溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是目前发病机制不明的慢性炎症, 且有终身复发倾向^[1]。患者可出现反复发作的腹泻、黏液脓血便和腹痛, 并可出现结节性红斑、外周关节炎等肠外表现, 给患者带来持久的痛苦^[2]。临床药物应用以控制炎症为主, 其中柳氮磺嘧啶为常用药物^[3], 但是随着临床广泛应用, 逐渐发现这类药物存在较多的不良反应以及部分治疗无效的患者^[4]。目前, UC的临床治疗仍需高效、专一、不良反应少的药物。

N-对氯苯磺酰基-4-氨基水杨酸(N-p-chlorobenzenesulfonyl-4-amino salicylic acid, 缩写为N-p--Cl-Bs-4-ASA, 图 1)是自主合成的化合物, 为5-氨基水杨酸(5-amino salicylic acid, 5-ASA)类似物, 具有5-ASA发挥疗效的活性基团, 目前并没有相关文献报道, 尤其是对UC的作用。葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的UC模型是科研中稳定可靠的临床前模型, 与人类UC在症状和病理中有许多相似之处^{[5, 6]}。因此, 本研究以DSS诱导的小鼠UC模型为基础, 通过对体重变化、精神状态、大便形态(大便是否成形)、肉眼血便、饮食饮水量、炎症因子表达、炎细胞浸润、结肠长度等, 研究N-p--Cl-Bs-4-ASA对小鼠UC的疗效, 为临床药物应用提供参考。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 The chemical structure of N-p-chlorobenzenesulfonyl-4-amino salicylic acid (N-p--Cl-Bs-4-ASA)

N-p-Cl-Bs-4-ASA由济宁医学院自主合成; DSS购自美国MP Biomedicals公司; 福尔马林购自西陇化工股份有限公司; H&E染色试剂由碧云天生物技术研究所购得; 髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)检测试剂购自江苏科晶生物科技有限公司; 小鼠肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素1β (interleukin 1 beta, IL-1β)、白细胞介素6 (interleukin 6, IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白2 (macrophage inflammatory protein 2, MIP-2)的ELISA试剂盒购自江苏科晶生物科技有限公司。

BALB/c小鼠由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[实验动物使用许可证: SCXK (鲁) 2014-0007]。周龄6~8周, 体质量18~22 g, 饲养室内保持适宜的温度和湿度, 并建立正常昼夜节律以维持小鼠正常生理活动。所有小鼠在实验开始前均适应性饲养1周。

702型超低温冰箱购自美国Thermo Electron公司; LD4-2普通离心机购自北京医用离心机厂; 电子天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司; DGX-9003型鼓风干燥箱购自上海福玛实验设备有限公司; 电光分析天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司; Research型单道可调移液器、5417R型台式冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司; Varioskan全波长酶标仪购自美国Thermo公司。光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

N-p-Cl-Bs-4-ASA给药组分为高、中、低剂量组。高、中剂量组(40、20 mg·kg^-1)给药配制方法如下:取20和10 mg分别溶于生理盐水5 mL中, 即为药物的工作浓度4、2 mg·mL^-1。低剂量组(10 mg·kg^-1)给药配制方法如下:取10 mg溶于生理盐水10 mL中, 即为药物的工作浓度1 mg·mL^-1。5-ASA组(40 mg·kg^-1)配制方法如下:取20 mg溶于生理盐水5 mL中, 即为药物的工作浓度4 mg·mL^-1。给药组每只小鼠灌胃量0.2 mL。

60只健康雌性小鼠, 随机分为6组:空白组、DSS模型组、N-p-Cl-Bs-4-ASA高、中、低剂量给药组(40、20、10 mg·kg^-1)和5-ASA组(40 mg·kg^-1), 每组10只。小鼠自由饮用DSS溶液7天后更换为正常饮用水3天, 建立急性结肠炎小鼠模型^[5-7]。空白对照组10天均给予正常饮用水。建立模型的第1天至第10天, 高、中、低剂量组和5-ASA组以灌胃的方法给予0.2 mL溶液。第11天小鼠取血后, 处死所有小鼠, 摘取重要脏器(心、肝、肺、肾)及结肠组织。称重脏器并记录数据, 并通过HE染色对各组小鼠的重要脏器和结肠组织进行病理学评分, 观察其病理变化^{[7, 8]}。分离结肠, 精确测量结肠长度并记录, 对比各组别结肠长度并拍照记录。实验期间所有小鼠均可自由获得食物及水。

实验期间每天同一时段观察并记录小鼠的活动状况、毛发光泽、饮食饮水情况, 观察小鼠精神状态(好、一般、差), 对小鼠进行称重, 观察记录小鼠大便情况(大便的形态)和肉眼血便情况。汇总每组小鼠的体质量下降百分比、粪便性状及血便为评价标准处理成疾病活动指数(disease activity index, DAI), 依次进行评分, 评分公式“疾病活动指数= (体质量评分+粪便性状评分+隐血评分)/10”评分标准见表 1。

表1(Table 1)

Table 1 Scoring method of disease activity index. Stool property: normal (0 points): forming stool; loose stool (2 points): a mushy, semi-formed stool which not attached to the anus; diarrhea (4 points): a watery stool which adhered to the anus Scoring Weight loss/% Stool property Bloody stool 0 None Normal Negative 1 1-5 - - 2 5-10 Loose stool Fecal occult blood 3 10-15 - - 4 > 15 Diarrhea Bloody naked eye

Table 1 Scoring method of disease activity index. Stool property: normal (0 points): forming stool; loose stool (2 points): a mushy, semi-formed stool which not attached to the anus; diarrhea (4 points): a watery stool which adhered to the anus

将重要脏器(心、肝、肺、肾)和结肠样本置于10%福尔马林溶液固定, 固定后以浓度梯度酒精脱水, 继续处理组织块置于二甲苯中替换出组织中酒精。透明后浸蜡包埋切片。将切下的薄片置于60 ℃烘箱中直至切片的石蜡呈液体状。二甲苯重复脱蜡2次, 每次均使用新配二甲苯。脱蜡后将切片依次放入无水乙醇5 min, 90%乙醇2 min, 70%乙醇2 min, 蒸馏水2 min中浸泡处理。随后用苏木素染色液染色10 min。PBS缓冲液洗涤10 min, 蒸馏水继续清洗10 min。随后将样品切片置于70%乙醇中脱水2 min, 换新配90%乙醇, 再次脱水2 min。伊红染色30 s。染色后无水乙醇脱水, 二甲苯中浸泡5 min, 换新配二甲苯, 再次浸泡5 min使切片透明, 封片剂封片, 显微镜下观察。

小鼠取血, 静置30 min, 并离心10 min, 移液枪收集上层血清进行ELISA检测。每次取样时均更换枪头。实验步骤包括加样、洗涤、加入酶标抗体、辣根过氧化酶标记的亲和素酶并孵化洗涤, 最后加入酶反应底物、显色液和终止液, 用波长450 nm检测各组吸光度。

实验数据分析处理平行操作3次, 结果以x±s表示, one-way ANOVA检验各组间差异, P < 0.05显示有统计学差异。

实验进行中发现, 空白组小鼠体重持续增长, 饮食饮水正常, 精神状态佳, 活动频繁, 粪便形态未见明显异常; DSS模型组小鼠体重明显下降, 饮食少, 食欲差, 精神状态萎靡, 不喜活动, 毛发灰暗无光泽, 出现腹泻、肉眼血便、脓便等症状, 出现早且严重; 给药组小鼠稀便和血便情况明显减少, 与DSS模型组小鼠相比各项症状得到明显改善。如图 2所示, 相比于DSS模型组, 给予N-p-Cl-Bs-4-ASA (40 mg·kg^-1)后, 小鼠体重开始逐渐回升。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Body weight changes of each group after DSS induction of ulcerative colitis. n = 10, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal mice; ##P < 0.01 vs DSS-treated ulcerative colitis mice. DSS: Dextran sodium sulfate; 5-ASA: 5-Amino salicylic acid

解剖后发现, 模型组较空白组结肠长度明显减少, 而给药组小鼠结肠长度较模型组明显增加(低剂量组P < 0.05;中、高剂量组P < 0.01), 如图 3。对结肠组织的HE染色(图 4)显示, DSS模型组小鼠结肠黏膜层出现重度炎症细胞浸润, 局部出现不同程度的坏死, 坏死处已有成纤维细胞增生, 黏膜肌层组织出现炎症细胞浸润; 低剂量给药组(10 mg·kg^-1)小鼠黏膜层慢性炎症并伴有坏死, 嗜酸性粒细胞浸润, 局部泡沫样组织细胞聚集, 药效不明显; 中剂量给药组(20 mg·kg^-1)小鼠黏膜层中度炎症伴少量坏死, 少量嗜酸性粒细胞浸润, 局灶泡沫样组织细胞聚集, 情况略有改善; 高剂量给药组(40 mg·kg^-1)小鼠结肠黏膜结构基本恢复正常, 上皮结构较完整, 少量炎症细胞浸润, 情况明显好转。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 Macroscopic appearances (A) and the lengths (B) of colons from each group of mice were measured. n = 10, x±s. **P < 0.01 vs normal mice; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs the DSS- treated ulcerative colitis mice

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Serial sections of colon tissues were stained with hematoxylin and eosin (HE)

炎症因子在UC的进程与转归中起着重要作用^{[9, 10]}, 通过ELISA实验检测发现N-p-Cl-Bs-4-ASA (40 mg·kg^-1)显著降低血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量(图 5)。

Figure 5

Figure 5

Figure 5 The production of inflammation-related cytokine IL-1β (A), TNF-α (B) and IL-6 (C) in serum were determined by ELISA. n = 10, x±s. **P < 0.01 vs normal mice; ##P < 0.01 vs DSS-treated ulcerative colitis mice. TNF-α: Tumor necrosis factor alpha; IL-1β: Interleukin 1 beta; IL-6: Interleukin 6

如前所述, HE染色观察结肠组织病理发现, 给药组小鼠结肠组织只有少量炎症细胞浸润, 进一步检测血清中MIP-2和MPO水平, 结果显示N-p-Cl- Bs-4-ASA (40 mg·kg^-1)显著降低MIP-2和MPO水平。MIP-2水平显示巨噬细胞的数量^[11], MPO是中性粒细胞的功能标志^[12], 证实N-p-Cl-Bs-4-ASA减少DSS诱导的UC小鼠的炎症细胞浸润(图 6)。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 The production of MIP-2 (A) and MPO (B) in serum were determined by ELISA. n = 10, x±s. **P < 0.01 vs normal mice; ##P < 0.01 vs DSS-treated ulcerative colitis mice. MIP-2: Macrophage inflammatory protein 2; MPO: Myeloperoxidase

解剖小鼠后对小鼠重要脏器称量, 给药组(10、20、40 mg·kg^-1)与空白组无明显差异(图 7)。HE染色后镜下观察发现, 给药组(40 mg·kg^-1)小鼠心、肝、肺、肾并没有明显病变(图 8)。

Figure 7

Figure 7

Figure 7 The weight changes of main organs (A, heart; B, liver; C, lung; D, kidney) during the colitis process. n = 10, x±s

Figure 8

Figure 8

Figure 8 Serial sections of main organs tissues (A, heart; B, liver; C, kidney; D, lung) were stained with HE

本研究选用DSS诱导的UC动物模型进行实验, 并对模型组和给药组小鼠进行症状评分, 结果显示DSS模型组小鼠结肠组织损伤情况均比空白组严重, 证明建模成功。DSS模型组小鼠出现不同程度体重下降, 粪便不成形和血便, 而中、高剂量给药组症状明显改善。病理分析发现, DSS模型组小鼠结肠黏膜层出现重度炎症细胞浸润, 局部出现不同程度的坏死, 坏死处已有成纤维细胞增生, 黏膜肌层组织出现炎症细胞浸润; 低剂量给药组(10 mg·kg^-1)小鼠黏膜层慢性炎症并伴有坏死, 嗜酸性粒细胞浸润, 局部泡沫样组织细胞聚集, 药效不明显; 中剂量给药组(20 mg·kg^-1)小鼠黏膜层中度炎症伴少量坏死, 少量嗜酸性粒细胞浸润, 局灶泡沫样组织细胞聚集, 情况略有改善; 高剂量给药组(40 mg·kg^-1)小鼠结肠黏膜结构基本恢复正常, 上皮结构较完整, 少量炎症细胞浸润, 情况明显好转。5-ASA组(40 mg·kg^-1)结肠病变改善程度与中剂量组(20 mg·kg^-1)相似。血清ELSA检测发现, 5-ASA组与给药组均能显著降低炎症因子表达水平。结果表明, N-p-Cl-Bs-4-ASA对UC小鼠有改善症状、减轻炎症、保护体重的作用, 与5-ASA作用类似或优于5ASA。

近年来, 出现了很多治疗UC的生物制品, 如抗TNF-α单克隆抗体(英夫利昔单抗和阿达木单抗), 但是治疗中度到重度炎症性肠病仍以氨基水杨酸盐为主要选择。其中包括柳氮磺吡啶(salazosulfapyridine, SASP)和5-ASA等^[13]。SASP可能的作用机制包括抑制局部和全身的炎症反应、抑制免疫反应及清除氧自由基等^[13]。5-ASA作为SASP的替代药品, 已开发很久并广泛用于临床, 可以有效缓解UC的发生发展、预防复发和降低癌症风险^{[14, 15]}。目前研究认为, UC的发病与肠黏膜免疫紊乱和细胞因子网格紊乱有密切联系, 5-ASA通过调节促炎因子和抗炎因子平衡发挥疗效^[16]。5-ASA作为花生四烯酸潜在的抑制剂, 减少花生四烯酸和前列腺素的合成, 其也被认为是自由基的清道夫^{[13, 17, 18]}。有文献报道, 5-ASA能够抑制炎症细胞中NO和IL-6的产生, 降低iNOS的表达, 这些抗炎效应可能是由于抑制JNK和p38的磷酸化而不是NF-κB通路的激活^[13]。本文采用的药物N-p-Cl-Bs-4-ASA为4-aminosalicylic acid (4-ASA)的类似物。4-ASA不仅对抗结核有确切的药效, 在UC的治疗中也有很好的效果^{[13, 19, 20]}, 这与本文的结果相符。4-ASA不同于5-ASA, 它不能抑制花生四烯酸的脂肪氧化作用, 对于自由基的清除也没有作用, 但是能够抑制NF-κB通路的激活^[21]。综上所述, 下一步本课题组将着重探讨N-p-Cl-Bs-4-ASA的作用机制以及与5-ASA作用机制的异同点, 研究寻找用药前后炎症因子水平变化的证据, 探讨N-p-Cl-Bs-4-ASA的代谢、适合血药浓度和临床应用的可能。UC的病因与发病机制研究不明, 给临床治愈和缓解症状带来极大的困难, 寻找新的治疗药物是医务工作者的任务和挑战, N-p-Cl-Bs-4-ASA在本次动物实验中取得满意疗效, 并且未出现明显组织损伤和毒副作用, 给寻找、合成安全有效的抗UC药物提供新的方向。