2018, Vol. 53
ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)是一类普遍存在于原核生物和真核生物中的跨膜转运蛋白, 也是生物体内最大、功能最广泛的蛋白家族之一。ABC转运蛋白有3种结构类型, 包括全分子转运蛋白、半分子蛋白及可溶性转运蛋白[1]。全分子ABC转运蛋白具有两个核苷酸结合结构域(nucleotide- binding domain, NBD)和两个跨膜结构域(transmembrane domain, TMD), 而半分子转运蛋白只含有1个跨膜结构域和1个核苷酸结合结构域, 第三种结构类型是没有跨膜结构域, 只有核苷酸结合结构域, 也称可溶性蛋白类型。大多数ABC转运蛋白都能与腺苷三磷酸(ATP)结合并通过水解ATP释放能量从而调控物质的跨膜运输[2]。植物ABC转运蛋白在植物次生代谢物质的转运与积累、植物激素运输、脂质代谢、外源毒素的解毒、植物抗病等方面都起着关键作用[3]。近年来, 越来越多的ABC转运蛋白基因在水稻、拟南芥、烟草和豆科百脉根等模式植物中被鉴定[4, 5], 已经成为植物次生代谢工程重点研究的方向之一。
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生型草本植物, 具有极高的药用价值, 为历版《中华人民共和国药典》收录的正品石斛之一, 以新鲜或干燥的茎入药, 具有益胃生津、滋阴清热等功效。铁皮石斛含有多糖、甘露糖、生物碱及联苄类化合物, 具有抗肿瘤、抗氧化及抗血小板凝集等作用[6]。
铁皮石斛具有兰科植物独特的生物学特性, 即在自然条件下种子萌发和幼苗的分化、生长发育乃至成年植株的繁殖整个生活史都离不开真菌[7]。大量的研究表明, 在兰科植物与真菌的共生互作过程中, 真菌能有效的促进其种子萌发, 提高种子萌发率和幼苗成活率, 增强铁皮石斛对病原真菌的抗性以及增加其活性成分如多糖及生物碱的含量等[8, 9]。然而, 有关真菌有效作用的机制尚不清楚。早期的实验证明, 真菌在与兰科种子及根建立共生关系后, 通过转运作用或自身消解为植物提供碳水化合物等养分, 同时促进植物对土壤水分及矿物质的吸收和利用[10]。本课题组前期利用转录组和蛋白质组学技术分析了铁皮石斛种子接菌共生萌发过程中的分子机制, 揭示了真菌促进石斛种子萌发主要是改变了宿主植物的代谢, 提高或提早了与碳水化合物、脂代谢及激素代谢相关基因的表达[11]。植物与微生物相互作用过程中, 涉及复杂的营养物质和信号交换, 转运蛋白在这个过程中扮演重要角色。铁皮石斛中含有丰富的次生代谢产物, 这些物质在调控植物与其共生的真菌间的关系中发挥重要作用。一些植物激素如赤霉素、脱落酸、生长素、独脚金内酯等在植物与共生真菌互作过程中的信号识别起关键作用[12-14]。已有研究证实ABC转运蛋白在植物病原微生物应答、植物与微生物共生互作中营养物质的转运、调节重金属以及次生代谢物运输甚至是参与植物激素及外源化学物质的转运方面发挥重要功能[15]。目前, 已经在水稻中鉴定了123个, 拟南芥中鉴定了127个, 豆科百脉根中鉴定了89个, 在烟草及油菜中均开展了ABC转运蛋白的研究[16], 但兰科植物ABC转运蛋白的鉴定和预测鲜有报道[17]。在铁皮石斛菌根共生研究中, 已有的工作主要集中在对菌根共生信号转导相关基因的克隆和表达分析[18, 19], 而对ABC转运蛋白在铁皮石斛与微生物互作过程中的作用未见报道。因此, 了解铁皮石斛ABC转运蛋白基因家族的组成及其在真菌与植物共生互作过程中的表达, 对进一步揭示其在植物次生代谢产物积累及与微生物互作过程中营养物质的转运方面显得尤为重要。本文基于近期已经报道的铁皮石斛基因组和本课题组前期已经测序的铁皮石斛种子共生萌发的转录组数据, 鉴定了铁皮石斛植物中ABC转运蛋白并探讨其功能, 这不仅对铁皮石斛代谢物质的转运和积累的研究奠定基础, 更重要的是为解析兰科植物与真菌共生机制的研究提供参考依据。
材料与方法铁皮石斛的基因组数据库及转录组数据库 铁皮石斛参考基因组数据来自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?linkname=bioproject_sra_all&from_uid=269320[20], 转录组数据来自中国医学科学院药用植物研究所真菌室自测且已保存在NCBI和SRA数据库(登记号: PRJNA279934) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA279934)[11]。铁皮石斛成熟蒴果采自浙江金华石斛人工种植的山林和大棚。促铁皮石斛种子萌发的优势菌种——胶膜菌属真菌Tulasnella sp.“S6”为本实验室保存。选取未萌发种子(0级)、无菌萌发(1/2MS培养基)和共生萌发(OMA培养基)不同萌发级别的种子2、3、4级(种子吸水膨胀并撑破种皮为2级, 定义为萌发; 出现顶端分生组织即原球茎为3级; 顶端分生组织继续伸长并弯曲为4级)[21]以及非共生下的真菌菌丝, 采用RNA提取试剂盒RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany)提取以上样品的总RNA, 检测RNA质量、纯度和完整性送至深圳华大基因公司在IlluminaHiseq2000测序平台上进行测序。原始序列经过滤后进行后续的生物信息学分析, 以铁皮石斛基因组[20]做参考进行序列的组装、功能注释及表达分析。转录本表达量差异(fold change) ≥ 2.0, FDR (false discovery rate) < 0.001定义为差异表达基因。
铁皮石斛ABC转运蛋白的鉴定 从转运蛋白数据库TCBD (the transporter classification database)[22]中下载所有转运蛋白(transporter)基因数据, 在铁皮石斛基因组中进行Blast同源序列搜索(E−值小于10−5)以确定为铁皮石斛ABC转运蛋白候选基因, 根据数据库中的基因注释对鉴定为候选转运蛋白基因进行分类。分类和命名方法以国际上通用的ABC转运蛋白系统即人类基因组ABC转运蛋白分类和命名方法为主[23], 并结合植物ABC蛋白分类[24]。ABC家族蛋白多序列排序采用在线Mafft软件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), 系统发育树构建采用MrBayes 3.0软件[25], 核苷酸替代模型通过jmodeltest[26]估算出最优模型为GTR+I+G模型, 运行6个马尔可夫链(MarkovChain Monte Carlo process), 共运行2 000 000代, 每100代抽样1次, 计算各分支的可信度, 后验概率(posterior probability)值≥ 95%标于系统树分支上。
ABC转运蛋白结构域分析及亚细胞定位预测 采用在线软件HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)进行ABC转运蛋白结构域的分析; 亚细胞结构定位预测采用在线工具ProComp9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=pcompb&group=programs&subgroup=proloc)及WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)。
铁皮石斛ABC转运蛋白的表达分析 基于RNA-Seq转录组数据, 本研究比较分析了ABC转运蛋白基因在铁皮石斛种子无菌萌发或共生萌发组内相邻萌发阶段的表达模式; 以及在相同萌发阶段下, 无菌和共生萌发组样品中的表达差异, 筛选出参与铁皮石斛种子接菌共生萌发的差异表达转运蛋白。蛋白表达的层次聚类分析及作图采用软件Genesis 1.7.7.27[27]。
实时荧光定量PCR验证基因表达 基于转录组数据分析结果, 选取了5个在铁皮石斛种子共生萌发过程中显著上调表达的ABC转运蛋白基因经qPCR验证其表达。将铁皮石斛无菌和接菌共生萌发各级别(0、1~2、3、4级)的种子样品提取总RNA, 用试剂盒iScriptTMcDNA synthesis Kit (Bio-rad)反转录为cDNA。qPCR引物设计采用Primer 3.0在线软件, 引物由金唯智生物科技有限公司合成。qPCR反应以铁皮石斛EF-1α为内参基因, 在罗氏lightCycler 480PCR仪(Roche Applied, USA)上进行, 反应条件是95 ℃ 3 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。PCR扩增反应设置3个生物学重复和3个技术重复。数据分析采用2−ΔΔCT法计算基因相对表达量[28]。
结果与讨论 1 ABC转运蛋白的鉴定本文从铁皮石斛基因组中一共鉴定了88个ABC转运蛋白, 分为ABCA-ABCI, 共7个蛋白家族(表 1)。其中ABCG蛋白共37个, 占比最高(42%), 其次是ABCB蛋白19个, 占总ABC转运蛋白的20.45%, ABCC蛋白12个(13.63%), ABCF蛋白9个(10.22%), ABCA、ABCI家族蛋白各4个, ABCD家族蛋白3个。ABCH和ABCE蛋白家族成员在铁皮石斛中未发现。从结构上看, 88个蛋白中, 19个为全分子转运蛋白(TMD-NBD-TMD-NBD), 21个为半分子转运蛋白(TMD-NBD/NBD-TMD2), 37个为可溶性转运蛋白(NBD/NBD-NBD)。全分子转运蛋白最大包含1 601个氨基酸(Dendrobium_GLEAN_10107384), 最小包含1 021个氨基酸(Dendrobium_GLEAN_10086877)。ABCG已知是植物中最大的ABC蛋白家族, 在铁皮石斛中发现37个, 其中14个蛋白属多效耐药性转运蛋白(pleiotropic drug resistance protein, PDR)。
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Table 1 Classification, function and subcellular localization of 88ABC transporter of medicinal plant D. officinale. PM: Plasma membrane; ER: Endoplasmic reticulum; Ch: Chloroplast; N: Nucleus; M: Mitochondrial; V: Vacuole; Cy: Cytoplasmic |
基于ABC蛋白结构域核苷酸结合区域(NBD)构建的系统发育树将88个ABC转运蛋白划分成7个亚家族(图 1)。ABCA-ABCD均形成一个独立的分支, ABCG中的PDR单独成2个100%支持率的亚支。然而, 注释为ABCI的4个蛋白被聚类成两个分支, PEQU_06417-D1和Dendrobium_GLEAN_10077411聚在一个分支(PP = 100), Dendrobium_GLEAN_10131109和Dendrobium_GLEAN_10077405聚在一支。同样, ABCF家族的9个蛋白也被分成4个小分支, 其中2支有100%的后验概率。
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Figure 1 Phylogenetic relationship of 88 ABC transporters in D. officinale. Amino acid sequences of nucleotide-binding domains (NBDs) were aligned using Mafft and subjected to a majority tree by Mrbayes 3.0. Numbers above the branches indicate ≥ 95%. The end of the branch indicates the gene ID |
为进一步理解铁皮石斛ABC转运蛋白各家族成员的潜在功能, 本文分别对各亚家族成员进行了功能预测。
铁皮石斛中鉴定的4个ABCA蛋白中, 2个是半分子转运蛋白(Dendrobium_GLEAN_10101513; Dendrobium_GLEAN_10047236), 分别含有578个和751个氨基酸; 另外两个蛋白属可溶性转运蛋白(其NBD和TMD存在于不同的多肽上), 预测的功能属于药物输出(the drug exporter-1)。Blastp比对结果显示其与小果野焦(Musa acuminata subsp. malaccensis)、海枣(Phoenix dactylifera)及烟草(Nicotianatabacum)的ABCA7有79%~85%的相似性。植物中的ABCA7的功能尚不明确, ABCA7在人体上已鉴定为与阿尔茨海默病(AD)相关[29]。
ABCB亚家族已知是植物ABC转运蛋白中的第二大亚家族。拟南芥和水稻中分别鉴定了22个和24个, 在铁皮石斛中, 鉴定了19个ABCB亚家族蛋白, 大致分为5类, 其中多药耐药性蛋白(multidrug resistance protein, MDR)占15个, 重金属转运蛋白及脂转运蛋白各2个。全分子转运蛋白Dendrobium_GLEAN_10055032与小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)转运蛋白有同源性, Dendrobium_GLEAN_10086877和Dendrobium_GLEAN_10107406与水稻和拟南芥的ABCB4家族成员有同源性。拟南芥AtABCB4被认为是生长素输入/输出蛋白, 可能参与了生长素的极性运输[30]。
铁皮石斛中一共鉴定了12个ABCC家族蛋白, 包括3个全分子转运蛋白(Dendrobium_GLEAN_10095542; Dendrobium_GLEAN_10040589; Dendrobium_GLEAN_10107384)、4个半分子转运蛋白、3个可溶性转运蛋白和2个3/4分子转运蛋白。最大的蛋白包含1 601个氨基酸, 最小的蛋白包含247个氨基酸。这些蛋白与水稻中的ABCC3、ABCC8、ABCC10、ABCC13、ABCC14、ABC15以及烟草中的ABCC2有同源性。已知拟南芥同源蛋白AtABCC2、AtABCC10是与病原菌反应相关蛋白。人类ABCC家族蛋白主要是多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein, MRP), 在植物中, ABCC蛋白主要参与细胞内的解毒作用、叶绿素代谢物的运输以及离子通道的调节等[2]。
铁皮石斛中发现3个ABCD亚家族蛋白, 其中2个蛋白(Dendrobium_GLEAN_10017830; Dendrobium_GLEAN_10092249)与兰科蝶兰属的ABCD2关系近缘(序列相似性分别为72%和75%)。而Dendrobium_GLEAN_10130787编码的ABCD转运蛋白与水稻、玉米、棉花的ABCD1关系较近。拟南芥AtABCD1蛋白是过氧化物酶体吸收底物分子以进行氧化反应和乙醛酸循环所必须的, AtABCD1基因突变后, 会导致种子不萌发或者不育[31]。从亚细胞定位来看, 铁皮石斛的3个ABCD亚家族蛋白多定位在细胞核和线粒体上, 可能具有类似拟南芥AtABCD1的功能, 尚待进一步研究。
铁皮石斛基因组中共鉴定了9个ABCF亚家族蛋白, 而在拟南芥和水稻基因组中分别鉴定了5个。研究表明, 植物中的ABCF蛋白一般无跨膜结构域(TMD), 含有两个NBD区域。铁皮石斛ABCF家族蛋白同样具有这样的特点。Blastp分析显示铁皮石斛ABCF蛋白与水稻、兰科蝶兰属ABCF5、拟南芥ABCF4存在较高的氨基酸序列相似性。然而, 目前有关植物中的ABCF蛋白的功能尚不清楚。
ABCG蛋白家族是植物ABC转运蛋白中最大的亚家族, 拟南芥和水稻中分别包含44及51个成员。在铁皮石斛中发现37个该家族成员, 其中14个蛋白为多效耐药性型转运蛋白(the pleiotropic drug resistance family, PDR)、23个蛋白鉴定为果蝇色素转运蛋白(the eye pigment precursor transporter, EPP)。Blastp比对分析表明这些蛋白与水稻ABCG49、拟南芥AtABCG32、AtABCG19、AtABCG11等蛋白有同源性。已知拟南芥ABCG19可以转运抗生素, 为转基因工程中必需的选择性标记基因提供新的基因来源。ABCG11参与角质层与蜡质组分的跨膜运输, 也可能参与了植物激素细胞分裂素的运输, ABCG32在转运角质前体物质方面发挥重要作用, 而ABCG40与ABCG25分别参与植物细胞脱落酸(abscisic acid, ABA)的吸收与外排, 对于植物迅速、有效地响应逆境胁迫具有重要作用[32]。关于ABCG蛋白转运功能研究较多, 现已明确其在植物器官发育、表皮角质层形成、激素运输、次生代谢产物分泌、抵抗生物和非生物胁迫以及植物与微生物互作方面具有重要作用。
铁皮石斛4个ABCI蛋白均没有跨膜结构域, 仅有1个核苷酸结合结构域, 蛋白同源性比较分析显示其与兰科蝶兰属ABCI19和ABCI20有较高的序列相似性, 其功能预测可能参与饱和或不饱和的寡半乳糖醛酸苷转运(TCDB 3.A.1.11.1)。
4 ABC转运蛋白在铁皮石斛种子各萌发级别中的表达模式基于RNA-Seq转录组数据, 所有分析的88个ABC转运蛋白在铁皮石斛种子不同萌发阶段(未萌发种子为C0, 无菌萌发2级A1, 3级A2, 4级A3;共生萌发2级S1, 3级S2, 4级S3)的差异表达分析如图 2所示。首先, 这些蛋白在铁皮石斛种子无菌及共生萌发的早期阶段有相似的表达模式; 其次, ABC转运蛋白各亚家族有多样的表达模式, 每个亚家族均有成员在无菌或共生萌发的不同阶段差异表达。比如4个ABCG蛋白(Dendrobium_GLEAN_10058167; Dendrobium_GLEAN_10041679; Dendrobium_GLEAN_10037982; Dendrobium_GLEAN_10028239)和2个ABCB蛋白(Dendrobium_GLEAN_10086877; Dendrobium_GLEAN_10038800)在种子无菌和共生萌发的早期阶段(萌发2级, 种皮破裂, 萌发启动)相对未萌发的种子, 均呈现差异上调表达, 而且在共生萌发3级(原球茎形成)依旧持续表达, 尽管表达量没有早期阶段高, 但在无菌萌发启动后续的阶段, 这些蛋白的表达量不明显。在无菌和共生萌发早期表达量最高的3个蛋白是ABCC (Dendrobium_GLEAN_10109493)和ABCG (Dendrobium_GLEAN_10058167; Dendrobium_GLEAN_10041679)家族成员, 相比未萌发的种子, 这3个蛋白编码基因在种子萌发启动阶段是高表达的(fold change > 100), 表明其可能参与铁皮石斛的种子萌发过程。这3个蛋白与多种植物ABCC14、ABCG23、ABCG6具有较高的蛋白序列同源性。此外, 1个ABCF蛋白(Dendrobium_GLEAN_10029179)和1个ABCG蛋白(Dendrobium_GLEAN_10040821)在无菌萌发的早期阶段差异上调表达, 但是在相同级别的共生萌发中没有表达, 而是延后到苗发育阶段, 显示出显著的差异上调表达。无菌萌发条件下的原球茎形成阶段(萌发至2~3级), 3个ABCB蛋白(Dendrobium_GLEAN_10107402; Dendrobium_GLEAN_10107406; Dendrobium_GLEAN_10086876)、1个ABCF蛋白(Dendrobium_GLEAN_10035284)和2个ABCG蛋白(Dendrobium_GLEAN_10032126; Dendrobium_GLEAN_10008876)是显著上调表达。其中Dendrobium_GLEAN_10035284、Dendrobium_GLEAN_10086876和Dendrobium_GLEAN_10107402三个蛋白同样也在接菌共生的原球茎阶段上调表达。这些蛋白与已知的多种植物的ABCB11、ABCB21、ABCB4、ABCF5、ABCG3和ABCG11蛋白序列有同源性。
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Figure 2 Differential expression of ABC transporters at adjacent development stage during asymbioticor symbiotic germination of D. officinale. The codes on the right are the gene ID numbers of the 88 ABC transporters in D. officinale. Heat map was conducted on a log2 fold change. Red indicates the up-regulated gene; green indicates the down-regulated gene; black represents no significant expression change; grey represents missing data. C0 represents ungerminated seed; A1, A2, and A3 represent developmental stage 2, stage 3, and stage 4 in asymbiotic germination, and S1, S2, and S3 represent stage 2, stage 3, and stage 4 in symbiotic germination, respectively |
对比无菌萌发, 88个ABC转运蛋白在共生萌发阶段的表达模式分析见图 3。ABCB和ABCG蛋白家族成员在铁皮石斛种子接菌共生萌发中显著上调表达, 如3个ABCB (Dendrobium_GLEAN_10096529; Dendrobium_GLEAN_10107406; Dendrobium_GLEAN_10085480)、6个ABCG (Dendrobium_GLEAN_10140588; Dendrobium_GLEAN_10058167; Dendrobium_GLEAN_10142667; Dendrobium_GLEAN_10041679; Dendrobium_GLEAN_10062268; Dendrobium_GLEAN_10032126)蛋白在接菌共生萌发的整个过程均显著上调表达。除此之外, ABCC蛋白家族成员(Dendrobium_GLEAN_10056219; Dendrobium_GLEAN_10050743; Dendrobium_ GLEAN_10075293)在接菌共生萌发中原球茎形成阶段(3级)显著上调表达, 在其他阶段, 相比无菌萌发其表达没有明显差异。ABCB (Dendrobium_GLEAN_10065663)和ABCG蛋白(Dendrobium_GLEAN_10063525)在共生萌发成苗阶段(4级)显著上调。2个ABCA蛋白(Dendrobium_GLEAN_10078892; Dendrobium_GLEAN_10047236)则主要在共生萌发早期阶段显著上调表达。ABC转运蛋白在种子无菌和共生萌发过程中的表达分析表明, ABCB和ABCG家族成员主要参与了种子萌发及在种子萌发过程中与微生物的相互作用, 而ABCA、ABCC及ABCF亚家族也有部分蛋白参与该过程。
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Figure 3 Expression profiles of 88 ABC transporters between asymbioitic and symbiotic germination of D. officinale seeds. The codes on the right are the gene ID numbers of the 88 ABC transporters in D. officinale. Heat map wasconducted on a log2 fold change. Red indicates the up-regulated gene; green indicates the down-regulated gene; black represents no significant expression change. A1, A2 and A3 represent developmental stage 2, stage 3 and stage 4 in asymbiotic germination, and S1, S2 and S3 represent stage 2, stage 3 and stage 4 in symbiotic germination |
铁皮石斛转录组数据分析表明, ABCG和ABCB蛋白在铁皮石斛种子无菌及接菌共生萌发过程中表达模式最多样, 且在种子萌发不同阶段差异表达的蛋白数量最多。qPCR结果(图 4)显示, ABCG和ABCB转运蛋白相关基因在无菌及接菌共生萌发不同级别间均有表达, 且相对表达量存在差异。以未萌发的种子(0级)为参照样本, 显示ABCB蛋白(Dendrobium_GLEAN_10096529)和ABCG蛋白(Dendrobium_GLEAN_10062268; Dendrobium_GLEAN_10032126; Dendrobium_GLEAN_10140588)基因在种子共生萌发中持续上调表达并且在成苗阶段表达量最高, 与图 3中分析结果一致, 确定这些基因在铁皮石斛种子接菌共生萌发过程中发挥重要作用, 下一步工作将对这几个候选蛋白基因做进一步的基因功能验证。
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Figure 4 Expression patterns of ABCG and ABCB transporters genes using qPCR analysis. Stage 0 represents ungerminated seed; Stage 2, stage 3, stage 4 represent seed developmental stage 1−2, stage 3 and stage 4; AG: Asymbioitic germination; SG: Symbiotic germination |
ABC转运蛋白已知在所有生物体中普遍存在且功能多样, 参与植物激素、脂质、糖类、无机盐、重金属、次生代谢物等分子的跨膜运输。ABCB和ABCF亚家族蛋白已报道主要参与植物的解毒和抗逆境胁迫过程。因此, 在农作物的改良方面有很好的应用[1]。此外, ABC转运蛋白在植物与微生物相互作用过程中以及病原菌侵染过程中均起着重要的作用。半分子ABC转运蛋白ABCG家族成员STR1和STR2是菌根建立不可或缺的调控蛋白[33]。
植物与真菌相互作用过程中, 需要持续不断的营养和信号交换, 而ABC转运蛋白是转运蛋白家族中最大的一个分支, 且在植物和真菌中都存在。ABC转运蛋白在菌根共生关系的建立过程的关键作用最近已经被阐释[34]。铁皮石斛种子接菌共生萌发是一个非常复杂的过程, 不仅涉及到种子萌发、发育成苗的过程, 还涉及了植物与真菌相互识别, 建立共生联系的过程。转录组数据分析表明, ABCC (Dendrobium_GLEAN_10109493)和ABCG (Dendrobium_GLEAN_10058167; Dendrobium_GLEAN_10041679)蛋白无论是无菌还是共生萌发条件下, 都在种子启动萌发阶段差异上调表达。在铁皮石斛种子萌发不同阶段及无菌和接菌共生萌发不同处理组之间, ABCB、ABCG及ABCF家族成员均表现出表达变化差异, 表明这些蛋白可能参与了铁皮石斛生长、发育及与微生物互作过程。在铁皮石斛种子萌发不同阶段, 与未萌发的种子相比, 3个最高差异表达的蛋白ABCC (Dendrobium_GLEAN_10109493)和ABCG (Dendrobium_GLEAN_10058167; Dendrobium_GLEAN_10041679)蛋白序列比对分析显示它们与多种植物ABCC14或ABCC4有同源性。ABCC亚家族成员的功能主要集中在对重金属的解毒, 但拟南芥AtABCC1和AtABCC2也能介导ABA-GE的运输, 参与细胞内ABA的动态平衡[35], 因此推测高表达的铁皮石斛中的ABCC蛋白可能具有类似的功能, 参与ABA的动态平衡, 进而影响种子萌发过程。
ABCG转运蛋白在植物器官发育、表皮角质层形成、激素运输、次生代谢产物分泌、抵抗生物和非生物胁迫以及植物与微生物互作方面具有重要作用[32]。种子萌发的整个过程中, 2个高表达的ABCG蛋白(Dendrobium_GLEAN_10058167; Dendrobium_GLEAN_10041679)与烟草、小兰屿蝴蝶兰等多种植物ABCG23、ABCG6或ABCG1蛋白有同源性, 但是有关这两个蛋白功能的研究较少。相对无菌萌发, 在铁皮石斛种子接菌共生萌发阶段, ABCA、ABCB、ABCG、ABCF蛋白家族成员显著上调表达。已知铁皮石斛共生萌发阶段高表达的ABCB蛋白与拟南芥ABCB19同源, 拟南芥ABCB19主要参与植物生长素的运输。铁皮石斛种子萌发过程中, 植物激素是一个主要的内源调控因子, 而且植物激素作为信号分子和植物与微生物的共生信号之间存在交互作用。与脱落酸和生长素运输相关的ABC蛋白在铁皮石斛种子萌发过程中的高表达, 暗示这些蛋白参与了铁皮石斛种子萌发和生长发育等重要过程。
综上, 对铁皮石斛88个ABC转运蛋白中, 两大亚类ABCB和ABCG中的部分成员通过功能预测和蛋白编码基因在种子萌发过程中的表达分析, 预测了它们可能参与了生长素、脱落酸等植物激素的运输, 进而调控了种子的萌发及与微生物的相互作用。有关这些基因的确切的功能将在后续的工作中进一步的验证。
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