 ℃; 进样量10 μL。
分别取空白NE、空白细胞样品和空白血浆, 加入相应浓度的RAL标准溶液, 分别配制如下系列浓度为0.10、0.25、1.0、2.0和3.0 μg·mL-1的NE样品溶液, 0.01、0.02、0.08、0.10和1.00 μg·mL-1细胞样品溶液和0.10、0.20、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00和2.50 μg·mL-1的血浆样品溶液, 按样品处理方法处理后采用HPLC测定, 以RAL峰面积对RAL浓度作线性回归, 建立NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品的标准曲线。NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品中RAL的低、中、高浓度(n = 6)分别为0.1、1、3 μg·mL-1, 0.02、0.1、1 μg·mL-1, 0.2、1、2 μg·mL-1, 并进行精密度、回收率、重复性和稳定性等方法学考察。
RAL紫外含量测定方法 精密吸取RAL标准液适量, 于10 mL量瓶中, 用磷酸盐缓冲液(PBS)、水或乙醇稀释定容, 制定标准溶液, 289 nm处测定吸光度值(A), 绘制标准曲线。配制RAL在PBS (3、7、11 μg·mL-1)、蒸馏水(3、7、11 μg·mL-1)及辅料组成(4、8、12 μg·mL-1)的低、中、高RAL标准溶液(n = 3), 在289 nm处测定A, 重复3次, 按标准曲线计算回收率与日内精密度; 于1周内第1、4、7天的同一时间, 取重新配制的标准溶液进行测定, 重复3次, 计算日间精密度。
RAL在胃肠液不同pH的溶解度及P(O/W)测定 PBS (pH 1.2、5.0和6.8)及蒸馏水于西林瓶中, 加入过量RAL, 超声溶解30 min后, 37 ℃恒温振荡(100 r·min-1) 72 h, 静置后经0.45 μm滤膜过滤, 续滤液分别用相应溶液稀释定容, 紫外分光光度计289 nm处测定A, 并计算RAL在不同上述介质的溶解度。
精密移取RAL正辛醇溶液5.0 mL (30.08 µg·mL-1), 按油水比例为1:3加入正辛醇饱和的各pH值缓冲液及蒸馏水, 于37 ℃水浴恒温振荡(100 r·min-1) 24 h后静置, 精密移取上清液2.0 mL, 乙醇定容至10 mL, 在289 nm处测定A, 并计算RAL在油层中的质量, 按下列公式计算RAL在上述介质中的P(O/W)。
$ {P_{\left( {{\rm{O/W}}} \right)}} = {m_油}/{m_水} = {m_油}/({m_总} - {m_油}) $ |
式中, m油为RAL在水饱和正辛醇中的质量, m水为RAL在正辛醇饱和水中的质量, m总为药物初始加入时的总质量。
RAL在NE成分中的溶解度测定 RAL-NE处方设计选取的油、乳化剂及助乳化剂等辅料见图 1。同上测定RAL溶解度。
乳化剂与油的配伍性能 将4种乳化剂(RH40、EL35、P407、P188)与5种油(LMO、LOA、IPP、SBO、OA)分别混合均匀, 保持预纳米乳(油与乳化剂)总量1 g, 油含量在5%~90%内的比例逐渐增加、乳化剂则相应减少, 用磁力搅拌器(25 ℃, 1 000 r·min-1)将油与乳化剂充分混合均匀, 然后滴加纯水进行乳化获得5 mL NE。《中国药典》2015版规定NE的粒径在1 000 nm内[11], 但一般认为NE的粒径应为50~200 nm[12-14]。本文以粒径≤100 nm与多分散系数(polydispersity index, PDI) < 0.3为指标, 考察乳化剂与油相互配伍的能力。结合油对药物的溶解度与乳化剂的配伍性能, 加上LOA益于健康[15]的性质, 选择LOA和IPP作为复合油, 并按1:2、1:1和2:1比例, 与乳化剂(EL35和RH40)组合, 通过粒径及PDI进一步考察乳化剂与混合油的最佳组合, 确定NE的油及乳化剂种类。
NE伪三元相图的绘制 根据对RAL溶解度和较强的助乳化能力(数据未显示), 选择乙醇作为助乳化剂; 选择复合油(LOA:IPP = 1:2, v/v)和RH40, 按上述方法制备NE, 并绘制伪三元相图, 确定NE的乳化区域。
RAL-NE最佳处方确定 在保证NE稳定(粒径及PDI)、载药量最大和辅料最低原则的前提下, 于伪三元相图实际乳化区域中, 选取油量较高和乳化剂较低的两种比例, 即混合油:RH40:乙醇的比例分别为5:3:2 (NE 1)和4:4:2 (NE 2), 并测定RAL在最佳处方预纳米乳中的溶解度(图 1), RAL的载药量为15 mg·g-1 (根据RAL在预纳米乳的溶解度及预实验结果, 数据未显示), 以电位、粒径及RAL析出为指标对两种处方进行考察, 确定最佳RAL-NE处方。
RAL-NE粒径、zeta电位与形态测定 测定最佳RAL-NE粒径、PDI和zeta电位; 采用透射电子显微镜观察RAL-NE显微结构。
RAL-NE质量评价
RAL-NE在模拟胃肠液中的稳定性研究 制备含0.2% NaCl和0.7%盐酸的模拟胃液(simulated gastric fluid, SGF, pH 1.2)及含PC (1.25 mmol·L-1)、NaTDC (5.00 mmol·L-1)、150 mmol·L-1 NaCl和50 mmol·L-1 Trizma maleate的模拟肠液(simulated intestinal fluid, SIF, pH 6.8)。6 mL RAL-NE分别用SGF或SIF稀释至50 mL, 37 ℃水浴100 r·min-1搅拌, 并于0、1、2 h或0、2、4、6 h取样, 测RAL-NE在SGF及SIF中的粒径和PDI。当液体变浑浊时, 取样于12 000 r·min-1离心15 min, 上清液经甲醇破乳并过滤后采用HPLC测定RAL含量。
RAL-NE分离考察、包封率和载药率的测定 取充分溶胀后的葡聚糖凝胶填充至注射器并离心, 获得葡聚糖凝胶柱。将RAL溶液100 μL滴于凝胶柱顶端, 持续洗脱至RAL被洗出, 收集洗脱液采用HPLC测定含量。取同体积RAL-NE加入凝胶柱顶端, 1 500 r·min-1离心0.5 min, 获得第1次洗脱液, 其余操作同游离RAL洗脱。根据分离洗脱后RAL-NE中的RAL含量(W包)与未分离的RAL-NE中RAL的总量 (W总), 由下式计算RAL-NE的包封率(entrapment efficiency, EE, mg·mg-1)和载药率(drug loading, DL, mg·g-1)。其中NE中的辅料总量为WNE辅料量。
$ \begin{array}{*{20}{l}} {{\rm{EE }}\left( \% \right) = {W_包}/{W_总} \times 100\% }\\ {{\rm{DL }}\left( \% \right) = {W_包}/({W_{{\rm{NE辅料量}}}} + {W_包}) \times 100\% } \end{array} $ |
RAL-NE体外细胞跨膜转运及其抑制剂的影响 将MDCK细胞以每毫升3×104个接种于Transwell板(滤膜直径6.5 mm, 孔径0.4 μm), 在肠腔侧(apical side, AP)加入200 μL细胞混悬液, 基底侧(basolateral side, BL)加高糖培养基600 μL作为接收液。37 ℃细胞培养箱中孵育, 当细胞单层模型的电阻值达到180 Ω·cm2时[16, 17], 用PBS洗净AP培养基, 分别加入适宜浓度的游离RAL和RAL-NE高糖培养基溶液, 于30、60、90、120、150和180 min分别从BL侧取适量体积的接收液, 经0.22 μm滤膜过滤后采用HPLC测定含量, 按下式计算累积转运量(Q)。
$ Q = {C_n} \cdot {V_1} + \sum\limits_{m - 1}^{n - 1} {{C_m} \cdot {V_2}} $ |
其中, Cn为第n个时间点所取样品的浓度(μg·mL-1), 为第1至n-1个时间点所取样品浓度之和(μg·mL-1), C0为药物初始浓度(μg·mL-1), V1为药物接收端的体积(mL), V2为各个时间点的取样体积(mL)。
抑制转运实验前分别加入3种抑制剂(阿米洛利100 mmol·L-1、氯丙嗪30 mmol·L-1和制霉菌素30 mmol·L-1); 在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min后用PBS洗净抑制剂, 其余操作同上。
SD大鼠口服生物度实验 健康SD雌性大鼠12只, 随机分成2组。给药前禁食12 h, 自由饮水, 分别灌胃(ig)给予60 mg·kg-1剂量的RAL-NE和RAL混悬剂(0.5%羧甲基纤维素)。给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10、12和24 h经眼球后静脉丛取血约0.4 mL, 至含肝素钠的离心管中, 4 000 r·min-1离心15 min分离血浆, 保存在-20 ℃待测。
血浆样品处理 精密吸取血浆样品100 μL, 置1.5 mL离心管, 加入两倍体积乙腈, 涡旋混合2 min, 4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min, 上清液经0.22 µm滤膜过滤后采用HPLC测定含量。
计算及统计学分析 实验结果以平均值±标准差(x±s)表示, Cmax和Tmax为实测值, AUC0-t由梯形法计算, 相对生物利用度用Fr = (AUC(0-t) NE) / (AUC(0-t) 对照组) × 100%表示。采用SPSS 22.0软件进行统计学数据分析, 参数之间进行单因素方差分析和t检验, 显著性水平设为0.05。
结果 1 RAL含量测定方法学 1.1 RAL-HPLCNE质量评价样品、细胞样品和血浆样品的内源性杂质不干扰RAL测定, 且峰型良好, 保留时间分别为8.6、9.2和9.3 min。NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品的标准曲线分别为y = 39 606x + 762.23 (R2 = 1)、y = 43 658x - 24.934 (R2 = 0.999 9)和y = 24 084x - 371.44 (R2 = 0.999 5), RAL在0.10~3.00 μg·mL-1 (质量评价样品)、0.01~1.00 μg·mL-1 (细胞样品)和0.10~2.50 μg·mL-1 (血浆样品)均具有良好的线性关系, 信噪比S/N = 10时定量限为0.10 μg·mL-1。NE质量评价样品、细胞样品和血浆样品对应的RAL低、中、高浓度(n = 6)的日内、日间RSD均小于0.6%、回收率在96.11%~99.75% (RSD < 2%)、重复性RSD在0.3%~0.4%和稳定性RSD均小于3.0%, 符合样品分析要求。
1.2 RAL紫外分光光度计3.00~11.00 µg·mL-1 RAL在pH 1.2、5.0和6.8 PBS及蒸馏水中呈良好的线性关系, 标准曲线方程分别为A = 0.062 9C + 0.006 9 (R2 = 0.999 7)、A = 0.063 4C + 0.006 7 (R2 = 0.999 8)、A = 0.063 1C + 0.027 4 (R2 = 0.999 9)及A = 0.060 6C + 0.009 2 (R2 = 0.999 4), RAL低、中、高质量控制浓度的回收率在95%~105%, RSD均 < 2%, 日内、日间RSD均 < 2%, 符合方法学要求。同样, 在2.0~12.0 μg·mL-1内RAL在辅料组成中呈良好的线性关系, 标准曲线为A = 0.063 9C - 0.001 4 (R2 = 0.999 4), 低、中、高质量控制浓度的日内、日间RSD均 < 3%, 回收率在95%~104% (RSD < 3%), 方法学结果均符合实验要求。
2 RAL在胃肠液不同pH溶解度及lgP(O/W)由表 1可知, RAL在不同pH的PBS中平衡溶解度极小, 在pH 1.2~7.12内随pH值的升高而降低。lgP(O/W)在pH 1.2~7.12内却随pH值的升高而升高, 当pH≥5.0时, lgP(O/W) > 1。
从图 1可见, RAL在预纳米乳、OA、LOA、Transcutol HP、EL35和RH40中的溶解度均较高, 其中在乙醇中最高, 达到90.5 mg·mL-1, 而在其他辅料中的溶解度均较低。
3.2 乳化剂与油的配伍性能在满足粒径≤100 nm、PDI < 0.3前提下, 同量乳化剂能乳化油量越大, 说明两者配伍能力越强, 结果见图 2。RH40与EL35对IPP乳化能力均明显强于SBO、LOA、LMO和OA; 而P407与P188对5种油的乳化能力均非常弱。结合NE各成分对RAL的溶解度(图 1)及乳化剂与油的配伍性(图 2), 进一步考察RH40、EL35与混合油中LOA和IPP不同比例的配伍性, 结果见图 3。RH40对3种混合油的乳化能力明显强于EL35, 同时LOA和IPP按1:2混合时, RH40对混合油的乳化能力最强, 由此确定为NE的油及乳化剂组成。
NE满足粒径≤100 nm、PDI < 0.3的区域较大。但只有当乙醇小于20%时(图 4), 24 h内NE未出现药物析出的情况。因此, 实际NE区域内NE未出现药物析出的情况, 实际NE区域为: 0%~20%乙醇、30%~90% RH40和10%~50%混合油相。
由图 5显示, NE1粒径大于NE2 (P < 0.05)。载药后(15 mg RAL)与空白NE比较, RAL-NE1的粒径与电位绝对值均有所下降, 但放置后粒径有所增大。而RAL-NE2与空白NE的粒径与电位在0 h与24 h时无明显变化, 但24 h内有药物析出。因此, 确定RAL-NE最佳处方即混合油:RH40:乙醇比例为5 (LOA:IPP = 1:2):3:2。
RAL-NE粒径为52.9 ± 0.9 nm, zeta电位为-0.09 ± 0.16, PDI为0.09 ± 0.02 (< 0.30), 粒径小且分布均匀。透射电镜结果见图 6, RAL-NE乳滴为分布较均匀的类球形。
由图 7表明, RAL-NE在SGF 2 h内(PDI < 0.2)和SIF 4 h内的粒径大小及PDI都无明显变化, 溶液体系也无药物析出。同时RAL-NE在SIF加入前、后0和4 h的RAL含量分别为(2.3 ± 0.1)、(2.4 ± 0.2)和(2.1 ± 0.1) mg·mL-1。说明RAL-NE在模拟胃肠液中稳定。
游离RAL在微型凝胶柱中洗脱至11次时才被洗出, 而RAL-NE在第4次洗脱时已经被完全洗出。因此, 两者在微型凝胶柱中的分离互不干扰, 测得RAL-NE的包封率为(79 ± 0.4) %, 载药率为(161.7 ± 2.4) %。
5 RAL-NE的MDCK细胞转运 5.1 RAL-NE在MDCK细胞模型的转运接种后随着培养时间的增加, MDCK细胞模型的跨膜电阻值逐渐增加, 第5天时单位面积跨膜电阻值为398 Ω·cm2 (> 180 Ω·cm2), 连续至第6、7天, 跨膜电阻值趋于稳定, 因此MDCK细胞转运实验的培养时间为5~7天。由图 8A可以看出, 3 h内RAL的MDCK细胞的累积转运量逐渐增加, 但从2 h开始, RAL混悬剂的RAL累积转运量明显高于RAL-NE (P < 0.05)。
由图 8B可以看出, 与不加抑制剂的RAL-NE比较, 3种抑制剂均导致RAL-NE中RAL累积转运量不同程度降低, 其中氯丙嗪使RAL-NE中RAL累积转运量最低。
6 RAL-NE的大鼠体内口服生物利用度以RAL混悬剂为对照, 比较RAL-NE口服给药后的血药浓度-时间曲线见图 9。RAL-NE与RAL混悬剂的Tmax、Cmax、AUC0-24 h分别为(4.0 ± 1.3) h、(0.4 ± 0.9) µg·mL-1、(4.9 ± 0.5) mg·h·L-1及(1.9 ± 0.9) h、(0.4 ± 0.1) µg·mL-1、(2.9 ± 0.8) mg·h·L-1, RAL-NE的Fr为171.9%, RAL-NE显著提高了RAL的口服吸收(P < 0.05)。
RAL的平衡溶解度和lgP(O/W)与Lu等[18]报道相一致, 水溶解度与lgP(O/W)随pH变化规律由其自身结构决定。RAL分子结构中含有叔氨基, 具有一定的弱碱性, 低pH有利其成盐而使得溶解度较高, lgP(O/W)则相反。RAL的特殊结构同样可以解释酸性的OA与LOA可提高RAL在油中溶解度。根据溶解度及lgP(O/W), RAL可归为低溶解度、高生物膜渗透的BCSII类。因此, 可采用NE来增加其口服吸收。
RAL在不同NE辅料中的溶解度差异较大。4种乳化剂均为NE常用乳化剂, 与聚氧乙烯蓖麻油类相比, 氧乙烯氧丙烯类乳化剂P407和P188无论对RAL的溶解性还是对所用油的乳化能力均较差, 这可能与这类乳化剂的分子质量大[19, 20]、黏度高有关, 而本文在室温制备NE不利于乳化剂的分散及对RAL的溶解。NE1与NE2的粒径相比具有显著性差异(图 5), 因为NE1中油含量高及表面活性剂含量低, 所以粒径大。有趣的是, 与空白NE1相比, RAL-NE1粒径反而显著降低。一般而言, 在NE处方不变的条件下, 加入药物会撑大油相, 使得粒径增加。这可能是因为弱碱性RAL与弱酸性LOA的电性中和(图 5也显示RAL-NE1的电位绝对值确实降低了), 不仅增加了RAL在油中的溶解度, 而且二者的结合物形成类似于两亲性物质(图 10), 聚集在油水界面起到一定的弱乳化剂的作用, 增强了乳化能力从而使得粒径变小, 这也与24 h后RAL-NE1无药物析出有关。而RAL-NE2含油量较低, 虽然粒径小, 但载药量也低且24 h后有药物析出。放置24 h后NE1粒径稍有增加, 这可能与体系电位值较低、乳滴聚集有关。而NE2在24 h后粒径变小则与RAL析出、乳滴收缩有关。
比较图 3与图 4, 未加入助乳化剂时, 乳化剂最大乳化油量仅为30%, 但加入乙醇后乳化区域扩大到油量为50%。根据溶解度结果, 加入乙醇作为助乳化剂, 不仅增加RAL溶解度, 还增加了油与乳化剂的互溶、进一步降低体系黏度及表面张力, 提高了乳化效率。因此, NE中选择合适的助乳化剂也同样很重要。但因为乙醇为水溶性, 如果用量过大, 形成NE后, 由于乙醇分配至水相, 会影响NE稳定性, 包括NE粒径变大、药物析出等, 根据研究结果, 乙醇在预纳米乳中含量低于20%时, RAL-NE最稳定(图 4)。
转运结果表明, RAL-NE在MDCK细胞中可能涉及多种内吞途径的转运, 包括网格蛋白(chlor promazine)、小窝蛋白(nystatin)和巨饱饮(amilo ride), 但主要通过网格蛋白介导的内吞机制, 这与文献[21, 22]报道相一致。粒径小于40 nm的粒子不能产生足够的自由能包裹在细胞膜表面, 从而避免被细胞内吞。而45~76 nm均可能被网格蛋白和小窝介导的内吞作用所内化, 这个双吸收途径可以解释其优越的细胞吸收性能。除此之外, 内吞还与微粒表面电荷有关[23], 这将在今后进行深入研究。
特别值得关注的是, RAL混悬剂的RAL体外细胞累积转运量明显高于RAL-NE, 与体内吸收结果相反, 这也被一些类似微粒的体外转运结果所证明[24, 25]。如雌二醇和孕酮在NE液中的溶解度增加400多倍, 但当使用合成半透膜进行转运实验时, Papp仅为其饱和水溶液的0.8%[26, 27]。Bibi等[28]也发现桂利嗪在预纳米乳中的溶解度增加了约600倍, 但4 h仅有总剂量的0.000 12%桂利嗪透过亲水聚合膜。这些结果可能与体内外转运机制不同有关。在体外模型中, RAL主要是以游离的小分子被动扩散地转运, RAL混悬剂的药物处于饱和溶解状态, 可不断补充游离RAL, 而RAL-NE中药物大多包裹于油滴中, 好比一个大分子, 甚至比多数的大分子更大[29-33], 显然吸收效率较低; 文献[34]报道, 直径每增加0.8 nm将导致50% Papp的降低。然而, NE体内吸收环境与细胞不同。本文已证明NE是通过包吞途径转运。体内模型中, 口服RAL-NE与含油的食物类似, 在胃肠道可能也先要经历胰脂肪酶的脂解, 导致RAL-NE瓦解与破裂而释放药物, 药物也可能以游离形式被吸收; 同时, 淋巴转运途径可能参与脂质制剂中药物转运, 对提高生物利用度也有贡献[35-37]。总之, 药物在整体动物胃肠道的吸收要比体外复杂得多, 是多种因素共同影响的结果。因此, 体外模型预测NE吸收具有局限性。当然, 体外细胞模型也有助于NE的研究, 特别是面对大量候选药物的选择、动物保护等因素使动物实验受限等问题时, 细胞水平的研究是有益的补充, 但NE促进药物吸收的结论应以整体动物为准。
从图 9可知, 两者的血药浓度-时间曲线明显不同, RAL-NE比较符合大部分口服药物吸收的血药浓度-时间曲线, 但RAL混悬剂的Tmax持续近10 h, 即出现了一个吸收的平台区, 这主要是RAL在胃肠液中溶解度低, 长时间处于饱和的溶解状态, RAL被吸收的同时也不断从RAL混悬剂的溶解而得到补充, 以至吸收量与消除量相当, 所以相当长时间血药浓度维持不变, 直至RAL混悬剂中的药物全部溶解并被吸收。本文主要是评价NE对RAL吸收的影响, 加之吸收曲线不典型, 因此未做有关药动学模型及参数处理, 仅通过生物利用度参数评价两种剂型中RAL的吸收。相对于RAL混悬剂, 虽然RAL-NE显著提高了RAL的口服吸收, 但吸收增加的程度并不高, 这与RAL本身的性质有关。RAL虽然可归为BCSII类, 然而其溶解度极低、lgP(O/W)也不高, 并不是非常典型的BCSII类, 同时还存在肠壁首过代谢[38]。今后还需通过进一步优化NE以保护RAL不被肠道代谢来进一步提高RAL的吸收。
本文以RAL为模型药物, 对影响其口服吸收的主要理化性质溶解度、油水分配系数进行测定, 明确其BCS分类, 对其在NE成分溶解度测定、乳化剂与油之间的配伍及载药率等确定NE处方, 然后对NE质量、体内外吸收进行了评价。采用NE提高药物的口服吸收, 需要对药物的基本性质包括水溶性、油水分配系数进行测定, 特别是NE处方采用多个指标进行精心设计, 再对吸收的促进评价。本文对采用NE促进难溶性药物的研究开发具有一定意义。
[1] | Yao J, Zhou JP, Ping QN. Characteristics of nobiletin-loaded nanoemulsion and its in vivo distribution in mice[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2007, 42: 663–668. |
[2] | Shafiq S, Shakeel F, Talegaonkar S, et al. Development and bioavailability assessment of ramipril nanoemulsion formulation[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2007, 66: 227–243. DOI:10.1016/j.ejpb.2006.10.014 |
[3] | Vyas TK, Shahiwala A, Amiji MM. Improved oral bioavailability and brain transport of saquinavir upon administration in novel nanoemulsion formulations[J]. Int J Pharm, 2008, 347: 93–101. DOI:10.1016/j.ijpharm.2007.06.016 |
[4] | Yu H, Huang Q. Improving the oral bioavailability of curcumin using novel organogel-based nanoemulsions[J]. J Agric Food Chem, 2012, 60: 5373–5379. DOI:10.1021/jf300609p |
[5] | Taylor P. Ostwald ripening in emulsions[J]. Colloids Surf A, 1995, 99: 175–185. DOI:10.1016/0927-7757(95)03161-6 |
[6] | Capek I. Degradation of kinetically-stable o/w emulsions[J]. Adv Colloid Interface Sci, 2004, 107: 125–155. DOI:10.1016/S0001-8686(03)00115-5 |
[7] | Jiang HY, Wang R, Sun LJ. Effect of raloxifene on postmenopausal osteoporosis[J]. Pract Prev Med (实用预防医学), 2010, 17: 551–552. |
[8] | Strickler R, Stovall DW, Merritt D, et al. Raloxifene and estrogen effects on quality of life in healthy postmenopausal women:a placebo-controlled randomized trial[J]. Obst Gynecol, 2000, 96: 359–365. |
[9] | Jeong EJ, Liu Y, Lin H, et al. Species-and disposition model-dependent metabolism of raloxifene in gut and liver:role of UGT1A10[J]. Drug Metab Dispos, 2005, 33: 785–794. DOI:10.1124/dmd.104.001883 |
[10] | Ravi PR, Aditya N, Kathuria H, et al. Lipid nanoparticles for oral delivery of raloxifene:optimization, stability, in vivo evaluation and uptake mechanism[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2014, 87: 114–124. DOI:10.1016/j.ejpb.2013.12.015 |
[11] | Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2015) Vol Ⅳ[S]. 2015 ed. Beijing: China Medical Science Press, 370. |
[12] | Rao J, Mcclements DJ. Formation of flavor oil microemulsions, nanoemulsions and emulsions:influence of composition and preparation method[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59: 5026–5035. DOI:10.1021/jf200094m |
[13] | Anton N, Vandamme TF. Nano-emulsions and micro-emulsions:clarifications of the critical differences[J]. Pharm Res, 2011, 28: 978–985. DOI:10.1007/s11095-010-0309-1 |
[14] | Lu B. New Drug Formulation and New Technology (药物新剂型与新技术)[M]. Beijing: People's Health Publishing House, 1998: 59-60. |
[15] | Shepherd J, Packard CJ, Patsch JR, et al. Effects of dietary polyunsaturated and saturated fat on the properties of high density lipoproteins and the metabolism of apolipoprotein A-I[J]. J Clin Invest, 1978, 61: 1582–1592. DOI:10.1172/JCI109078 |
[16] | Khatri P, Shao J. Transport of lipid nano-droplets through MDCK epithelial cell monolayer[J]. Colloids Surf B, 2017, 153: 237–243. DOI:10.1016/j.colsurfb.2017.02.024 |
[17] | Khatri P, Shao J. Impact of digestion on the transport of dextran-loaded self-emulsified nanoemulsion through MDCK epithelial cell monolayer and rat intestines[J]. Int J Pharm, 2018, 536: 353–359. DOI:10.1016/j.ijpharm.2017.12.009 |
[18] | Lu YM, Chen CQ, Yang FP, et al. Determination of equilibrium solubility and apparent oil/water partition coefficient of raloxifene hydrochloride[J]. J Guangdong Pharm Univ (广东药学院学报), 2014, 30: 269–273. |
[19] | Rowe RC, Sheskey PJ, Weller PJ, et al. Handbook of Pharmaceutical Excipients[M]. 4th ed. London: Pharmaceutical Press, 2003. |
[20] | Gelderblom H, Verweij J, Nooter K, et al. Cremophor EL:the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation[J]. Eur J Cancer, 2001, 37: 1590–1598. DOI:10.1016/S0959-8049(01)00171-X |
[21] | Abdelbar HM, El Basset Sanad RA. Endocytic pathways of optimized resveratrol cubosomes capturing into human hepatoma cells[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 93: 561–569. DOI:10.1016/j.biopha.2017.06.093 |
[22] | Bao H, Zhang Q, Xu H, et al. Effects of nanoparticle size on antitumor activity of 10-hydroxycamptothecin-conjugated gold nanoparticles:in vitro and in vivo studies[J]. Int J Nanomedicine, 2016, 11: 929–940. |
[23] | Sadat SMA, Jahan ST, Haddadi A. Effects of size and surface charge of polymeric nanoparticles on in vitro and in vivo applications[J]. J Biomater Nanobiotechnol, 2016, 7: 91–108. |
[24] | Zhang Q, He N, Zhang L, et al. The in vitro and in vivo study on self-nanoemulsifying drug delivery system (SNEDDS) based on insulin-phospholipid complex[J]. J Biomater Nanobiotechnol, 2012, 8: 90–97. |
[25] | Fischer SM, Brandl M, Fricker G. Effect of the non-ionic surfactant Poloxamer 188 on passive permeability of poorly soluble drugs across Caco-2 cell monolayers[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2011, 79: 416–422. DOI:10.1016/j.ejpb.2011.04.010 |
[26] | Land LM, Li P, Bummer PM. Mass transport properties of progesterone and estradiol in model microemulsion formulations[J]. Pharm Res, 2006, 23: 2482–2490. DOI:10.1007/s11095-006-9014-5 |
[27] | Miller JM, Beig A, Krieg BJ, et al. The solubility-permeability interplay:mechanistic modeling and predictive application of the impact of micellar solubilization on intestinal permeation[J]. Mol Pharm, 2011, 8: 1848–1856. DOI:10.1021/mp200181v |
[28] | Bibi AH, Holm R, Bauerbrandl A. Simultaneous lipolysis/permeation in vitro model, for the estimation of bioavailability of lipid based drug delivery systems[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2017, 117: 300–307. DOI:10.1016/j.ejpb.2017.05.001 |
[29] | Wang S, Chen K, Li L, et al. Binding between proteins and cationic spherical polyelectrolyte brushes:effect of pH, ionic strength, and stoichiometry[J]. Biomacromolecules, 2013, 14: 818–827. DOI:10.1021/bm301865g |
[30] | Dembczynski R, Jankowski T. Determination of pore diameter and molecular weight cut-off of hydrogel-membrane liquid-core capsules for immunoisolation[J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2001, 12: 1051–1058. DOI:10.1163/156856201753252552 |
[31] | Stadalius MA, Ghrist BFD, Snyder LR. Predicting bandwidth in the high performance liquid chromatographic separation of large biomolecules. Ⅱ. A general model for the four common high-performance liquid chromatography methods[J]. J Chromatogr A, 1987, 387: 21–40. DOI:10.1016/S0021-9673(01)94511-X |
[32] | Reddy ST, Berk DA, Jain RK, et al. A sensitive in vivo model for quantifying interstitial convective transport of injected macromolecules and nanoparticles[J]. J Appl Physiol, 2006, 101: 1162–1169. DOI:10.1152/japplphysiol.00389.2006 |
[33] | Drisko GL, Cao L, Kimling MC, et al. Pore size and volume effects on the incorporation of polymer into macro-and mesoporous zirconium titanium oxide membranes[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2009, 1: 2893–2901. DOI:10.1021/am9006098 |
[34] | Lane ME, O'Driscoll CM, Corrigan OI. The relationship between rat intestinal permeability and hydrophilic probe size[J]. Pharm Res, 1996, 13: 1554–1558. |
[35] | Garg B, Beg S, Kaur R, et al. Long-chain triglycerides based self-nanoemulsifying oily formulations (SNEOFs) of darunavir with improved lymphatic targeting potential[J]. J Drug Target, 2018, 26: 252–266. DOI:10.1080/1061186X.2017.1365875 |
[36] | Murota K, Cermak R, Terao J, et al. Influence of fatty acid patterns on the intestinal absorption pathway of quercetin in thoracic lymph duct-cannulated rats[J]. Br J Nutr, 2013, 109: 2147–2153. DOI:10.1017/S0007114512004564 |
[37] | Imada C, Takahashi T, Kuramoto M, et al. Improvement of oral bioavailability of N-251, a novel antimalarial drug, by increasing lymphatic transport with long-chain fatty acid-based self-nanoemulsifying drug delivery system[J]. Pharm Res, 2015, 32: 2595–2608. |
[38] | Tran TH, Poudel BK, Marasini N, et al. Preparation and evaluation of raloxifene-loaded solid dispersion nanoparticle by spray-drying technique without an organic solvent[J]. Int J Pharm, 2013, 443: 50–57. DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.01.013 |