环形RNA (circRNA)是一类新的长非编码RNA, 它们不具有5'或3'端, 而是共价连接形成封闭的环状结构。它们的存在首先由Sanger等^[1]在40多年前使用电子显微镜观察病毒得到的。之后, 发现人类、小鼠、真菌和其他生物体中也存在circRNAs^[2-4]。在之后的几十年中, 它们被认为是一种古老而保守的分子, 是RNA的异常剪接产物, 也是生物体中的“暗物质”^[5]。近年来, 随着高通量RNA测序(RNA-Seq)技术快速发展和生物信息学方法的大量数据分析, circRNAs被越来越广泛地研究, 并且发现它们具有作为miRNA海绵^[6-8]、调节基因转录^{[8, 9]}、调节RNA结合蛋白质^[10-12]和蛋白质翻译的作用^[13-15]。此外, 许多研究已经证实了circRNA在肿瘤细胞中发挥着重要作用, 这可能潜在地用作癌症治疗所需的新型生物标志物和治疗靶标^[16-18]。本综述将首先讨论circRNA的分类、特征和功能, 然后讨论它们在癌症中的相关作用, 通过circRNA为进一步探索癌症生成和生物功能奠定基础。

1 circRNA分类

circRNA可以根据基因组来源和序列组成分为以下3类:外显子circRNAs、内含子circRNAs (ciRNAs)和外显子-内含子circRNAs (EIciRNAs)。由外显子circRNAs组成的circRNAs主要存在于细胞质中, 是体内最丰富的circRNA。大多数外显子circRNAs是由编码基因产生的, 但却不编码蛋白质^{[8, 19, 20]}。外显子circRNA是通过反向剪接形成的。目前存在几种不同的潜在反向剪接模型^{[8, 21, 22]}:一是套索驱动的环化, 其认为在典型的线性选择性剪接过程中, 由于RNA发生了部分折叠, 外显子跳跃产生了一种套索结构并通过核酸外切酶介导降解, 形成了由外显子构成的环状RNA分子。二是内含子配对驱动的环化, 位于内含子区域的反向互补重复序列导致了内含子区域配对介导反向剪接, 使外显子靠近, 从而形成环状RNA分子。三是RNA结合蛋白(RBPs)驱动的环化, 由RBPs触发环化过程, 它与内含子侧翼中的特定靶点结合从而诱导circRNA的形成。ciRNAs主要位于真核生物细胞核中。内含子占人类基因组的20%以上, 其中大多数内含子在剪接后形成套索结构然后被降解^[23]。然而, 含有某些关键核酸序列的一些内含子在剪接后不能去除, 而是形成内含子来源的ciRNA。ciRNA的产生依赖于内含子两端的保守序列, 即位于5'端连接位点上7个富含GU的序列和3'末端11个富含C的核苷酸序列, 这些核苷酸能够防止circRNA脱支并使RNA保留环化结构^[10]。在反向剪接过程中作为剪接过程中的中间体, 也可以形成一种不同的circRNA叫作EIciRNAs, 这种类型的circRNA含有外显子和内含子, 并且完全位于细胞核中。

2 circRNA特征

大量研究表明, circRNAs普遍存在几个突出的特征: ①丰度: Salzman等^[19]提出, circRNAs种类丰富并且超过了相关线性mRNA。如基因PTK2, 可以产生多达47种不同的circRNAs。同时一个基因位点产生的circRNA会产生多种亚型。②稳定性: circRNAs的共价闭环结构使得它们对RNA酶R的抗性比mRNA高, 所以circRNAs比线性mRNA具有更稳定的性质^[19]。据报道, 大多数物种的circRNAs的平均半衰期超过48 h, 而mRNA的半衰期约为10 h^[24]。目前主要运用核酸酶处理RNA样品来鉴定和识别circRNAs。③保守性: circRNAs在不同物种中是高度保守的。许多circRNAs可以同时在人和小鼠中检测, 包括果蝇^{[8, 25]}。④ circRNA通常在组织发育阶段中特异性表达。如circRNA在哺乳动物脑中表达较高, 特别是在突触神经元分化过程中, circRNAs被动态上调^[26]。通过circRNA在不同组织中表达的特异性可以判断circRNA在组织生长发育过程中是否起到调控作用及作为特定组织疾病的诊断标志。

3 circRNA生物学功能

通过影响转录或转录后水平的基因表达, circRNA的生物功能可以分为miRNA海绵、调控选择性拼接和基因转录、与RNA结合蛋白质相互作用和蛋白质翻译。

3.1 作为ceRNA或miRNA海绵

miRNA是一类重要的基因表达转录后调控因子, 可与靶基因mRNA的3' UTR区域结合, 降解靶基因mRNA或抑制mRNA的翻译^[27]。生物体内竞争性内源RNA (ceRNA)含有miRNA应答元件(MRE), 其竞争性结合miRNA^{[28, 29]}。因此, ceRNA可以影响miRNA在基因表达中的调控功能, 降低miRNA对靶分子的抑制作用。最近的研究表明, 外显子circRNAs可以作为ceRNA或miRNA海绵分子, 通过吸附miRNA调节基因的表达^[7]。其中具有代表性的是ciRS-7 (环状RNA)。ciRS-7在基因组上是由脊椎动物小脑失调相关基因(CDR1)反义链转录而来, 检测发现ciRS-7在人和小鼠大脑中表达水平较高。该circRNA的长度约为1.5 kb, 含有74个miR-7的结合位点, 超过60个位点是保守的, 并且能够结合由miR-7和Ago2蛋白形成的RNA诱导的沉默复合物(RISC)^[30]。ciRS-7可以与miR-7下游靶基因mRNA竞争性结合miR-7, 也就是说ciRS-7可以通过miR-7途径上调下游靶蛋白基因行使生物学功能。研究表明, miR-7调控多种蛋白基因参与肿瘤等发生发展过程。同样的, 在胃癌组织中存在的circPVT1可与miRNA-125家族部分miRNA结合, 促进其靶基因E2F2的表达, 进而促进癌细胞的增殖^[31]。生物信息学分析表明, 成千上万的环状RNA具有miRNA吸附功能^[32], 但很少有经过验证。大多数circRNA都没有这么多miRNA结合位点, 因此, 通用的circRNA海绵功能和作为ceRNA调控miRNAs功能需要进一步阐明。

3.2 调控选择性拼接和基因转录

Ashwal-Fluss等^[33]发现, circMBL是由剪接因子MBL的第2个外显子通过与pre-mRNA竞争形成的。在circMBL中, 已经证实了存在MBL蛋白的特异性结合区域, 且该区域在物种之间是高度保守的。MBL通过桥接两个侧翼内含子来诱导环化, MBL表达水平的调节也可能会直接影响依赖于MBL结合位点的circMBL生物合成。此外, 许多其他circRNAs也含有翻译起始位点, 并可能与其宿主基因的前mRNA的剪接发生潜在的竞争来调节相关基因的表达。同时circRNA显示出转录因子的功能, 如circEIF3J和circPAIP2等EIciRNAs主要定位于核内, 与U1小核糖核蛋白颗粒(U1 snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ (Pol Ⅱ)相互作用, 增强其亲本基因的转录, circEIF3J和circPAIP2的敲减分别降低了EIF3J和PAIP2转录水平^{[11, 34]}。此外ciRNAs如ci-ankrd52是ankrd52基因转录过程中形成的一种特异性结合Pol Ⅱ的环RNA, 敲除ci-ankrd52后, 可以发现ankrd52转录效率明显降低, 然而, 高水平ci-ankrd52的存在却未明显提高ankrd52的转录效率, 这可能是外源性ci-ankrd52异常定位引起的^[24]。另一项研究发现, ci-ankrd52不仅在其转录位点富集, 而且还积累在细胞核的其他区域, 这表明它们可能发挥跨调控作用。ci-sirt7也通过类似的机制起作用。另外, cANRIL (外显子circRNA)也可能具有转录调控的活性。ANRIL通过结合Polycomb基因(PcG)复合物来抑制其编码基因INK4/ARF的转录。在转录过程中反向剪接会形成cANRIL, 减少ANRIL, 从而调节INK4/ARF的转录^[35]。

3.3 与RNA结合蛋白相互作用

circRNA具有酶及其底物的结合位点, 因此可以和蛋白质直接作用或者作为促进两种或更多种蛋白质之间接触的支架起作用。如circMBL侧翼内含子包含MBL蛋白结合位点, 能与MBL蛋白直接相互作用, MBL蛋白拥有多种亚型, 其水平的改变会直接影响circMBL的产生。特别是当MBL蛋白过量时, 它可以通过促进circMBL的产生来降低自身mRNA含量^[33]。如circFoxo3, 它具有小鼠双微粒体-2 (MDM2)和p53的结合位点。这些结合位点的突变或circRNA敲低导致p53与MDM2抗体的结合减少, 反之亦然, 这支持了circFoxo3可以作为蛋白质支架的作用。同时发现, circFoxo3能够促进MDM2介导的p53的泛素化, 使其随后被蛋白酶体降解^[36]。circRNA的长半衰期可能增强了其作为支架的功能, 并且在以后可能会发现更多这样起作用的circRNAs。

3.4 蛋白质翻译

由于circRNA缺乏5'帽结构和poly (A)尾巴被认为不能通过帽依赖机制进行翻译, 因此, circRNA通常被认为是非编码RNA^[37-39]。然而, 考虑到大多数的circRNA是由编码基因产生的, 并且含有完整的外显子, 所以circRNAs具有被翻译的可能性。事实上, 早在1995年, Chen和Sarnow等^[38]就发现包含内部核糖体进入位点(IRES)和起始密码子ATG的特定circRNA将允许circRNA翻译模板作为mRNA起作用。2015年, Wang等^[39]在体外构建了含有巨细胞病毒(CMV)启动子、IRES和编码绿色荧光蛋白(GFP)的外显子的一个小基因, 其允许相应转录物的环化。转染细胞后, 该小基因转录本能够形成能翻译GFP蛋白质的环状RNA。但是向后剪切形成的circRNAs基本上并无IRES。直到最近circRNA的世界发生了巨大的变化, 现有3个研究小组^[13-15]提供了有力的证据表明特定的内源性circRNA可以直接作为蛋白质合成的模板, 包括m⁶A修饰可以调控circRNAs翻译, circ-ZNF609可直接翻译蛋白, 该蛋白参与肌肉发生过程等, 这些发现都进一步证实了circRNAs编码多肽和蛋白的功能, 大大推进了circRNAs功能的研究。

4 circRNA与肿瘤

研究已经显示了circRNA和多种肿瘤之间的密切关系, 包括结肠癌、卵巢癌、胃癌、食管癌和神经胶质瘤等, circRNAs的广泛存在、高稳定性和多种调节功能无疑是癌症早期诊断和治疗中新兴的领域。

4.1 致癌性circRNA与抑癌性circRNA

新的研究表明, circRNAs在不同的癌症中发挥着不同的作用, 一些circRNAs可能具有致癌作用, 而另一些则发挥着抑癌作用, 此外, 同一种circRNAs也可能具有多效性。在致癌性方面, 如circPVT1通常在胃癌中上调, 并通过海绵状miR-125等miRNA促进细胞增殖^[31]。在口腔癌中, circRNA_100290被上调, 并且circRNA_100290的敲低在体外和体内都能抑制口腔癌细胞增殖^[40]。在抑癌性方面, Cao小组^[41]研究发现circMTO1在HCC (肝细胞癌)中显著下调, 并且通过作为miR-9海绵抑制HCC进展。Li等^[42]发现circHIPK3在膀胱癌组织和细胞系中显著下调, circHIPK3的过度表达可有效抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭和血管生成。以ciRS-7为例, ciRS-7一方面强烈抑制miR-7的活性, 通过增加癌相关信号通路中的致癌因子, 如EGFR^[43]等miR-7靶点的水平, 起到肿瘤促进作用; 另一方面, miR-7似乎是宫颈癌和肺癌细胞系中的致癌miRNA, 其中ciRS-7作为miR-7海绵可抑制肿瘤形成, 表明ciRS-7的肿瘤抑制特性。肿瘤抑制性circRNA和致瘤性circRNA之间的微妙平衡对于细胞稳态是至关重要的。当不平衡时, 肿瘤抑制性circRNA可能起到抑制癌症的作用, 而致癌性circRNA可能促进癌症进展。这些不同作用的circRNAs为癌症治疗提供了新的见解。

4.2 circRNA作为肿瘤生物标志物

circRNA具有丰富、保守, 在唾液、血液和外泌体中稳定表达的特征, 并且表现出组织发育阶段的特异性, 这使得它有希望成为癌症生物标志物。此外, 与数量相对较少的miRNA相比, circRNA更容易被检测到。此外, 通过RT-PCR和原位杂交检测circRNA的方式比通过抗原-抗体反应检测蛋白质更灵敏有效。因此, circRNA具有作为潜在癌症生物标志物的优势。研究^[44]表明基于肿瘤的血小板RNA包含有肿瘤相关的生物分子, 可以以此鉴别出健康人群和癌症患者, 准确率达到96%。此外, 这个检测不仅可以帮助诊断癌症和指导治疗, 还可以区分6种不同的原发性肿瘤类型, 准确率达到71%;还可以鉴别出特定的乳腺癌和肺癌的生物标志物。而circRNA可以耐受核酸外切酶的降解, 相比线性RNA更稳定, 所以在无核细胞中circRNA表达丰度应该可以作为整体mRNA稳定性的一个很好指标, 相比于有核细胞, 血小板中circRNA/linear RNA表达比值高出17~188倍之多。同时circRNA/linear RNA表达比值的升高可作为血小板降解的一个信号指标。已有各种circRNA被认为是潜在的生物标志物。如在喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中, circ_100855显著上调, circ_104912显著下调, 其表达与肿瘤分期和颈淋巴结转移显著相关, 表明其潜在标志LSCC肿瘤发生^[45]。通过使用qRT-PCR, 检测到hsa_circ_100855作为最上调的circRNA, hsa_ circ_104912作为最下调的circRNA, 意味着T3-4期, 颈淋巴结转移或晚期临床分期患者hsa_circ_100855表达较高, hsa_circ_104912表达较低。类似地, 在胃癌中hsa_circ_002059的下调是与远端转移、TNM分期、性别和年龄有关, 可以作为胃癌诊断的关键作用^[18]。此外, circPVT1^[31]、hsa_circ_0000190^[46]和hsa_circ_ 0000096^[47]被新发现是有希望的胃癌生物标志物。与此同时, 皮肤鳞状细胞癌和非损伤皮肤活组织检测中发现共有322个circRNA异常表达。同样的, 在基底细胞癌中有71个差异表达的circRNA^[48]。总之, 人类癌症中异常表达的circRNA可以作为一类新的诊断、预后和治疗性生物标志物(表 1)^{[31, 41, 42, 49-55]}。

4.3 circRNA作为治疗靶点或治疗载体

虽然到目前为止, 还没有临床报告表明将circRNA单独作为靶标或用作癌症治疗的治疗载体, 但是这种情况在将来可能会发生变化。一方面, 设计circRNA用作治疗靶点时, 有一些重要的问题需要考虑。如靶向致癌性circRNA时应优先选择以不干扰线性mRNA表达的方式进行。可行的治疗途径可以是通过与该位点完全互补的外源siRNA来靶向致癌性circRNA, 或者通过引入与前mRNA中的后剪接信号互补的反义寡核苷酸来干扰反向剪接。而为了诱导肿瘤抑制性circRNA的表达, 可以通过基因治疗手段设计用于circRNA表达的DNA盒来实现外源性表达。circRNA表达通常通过将相应的外显子和伴随的剪接位点克隆到由人工合成的长反向或含有Alu重复的同源侧翼区域中来实现^[56]。然而, 应注意不要通过引入外来circRNA引起干扰素反应^[57], 对于上述任何一种策略, 主要的作用是靶向大多数恶性肿瘤细胞以避免癌症复发。另一方面, circRNA对miRNA的海绵作用及独特的细胞稳定性和容量也可以将circRNA作为递送治疗剂的载体。利用具有致癌miRNA或蛋白质的多个结合位点的circRNA可以控制癌细胞的增殖或诱导凋亡。由于环状RNA由Pol Ⅱ启动子表达, 所以通过利用细胞特异性启动子可以使恶性肿瘤细胞的表达限制于某些特定细胞类型。并且目前已经发现了能够提供正确翻译信号的circRNA作为蛋白质表达的模板。这一切都说明, 未来circRNAs可能会用作治疗靶点或治疗载体的巨大潜力。

5 总结和展望

目前的研究表明, circRNAs是一类广泛表达的, 丰富的、稳定的, 具有一系列活性的RNA分子。circRNAs通过多种作用机制在癌症中发挥着重要的作用。对于这些环状RNA分子的鉴定和功能研究不仅丰富了研究者对非编码RNA家族复杂性的理解, 而且为人类疾病的诊断和治疗提供了新的思路和方法。circRNAs与其他的因子如miRNA、蛋白质等的结合是特异性的, 所以可以研究考虑使用这些复合体作为标志物的可能性。另外, 通过circRNAs稳定性及特异性等特征, 应该努力去发现可被circRNA靶向的肿瘤相关miRNAs以起到治疗的作用。某些潜在的RNA病毒的circRNA可以作为肿瘤疫苗的新的抗原物质, 在体内激活或者诱导体内抗肿瘤免疫作用, 而基于细胞分泌的外泌体中的circRNA则可以被阻断来抑制肿瘤细胞的生长。研究者可以适当修改环状RNA分子, 使与癌症相关的重要结合位点沉默。还可以针对特定的分子药物来改变下游基因表达以治疗癌症。外泌体也是一个重要的研究方向, 它是由细胞内涵体分泌的小囊泡, 可通过受体介导的交互作用直接刺激靶细胞, 或通过向靶细胞转移各种生物活性分子等方式发挥其生物学功能。研究人员在人血液中检测外泌体, 发现其中的circRNAs在室温下能够在血清样品中保持至少24 h的稳定。由于外泌体易检测又稳定存在, 因此外泌体circRNAs可认为是一类具有潜在价值的肿瘤诊断生物标志物。总之, circRNA还处于起步阶段, 它们在癌症中的作用才刚刚开始被阐明。在未来的研究中, 随着科学家的努力和新方法的应用, 更多的circRNAs将会被很好地识别, 潜在的机制将被发现, 以改善对circRNAs相关疾病的诊断和治疗。了解circRNAs功能、机制及用途将成为circRNA和癌症相关研究的重要领域, 这一领域的不断探索和研究将为癌症方面的治疗提供重要的分子基础。