2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700;
3. 北京中医药大学图书馆, 北京 100029
2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China;
3. Library of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性滑膜炎并侵蚀软骨、最终导致骨与关节破坏为特征的世界难治性自身免疫性疾病, 具有发病率和致残率高的特点[1, 2]。目前, 治疗RA的主要药物包括改善病情的抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs)、非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、糖皮质激素(glucocorticoid, GC)、生物制剂如TNF抑制剂、抗IL-6受体抗体等以及靶向小分子药物[3]。临床研究表明, 上述药物虽具有缓解疼痛、抑制疾病活动、预防关节损伤和减缓疾病发展的作用[4], 但会产生一定的毒副作用[5, 6]。
素以整体观念、辨证论治为指导的中医药, 因具有药效持久、毒副作用少、复发率低等特点和优势而备受重视。根据中医理论, RA属于“痹症”的范畴, 机体正气不足, 风、寒、湿等外邪侵入人体而诱发疾病[7]。临床上张仲景《金匮要略》中多个经典方剂对RA均有效[8], 鉴于寒、热证是RA主要证型[9], 乌头汤和白虎加桂枝汤分别为治寒痹、热痹代表方, 且临床治疗RA疗效确切[10, 11], 因此, 本研究以二者为研究对象进行对比研究。其中乌头汤, 由制川乌、麻黄、黄芪、芍药及甘草组成, 具有温阳散寒、除湿止痛, 并兼通达经络之效[12, 13]。白虎加桂枝汤, 由石膏、知母、桂枝、粳米和甘草组成, 具有清热泻火、通络止痛之功效[14]。目前, 已有关于乌头汤和白虎加桂枝汤治疗RA的临床疗效[8]和药理药效学对比研究的报道, 提示二者均能显著对抗佐剂性关节炎(adjuvant- induced arthritis, AIA)模型的炎症反应以及血清白介素-6 (interleukin-6, IL-6)、类风湿因子(rheumatoid factor, RF)、抗CCP抗体(anti-cyclic citrullinated peptides antibody, AC-PA)的异常[15];二者通过调控Toll样受体2 (Toll like receptor, TLR2) /肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor necrosis factor receptor- associated factor 6, TRAF6)信号通路和凋亡受体Faslg (tumor necrosis factor ligand superfamily member 6)基因产生抗炎作用[16], 并显著调节外周血T细胞亚群[17];但乌头汤具有较好的抗炎和镇痛作用, 白虎加桂枝汤则具有明显拮抗急性炎症作用[18]等特点。然而, 上述研究尚未从系统的视角较全面地对二者抗RA的作用和机制进行比较。
近年来, 转录组学(transcriptomics)、生物信息学(bioinformatics)及网络药理学(network phar-macology)等多种新兴学科的发展和应用, 为中药方剂整体药效评价及其多成分-多靶点-多途径的作用机制挖掘提供有效的技术支撑[19-22]。转录组学分析有利于揭示基因表达与生命表征的内在联系, 并挖掘机体发育和病理生理机制[23]。网络药理学, 则开创了多成分、多靶点、整合协同的研究模式, 从生物网络切入, 全面解析方剂作用原理[24]。因而, 将转录组学数据挖掘与网络药理学研究策略相整合, 不仅有利于系统阐释疾病发生、发展和转归相关的动态演变分子机制, 还为药物靶标的高效预测及潜在分子机制的揭示提供强有力手段。因此, 本研究拟采用AIA大鼠模型, 开展全基因组表达谱芯片检测和网络药理学挖掘的整合研究, 初步揭示乌头汤和白虎加桂枝汤治疗RA的作用和机制, 为深入阐明二者抗RA的作用机制提供依据。
材料与方法实验用动物 雄性Lewis大鼠, 健康6~7周龄(30只, 体重200 ± 20 g), 清洁级, 购自中国生物制品鉴定所动物中心。动物许可证: SCXK (京) 2007-0017, SCXK (京) 2009-0017。所有动物均饲养在温度为(24 ± 1) ℃的恒温条件下, 光照/黑暗周期为12 h, 给予自由饮食。
实验药品、试剂及仪器 黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge.]、麻黄(Ephedra sinica Stapf)、芍药(Paeonia lactiflora Pall.)、甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、制川乌(Aconitum carmichaelii Debx.)、知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge.)、桂枝(Cinnamomum cassia Presl)和石膏(Gypsum fibrosum)均购自北京同仁堂药店, 经中国中医科学院中药研究所张村研究员鉴定为合格药材。甲氨蝶呤片(上海信谊药厂有限公司产品; 国药准字H31020644);完全弗氏佐剂(Chondrex公司产品; 货号: 7002);乙醇(批号: 20101222)、丙酮(批号: 20101223)购自北京化工厂; 液体石蜡(江西德成制药有限公司; 批号: 150702)。Von frey hair疼痛测试仪(美国Stoeltingco公司); 热辐射疼痛测试仪(意大利Ugo Basile公司); 旋涡混合器(北京金北德工贸有限公司; 型号: KA-1000)。
药液制备方法 乌头汤制备方法:称取制川乌6 g, 麻黄、黄芪、白芍及炙甘草各9 g, 温水浸泡1 h。先将制川乌加入420 mL水中, 加热至沸腾后开始计时, 煮沸1.5 h, 然后同时加入其他4味中药材, 继续煎煮1.5 h, 倒出药液。再加入336 mL水, 煎煮1.5 h后, 合并两次药液, 纱布过滤。将全部药液转移至旋转蒸发仪浓缩为含饮片0.42 g·mL-1, 以此浓度稀释至给药浓度。白虎加桂枝汤制备方法:称取石膏60 g、知母15 g、甘草5 g、粳米30 g、桂枝10 g, 温水浸泡1 h。先将石膏单独煎30 min后加入其他药物, 加水至1 000 mL, 保持微沸, 煎煮30 min, 纱布过滤; 取药渣加水500 mL二次煎煮20 min, 纱布过滤并与第一次滤液合并, 并将全部药液转移至旋转蒸发仪浓缩为含饮片2 g·mL-1, 以此浓度稀释至给药浓度。
实验分组及给药方式 雄性Lewis大鼠30只, 随机分为5组, 每组6只。组别如下:正常对照组(Con)、佐剂性关节炎模型组(AIA)、乌头汤治疗组(AIA-WTD)、白虎加桂枝汤治疗组(AIA-BHGZD)和甲氨蝶呤阳性对照组(AIA-MTX)。按照本课题组前期研究的最佳药效计量和给药方式进行给药[25]:乌头汤剂量为7.5 g·kg-1, 相当于2倍临床等效剂量; 根据预实验, 白虎加桂枝汤剂量为21.4 g·kg-1, 相当于2倍临床等效剂量时的疗效最佳; 甲氨蝶呤剂量为0.2 mg·kg-1 (相当于临床等效剂量)。大鼠给药溶剂按照1 mL/100 g体重灌胃, 从免疫当天开始给药, 乌头汤和白虎加桂枝汤组每给药6天, 间歇1天; 甲氨蝶呤每给药3天, 间歇1天; 正常组和AIA模型组灌服等体积蒸馏水[25];给药至免疫第25天。
AIA大鼠模型的建立及造模方法 本研究使用的是完全弗式佐剂(CFA:热灭活的结核分枝杆菌酪酸的液体石蜡混悬液, Difco), 按照浓度10 mg·mL-1, 将热灭活的结核分枝杆菌铬酸加入到液体石蜡中, 用吸管吹打混悬, 置于4 ℃备用。根据预实验, 造模前2 h配制效果最佳, 造模时分别吸取造模剂, 吸取前注意吹打, 以避免沉淀导致浓度不准确[26]。每只Lewis大鼠于尾根单次皮内注射0.1 mL CFA, 建立AIA模型; 正常组注射等量生理盐水代替。除正常组外其他4组即AIA模型组、乌头汤、白虎加桂枝汤及甲氨蝶呤治疗组均建立AIA模型。在实验中观察到按照此方法建立的AIA模型, 造模后第11天开始出现临床红肿症状。
关节炎评价方法 发病率:截至取材前一天, 每组发病动物数占本组动物总数的比例(踝关节或者掌关节大于1分算发病)[26];关节炎评分:自免疫8天开始, 参考文献每2~3天进行1次临床积分(双人目测), 计算出临床积分, 每足20分制, 共80分[27, 28];后肢肿胀度:自免疫8天开始, 每日用游标卡尺测量大鼠的右后肢直径, 截止至取材前一天[29]。
疼痛测定方法 大鼠的痛阈通过Von frey hair机械疼痛测试仪[30, 31]、热辐射疼痛测试仪和丙酮分别检测机械痛觉超敏(机械痛敏)、热辐射痛敏和冷触诱发痛(冷痛敏)。分别在造模前、造模后测量(每隔2天测量1次), 每次测量维持3个周期, 中间间隔5 min, 最后计算取平均值。
样品采集 造模第25天, 麻醉大鼠后, 综合考虑大鼠的关节炎评分、后肢肿胀度和痛敏等具体情况, 每组取3只大鼠, 于冰上快速准确取滑膜组织, 迅速放入Trizol中, 置于液氮冻存, 待全基因组表达谱芯片检测。
全基因组表达谱芯片检测及差异表达基因筛选 采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒(Low Input Quick Amp Labeling Kit, One-Color, Cat.# 5190-2305, 美国Agilent Technologies公司)提取各组关节滑膜组织的RNA样本, 并用RNeasy mini kit (德国QIAGEN公司, Cat.# 74106)纯化标记后的cRNA。采用全基因组表达谱芯片(Agilent Whole Rat Genome Microarray 4×44K, Cat.# G4131F, 上海伯豪生物技术有限公司), 检测正常组、AIA模型组及各治疗组受累关节滑膜组织的全基因组表达谱。采用R软件中Limma包对芯片检测原始数据进行归一化, 并计算基因组间表达量差异倍数(fold-change)及t检验(student's t-test), 以fold change≤ 0.5或者fold change≥2, 且t检验P < 0.05为标准, 分别筛选RA发病相关基因(AIA vs Con)、乌头汤抗RA效应基因(AIA-WTD vs AIA)以及白虎加桂枝汤抗RA效应基因(AIA-BHGZD vs AIA)。
已知抗RA靶标分子的收集 已知抗RA靶标信息从以下数据库收集: DrugBank数据库(http://www.drugbank.ca/, version: 3.0)、OMIM数据库(http://www.omim.org/, last updated: October 31, 2013)、GAD数据库(Genetic Association Database, http://geneticasso-ciationdb.nih.gov/, last updated: August 18, 2013)和KEGG通路数据库(http://www.genome.jp/kegg/, last updated: October 16, 2012)。
网络构建与分析 基于String数据库(http://string-db.org/, version 10.5), 提取上述已知抗RA靶标基因、RA发病相关基因、乌头汤抗RA效应基因和白虎加桂枝汤抗RA效应基因的相互作用信息。限定物种为大鼠, 获取基因间相互作用信息, 结果保存成TSV格式, 选取相互作用可信度评分(combined score)等于或大于所有相互作用评分中位数的基因间相互作用信息, 并导入Cytoscape软件(version 3.4.0, 美国Cytoscape Consortium公司)构建网络并计算节点在网络中的连接度(degree)、紧密度(closeness)和介度(betweenness)。以上述网络拓扑特征参数的中位数作为卡值, 选取3个特征参数值均大于卡值的节点蛋白质作为关键网络靶标。采用Navigator software (version 2.2.1, 美国Bentley Systems公司)进行网络可视化。
基因功能和通路富集分析 基于GO数据库(Gene Ontology, http://www.geneontology.org/, last updated: March 28, 2018)和KEGG数据库(Kyoto Encyclo-pedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/, last updated: Oct 16, 2012)利用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp, version 6.7)进行基因功能和通路的富集分析。
统计学分析 采用SPSS version 15.0 for Windows软件(美国SPSS Inc公司)进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。受累关节比例的组间比较采用卡方检验; 关节炎评分和后肢肿胀度的组间比较采用非参数统计检验(Kruskal-Wallis检验); 其他指标的组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05作为统计学具有显著性差异的标准。应用Microsoft Office 2016、GraghPad Prism 6.0和Adobe Photoshop CS6软件进行图表制作。
结果 1 乌头汤和白虎加桂枝汤均可显著降低AIA大鼠发病率, 缓解关节炎严重程度本研究采用雄性Lewis大鼠成功构建了AIA模型。造模11天开始, AIA模型组大鼠关节红肿、畸形症状明显, 而乌头汤及白虎加桂枝汤治疗组虽也见关节红肿症状, 但严重度已明显减轻, 与甲氨蝶呤治疗组相似(图 1A)。
结果表明, 造模25天后, 模型组的发病率100%, 而乌头汤和白虎加桂枝汤给药后发病率分别下降了33%和30% (均P < 0.05, 图 1B); 模型组的关节临床积分可达34.17, 乌头汤和白虎加桂枝汤给药后分别下降了10.78和9.17 (均P < 0.001, 图 1C); 模型组的关节肿胀度可达1.17 cm, 乌头汤和白虎加桂枝汤给药后分别下降了0.18和0.21 cm (均P < 0.001, 图 1D)。
2 乌头汤和白虎加桂枝汤均可缓解AIA大鼠疼痛作用与正常组相比, AIA模型组大鼠机械痛阈值(图 2A)、冷痛阈值(图 2B)及热辐射反应时间(图 2C)均显著降低, 表明造模成功(P < 0.05、P < 0.01或P < 0.001);与AIA模型组相比, 各治疗组均具镇痛作用, 可不同程度提高痛阈值, 其中, 乌头汤最快发挥药效作用, 5天起就能明显降低机械痛阈值和热辐射痛阈值(P < 0.05, P < 0.001), 10天起显著降低冷痛痛阈(P < 0.01);白虎加桂枝汤降低痛阈值的起效时间虽然比乌头汤慢, 但镇痛强度与阳性药甲氨蝶呤相似且略强, 特别是对热辐射的抑制作用, 15天起比乌头汤更明显(P < 0.001)。
基于芯片检测结果和差异表达数据分析, 共获得637个RA发生相关基因(包括394个上调表达基因和243个下调表达基因)、568个乌头汤抗RA效应基因(包括338个上调表达基因和230个下调表达基因)和704个白虎加桂枝汤抗RA效应基因(包括363个上调表达基因和341个下调表达基因)。
4 乌头汤抗RA关键网络靶标可调节机体能量代谢和炎症-免疫相关信号通路参考本课题组以往的研究策略[22, 26, 32, 33], 建立“乌头汤抗RA效应基因-RA相关基因”相互作用网络, 并计算网络中节点的连接度、紧密度和介度值, 筛选具有重要作用关键网络靶标, 结果共筛选到126个关键网络靶标, 其中有106个为乌头汤抗RA效应基因, 32个为RA相关基因(表 1)。
构建上述关键网络靶标的直接相互作用网络, 并进行通路富集分析, 结果显示, 乌头汤抗RA的关键网络靶标显著参与激素和能量代谢相关的通路, 如:发热正调控、脂肪细胞因子信号传导通路、促性腺激素释放激素(GnRH)信号传导通路、对ATP的反应、磷脂酰肌醇3-激酶活性的正调控、脂质激酶活性的正调控、脂肪酸衍生物转运等, 以及RA“炎症-免疫失衡”相关通路, 如:破骨细胞分化、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Jak-STAT信号通路、趋化因子信号通路、B细胞受体信号通路、抗原处理与呈递、FcεRI信号通路、天然杀伤细胞介导的细胞毒性、白细胞跨内皮迁移, 进而影响RA病程中的主要病理学改变(图 3)。
采用同样方法[22, 26, 32, 33], 建立“白虎加桂枝汤抗RA效应基因-RA相关基因”相互作用网络, 并计算网络中节点的连接度、紧密度和介度值, 筛选具有重要作用关键网络靶标, 结果共筛选到162个关键网络靶标, 其中有132个为白虎加桂枝汤抗RA效应基因, 58个为RA相关基因(表 2)。
构建上述关键网络靶标的直接相互作用网络, 并进行通路富集分析, 结果显示, 白虎加桂枝汤抗RA的关键网络靶标显著参与RA“炎症-免疫失衡”相关通路, 如: FcεRI信号通路、Toll样受体信号通路、B细胞受体信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号通路、FcγR介导的吞噬作用、破骨细胞分化、天然杀伤细胞介导细胞毒性、细胞因子-细胞因子受体相互作用、血管平滑肌收缩、TGF-β信号传导途径、凝血与补体级联反应信号通路, 进而缓解RA病程中的主要病理学改变(图 4)。
为了开展全基因组表达谱芯片检测和网络药理学分析的整合研究, 本研究首先采用AIA大鼠模型, 对比分析了乌头汤和白虎加桂枝汤对RA的作用和机制。研究结果发现, 乌头汤和白虎加桂枝汤给药处理后, 均可显著降低AIA大鼠发病率, 改善关节红肿、畸变等症状, 二者作用相似, 但对AIA大鼠疼痛的缓解作用和特点略有不同。乌头汤能在最短时间内发挥降低机械痛敏、冷痛敏和热辐射痛敏的药效作用, 而白虎桂枝汤对热辐射痛敏干预效果虽较慢, 但作用稳定而持久。
基于上述实验研究结果, 课题组又开展了转录组学数据挖掘, 分别获得RA发生相关基因及乌头汤和白虎加桂枝汤抗RA药效相关效应基因集。进而整合网络药理学分析, 分别建立“两首方剂抗RA效应基因-RA相关基因”相互作用网络, 通过网络拓扑特征计算和功能挖掘, 发现乌头汤和白虎加桂枝汤抗RA的关键候选靶标均参与RA进展相关的“炎症-免疫”通路, 如Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、B细胞受体信号通路等。这些通路在RA炎症、滑膜血管翳形成、炎性细胞浸润、血管生成、关节破坏和疼痛中发挥重要作用[34]。此外, 乌头汤抗RA的关键候选靶标还参与机体产热、产能及激素调节通路, 如发热正调控、脂肪细胞因子信号传导通路、GnRH信号传导通路、对ATP的反应、磷脂酰肌醇-3-激酶活性的正调控、脂质激酶活性的正调控、脂肪酸衍生物转运。研究表明, 这些通路直接或间接地与RA发展相关:脂肪细胞因子通过调节其他代谢或炎性因子在RA中发挥作用[35]; GnRH具有促炎作用[36]; RA巨噬细胞线粒体过度消耗氧气, 产生过多ATP, 最终导致组织破坏酶的过度产生, 使RA病症加重[37];磷脂酰肌醇-3-激酶通过激活促凋亡蛋白和半胱天冬酶级联诱导细胞凋亡[38];脂质激酶在免疫细胞的迁移和激活以及免疫调节中发挥作用[39, 40];消退素E1通过前列腺素E2的自分泌, 抑制核因子κB受体活化因子(RANKL)配体诱导的活化T细胞核因子(NFATc1)和原癌基因(c-fos)的表达, 以及白细胞介素-17 (IL-17)诱导的RANKL的表达, 从而抑制破骨细胞生成和骨吸收[41]。
综上, 本研究采用AIA大鼠模型对比分析乌头汤和白虎加桂枝汤治疗RA的作用, 并利用全基因组表达芯片检测整合网络药理学分析方法, 对比分析二者抗RA机制的异同。与之前的同类研究[42]相比, 本研究从系统的角度初步揭示了乌头汤和白虎加桂枝汤抗RA的作用和机制, 这将为后续通痹经方功效的生物学内涵阐述奠定基础, 同时也为下一步“病-证-方”结合研究提供借鉴。
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