金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是严重威胁人类健康的主要病原菌之一, 是导致化脓性脓肿的罪魁祸首[1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是院内获得性感染首要致病菌, 可引起社区性大流行[2]; 该类菌株感染可遍及全身并有高发病率及高死亡率特点, 给家庭及社会带来严重的经济负担[3-6]。2017年2月, 世界卫生组织发布了首份急需新型抗生素的重点病原体清单, MRSA被列为第二类重点十分重要栏。我国是MRSA感染大国, 2016年全国细菌耐药检测报告显示:全国平均检出率高达34.4%。MRSA还具有多重耐药性特点, 对临床使用抗生素包括青霉素、头孢菌素、氨基糖苷、四环素、大环内酯、恶唑烷酮以及喹诺酮等均产生不同程度耐药[7-12]。万古霉素(vancomycin)被认为抵御MRSA的“最后一道防线”, 然而, 过去20年间, 中介耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin intermediate-resistant S. aureus, VISA)以及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant S. aureus, VRSA)相继被报道[13-15]。2017年7月, G20启动了国际抗生素耐药性十年研发计划。因此, 寻找结构类型新颖、作用机制独特的抗MRSA药物成为全球科学家致力于攻关的科学难题。
本课题组长期致力于从我国生物碱天然产物中寻找化学结构新颖、作用机制独特的创新药物, 由此构建了一个由天然产物衍生、自主创新的化合物库[16-24]。为了寻找结构新颖的抗菌候选物, 对此化合物库开展了表型抑菌高通量筛选, 并幸运地发现了本课题组首先构建的环化小檗碱(CBBR)衍生物——9-乙酰氧基环化小檗碱氯化物1 (图 1), 显示出较强的抗革兰阳性菌活性, 对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible S. aureus, MSSA)与MRSA、尤其对VISA均显示较好的抑制活性(表 1), 最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)介于1~16 μg·mL-1, 提示其抑菌作用机制可能不同于临床使用抗菌药物。但此化合物中9-乙酰氧基极易被体内酯酶水解, 存在药代不稳定的缺陷。
鉴于化合物1独特的化学结构以及抗MRSA活性, 本研究以其为先导物, 以抗菌活性为导向, 针对分子中的E环、B环以及9-位侧链开展了结构修饰与优化, 旨在探讨此类化合物的抗菌构效关系(structure-activity relationship, SAR)的同时, 克服酯基容易被酯酶水解的缺欠, 由此获得抗菌活性强、药代稳定的新型抗MRSA候选物。由此设计合成了14个CBBR衍生物, 包括4个小檗碱衍生物、4个白屈菜红碱衍生物以及6个9-取代CBBR衍生物, 并对代表性化合物开展了体外药代稳定性与初步安全性评价。
结果与讨论 1 化合物的合成首先, 以市售盐酸小檗碱为起始原料, 在高温负压条件下, 选择性脱除9-位甲基得2, 随后以吡啶为缚酸剂, 与相应的酰氯反应得到9-位酯取代小檗碱衍生物3a~3d (合成路线1)。其次, 以盐酸白屈菜红碱为起始原料, 在高温负压条件下, 选择性脱除甲基得到化合物4, 其与相应的酰氯在三乙胺作用下反应得到7-位酯取代白屈菜红碱化合物5a~5c (合成路线2)。最后, 以小檗碱为原料经还原、取代、环化等反应得到关键中间体CBBR, 其中环化反应为CBBR合成的关键反应。用体积比为1:3的浓盐酸与甲醇代替本课题组之前报道的2%盐酸[23]为环化条件, 不仅时间大为缩短, 而且收率由原来的38%提高到67%。随后高温负压条件下, 对CBBR选择性脱除9-位甲基, 进而在三乙胺作用下, 与相应的酰氯反应得到9-位酯类化合物9a~9f (合成路线3)。其中所合成的白屈菜红碱与CBBR衍生物均为全新结构化合物, 所有目标化合物结构经1H NMR、13C NMR以及HR-MS分析确证。目标化合物的收率、理化参数和波谱数据见表 1。
2 抗阳性菌活性SAR研究本论文评价了所有目标物对革兰阳性菌, 包括MSSA/MRSA、VISA、甲氧西林敏感/耐药的表皮葡萄球菌(methicillin-susceptible, -resistant Staphylococcus epidermidis, MSSE/MRSE)、耐万古霉素屎肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus faecium, VRE)在内的9株致病菌的体外抑菌活性(表 2)。如图 1所示, 首先, 将先导物1的B环移除获得白屈菜红碱骨架, 由此设计合成了4个白屈菜红碱衍生物4与5a~5c, 它们对所有葡萄球菌活性相当或稍弱于1, MIC介于2~8 μg·mL-1之间; 但对VRE的活性明显提高, MIC在2~16 μg·mL-1之间, 说明移除B环有利于抑菌谱的拓展。
为了克服先导物酯基极易被酯酶酶解的缺欠, 在9-位引入体积较大的刚性基团以阻碍酯酶的进攻, 分别用3-降金刚烷甲酰基、金刚烷甲酰基、金刚烷乙酰基等取代先导物1结构中体积较小的乙酰基, 获得6个9-位刚性基团CBBR的酯型衍生物9a~9f。其中, 化合物9a、9b对测试菌株抑菌活性普遍优于先导物1, MIC介于0.5~2 μg·mL-1, 特别是对VISA菌株活性是先导物的32倍, 是阳性对照药左氧氟沙星(Lev)的16倍。而9c~9f衍生物的活性均有所降低, 提示:更大取代金刚烷的引入不利于保持活性。
然后, 将先导物1的E环移走由此得到了4个9-酯取代小檗碱衍生物3a~3d, 所得化合物的抑菌活性均完全丧失, MIC > 64 μg·mL-1, 说明E环为活性必需片段。鉴于化合物9a、9b良好的抗MSSA/MRSA活性, 选两者作为代表性化合物进行下一步体外药代稳定性研究。
3 体外药代稳定性评价选择活性较好、含刚性大基团的化合物9a、9b作为代表性化合物进行体外血液药代稳定性测定, 以含有酯键的降血压药物—依那普利马来酸盐(enalapril maleate)作为阳性对照药。取SD大鼠新鲜血液, 并用新鲜的血液孵育所测化合物, 5个不同的时间点取样, LC-MS/MS方法测定目标化合物含量。实验结果如图 2所示, 9a、9b在体外全血孵育半小时后含量分别为48%、9.9%, 均明显优于相应的先导物1的含量0.4%;尤其化合物9a的血液稳定性还优于enalapril (42.6%)。结果提示:化合物9a在体内拥有相对较好的药代稳定性。
鉴于9a具有良好的体外药代稳定性, 对9a进行了初步安全性评价, 包括对A549细胞的细胞毒及尾静脉急性毒性实验。细胞毒性实验结果如图 3所示:化合物9a对A549细胞株CC50为37.5 μmol·L-1, 结合其MIC值介于0.5~1 μg·mL-1 (1~2 μmol·L-1), 治疗指数介于18.7~37.5之间。一次性给昆明小鼠尾静脉注射(i.v.)化合物9a, 剂量分别为0、20、30和40 mg·kg-1, 密切观察7天。小鼠急性毒性结果显示LD50为30 mg·kg-1, 说明化合物9a还具有相对较好的安全性。
本课题组前期研究中首次发现全新结构骨架环化小檗碱衍生物1, 具有独特的抗MSSA/MRSA活性, MIC为1~16 μg·mL-1。本研究以1为先导物, 以抗菌活性为导向, 针对分子中的E环、B环以及9-位侧链开展了结构修饰与优化, 共设计合成了14个不同类型的环化小檗碱衍生物, 包括小檗碱与白屈菜红碱衍生物。构效关系分析表明: ① E环为活性必需片段; ②移除B环抗MRSA活性有所降低, 但是抗VRE活性明显优于先导物, 拓宽了抑菌谱; ③ CBBR的9-位引入适当刚性基团有利于提高活性。其中, 化合物9a对标准与临床分离的MSSA/MRSA菌株的活性明显优于先导物1, 尤其对临床难治的MRSA、VISA均显示良好活性, MIC值介于0.5~1 μg·mL-1之间, 提示该类衍生物抑菌的作用机制可能与临床使用抗菌药物不同。同时, 9a还具有较好的体外药代稳定性与安全性特征, 值得进一步研究。研究结果为此类化合物发展成一类新型抗MRSA候选物提供了关键的科学数据。
实验部分熔点用CXM-300型精密熔点仪测定, 温度未校正; 1H NMR和13C NMR用Bruker Avance Ⅲ 500和600核磁共振仪测定, 溶剂为DMSO-d6或CD3OD; HR-MS用Autospec Ultima-TOF质谱测定仪测定; Flash柱分离纯化用Combiflash Rf 200快速制备液相; 荧光检测用ZF-20D暗箱式紫外分析仪; 薄层色谱(TLC)采用E-Merck公司预铺硅胶铝箔卷; 试剂均为分析纯。
1 化学合成 1.1 化合物3a~3d的合成在195~210 ℃负压(20~30 mmHg)下, 将小檗碱(3.71 g, 10 mmol)加热30 min得紫黑色油状物, 经5%盐酸/乙醇酸化, 减压除去溶剂。所得固体以二氯甲烷/甲醇为流动相, 经硅胶柱分离纯化得橙红色固体2 (2.85 g, 80%)。随后将化合物2 (100 mg, 0.28 mmol)溶于无水乙腈(5 mL)中, 加入吡啶(101 μL, 1.26 mmol)和相应酰氯(0.84 mmol), 40~91 ℃反应5~6 h。冷却至固体完全析出, 抽滤, 滤出固体分别用水和二氯甲烷洗涤, 即可得目标化合物3a~3d。
1.2 化合物4与5a~5c的合成在150~160 ℃负压(20~30 mmHg)下, 将白屈菜红碱(3.84 g, 10 mmol)加热3 h得棕色固体, 经5%盐酸/乙醇酸化, 减压除去溶剂。以二氯甲烷/甲醇为流动相, 经硅胶柱分离纯化得目标物4。目标物4 (100 mg, 0.27 mmol)溶于无水乙腈(5 mL)中, 加入三乙胺(170 μL, 1.22 mmol)和相应酰氯(0.81 mmol), 71 ℃反应5~6 h。冷却至固体完全析出, 抽滤, 滤饼分别用水和二氯甲烷洗涤, 得目标化合物5a~5c。
1.3 化合物9a~9f的合成将溶有硼氢化钠(0.83 g, 22 mmol)的5%氢氧化钠溶液10 mL逐滴加入至含小檗碱(7.4 g, 20 mmol)和碳酸钾(8.3 g, 60 mmol)的250 mL甲醇溶液体系中, 室温搅拌3 h, 抽滤收集析出的黄绿色固体, 滤饼依次用蒸馏水(100 mL)和80%乙醇(100 mL)洗涤, 得到黄绿色二氢小檗碱6 (7.1 g, 81%)。将6 (7.1 g, 21 mmol)溶解在160 mL乙腈中, 然后分别加入40 mL乙酸和3 mL 40%乙二醛水溶液, 加热至85~90 ℃回流6 h, 将反应液浓缩, 得到未经纯化的深红色油状物7, 加入体积比为1:3的浓盐酸与甲醇200 mL, 室温搅拌24 h, 将反应液浓缩, 以二氯甲烷/甲醇为流动相, 经硅胶柱分离纯化得橙红色关键中间体CBBR (5.6 g, 67%)。
在195~210 ℃负压(20~30 mmHg)下, 将CBBR (3.95 g, 10 mmol)加热60 min得紫黑色固体。产物经5%盐酸/乙醇酸化, 减压除去溶剂, 以二氯甲烷/甲醇为流动相, 经硅胶柱分离纯化得红色固体8 (3.5 g, 92%)。
1.3.1 方法一:化合物9a、9b和9e~9f的合成氮气保护下, 室温将二氯亚砜(3 mL)滴加到溶有相应羧酸(0.78 mmol)的二氯甲烷(4 mL)溶液中, 48 ℃回流3 h, 冷却、浓缩, 向反应体系中加入5 mL甲苯, 浓缩, 重复操作3次, 得到相应的酰氯不经分离直接用于下步反应。将化合物8 (100 mg, 0.26 mmol)和上步所得的产物混悬于干燥乙腈(5 mL)中, 加入三乙胺(163 μL, 1.17 mmol), 71 ℃反应5~6 h。冷却至固体完全析出, 抽滤, 滤饼分别用水和二氯甲烷洗, 得目标化合物9a、9b、9e~9f。
1.3.2 方法二:化合物9c、9d的合成化合物8 (100 mg, 0.26 mmol)混悬于无水乙腈(5 mL)中, 加入三乙胺(163 μL, 1.17 mmol)和相应酰氯(0.78 mmol), 71 ℃反应5~6 h。冷却至固体完全析出, 抽滤, 滤饼分别用水和二氯甲烷洗, 得目标化合物9c、9d。
2 生物实验 2.1 抗阳性菌活性MIC测定参照CLSI标准, 采用平皿二倍稀释法(agar dilution)进行药敏实验。实验菌用MH肉汤或脑心浸液增菌, 药液用MH肉汤二倍稀释成各种所需浓度, 分别加适量到平皿中, MH琼脂培养基熔化后定量注入含药液的平皿内混匀。样品终浓度分别为64、32……0.06、0.03 μg·mL-1。接种实验菌(接种量为每点1×104 cfu)后置35 ℃恒温培养18 h后观察结果, 无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为MIC。
2.2 体外药代稳定性实验实验当天取SD大鼠新鲜血液于37 ℃水浴中保温, 选enalapril为阳性对照药。用DMSO将化合物9a、9b和enalapril配置成10 mmol·L-1溶液, 后用45% MeOH/H2O稀释到100 μmol·L-1, 取2 μL稀释后的上述溶液置于98 μL新鲜血液中, 在37 ℃水浴中都分别孵育0、1、5、10、30 min, 到达设置孵育时间后, 迅速加入100 μL水和800 μL孵育终止液(含200 ng·mL-1甲苯磺丁脲和20 ng·mL-1丁螺环酮乙腈溶液), 以4 000 r·min-1离心20 min。取100 μL上清液与200 μL水混合, 振荡10 min, 随后取样用LC-MS/MS分析。
2.3 细胞毒性实验取对数生长期A549细胞制备单细胞悬液, 以每孔6×103个细胞密度接种于96孔板, 每组设置3个复孔, 同时设空白对照(仅加培养液)。待细胞密度达到50%左右, 加入相应的药物作用24 h后, 每孔加入5 mg·mL-1 MTT溶液20 μL, 继续培养4 h。每孔加入DMSO 150 μL, 振荡10 min, 使紫色结晶充分溶解, 酶标仪检测各孔吸光度(A570)值。
2.4 急性毒性实验以昆明种小鼠(18~20 g)为动物模型, 称重后随机分组, 每组10只, 雌雄各半, 分别一次性以0、20、30和40 mg·kg-1的剂量尾静脉注射给药, 密切观察动物7天内的死亡情况, 计算半数致死量(LD50)。
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