据统计, 肺癌已经成为我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤, 发病率为73.33万/年, 死亡率为61.02万/年^[1]。其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%~85%, 其中携带上皮细胞生长因子受体(EGFR)敏感型突变的肺癌患者占我国NSCLC患者的30%~40%。吉非替尼已成为EGFR敏感型NSCLC患者的一线用药, 该药虽疗效好, 但是临床用药仍受不良反应的困扰, 如皮疹、腹泻和肝毒性等^[2]。其中吉非替尼的肝毒性发生率高, 约为40%, 严重者需要停药或换药^[3]。

吉非替尼的肝毒性发生机制不清, 其体内药动学过程复杂, 其中细胞色素P450 3A4酶(CYP3A4)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGT1A1)、谷胱甘肽S转移酶(GSTM3、GSTA1)、可溶性超氧化物歧化酶(SOD1)、ATP结合盒(ABC)转运蛋白(ABCB4、ABCC4和ABCG2)均参与其生物转化与转运, 这些基因遗传多态性对药物在体内的转化、生物利用度及分布具有重要的影响^{[4, 5]}。吉非替尼作为酪氨酸激酶抑制剂(TKI), 其作用靶点为EGFR, EGFR相关信号通路中的多种信号分子如转化蛋白1 (SHC1)、信号传导及转录激活因子(STAT3)和促分裂原活化蛋白激酶1 (MAPK1)等的遗传多态性均可能影响其药物反应^{[6, 7]}。其中MAP激酶[也称为细胞外信号调节激酶(ERK)]作为多种生物化学信号的整合点, 参与多种细胞过程, 如增殖、分化、转录调节和发育, 在近来的研究中愈发受到重视。同时, 根据报道, 炎症因子在肝损伤的发生中也有一定的促进作用, 因而考察趋化因子12 (CXCL12)、白细胞介素-10 (IL-10)和白细胞介素-1A (IL-1A)等相关炎症因子的遗传多态性对吉非替尼肝毒性的影响也十分必要^[8]。

吉非替尼的肝毒性发生的具体机制仍不清楚, 但肯定是多种因素共同作用的结果, 可能与吉非替尼本身的靶向通路有关, 也可能与其在人体内的代谢和分布相关, 炎症因子在肝损伤的发生中也是不可或缺的, 因而, 本研究系统考察了参与吉非替尼体内转化过程中15种重要基因的26个单核苷酸多态性(SNP)对肝毒性的影响, 以期发现肝毒性的遗传生物标志物, 更好地指导吉非替尼的临床精准用药。

试剂与仪器  血液DNA提取试剂盒(中国天根试剂公司); CompleteiPLEX Gold Genotyping Reagent Set 384试剂盒、DNA质谱阵列基因分析系统(美国Agena Bioscience公司); Abbott Architect tacrolimus assay试剂盒、IMX全自动免疫分析仪(美国Abbott公司); Veriti梯度PCR仪(美国ABI公司)。

患者和研究设计  本研究在2015~2017年期间于中山大学肿瘤防治中心(中国广州)纳入90例NSCLC患者, 入组患者每日用药均为250 mg, 直至患者耐药, 用已验证的LC-MS/MS方法定期检测患者药物的稳态谷浓度^[9]。纳入标准为年龄≥18岁, 具有足够的血液学、肾脏和肝脏功能, 组织学或分子学诊断证实为NSCLC, 入组期间只接受吉非替尼的治疗。排除标准是患者具有无法控制的全身性疾病, 依从性差, 并接受CYP3A4或CYP3A5抑制剂, 如圣约翰草或西咪替丁的治疗。该研究经中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准。所有参与者均获得书面知情同意书。该试验在ClinicalTrials.gov上注册, 编号为NCT01994057。

毒性评估:入组患者每月进行一次体格检查和常规实验室检查(血液学和生化评估)。所有不良事件均记录在案, 并根据NCI不良事件通用标准4.03版进行分级。

基因分型  收集每名患者的外周血液3 mL, 基因组DNA通过基因组TIANGENTM TIANamp血液DNA试剂盒(DP348)提取。使用Agena®Sequenom MassArray Analyzer 4系统(MALDI-TOF平台)对26个SNPs进行分型, 其中包括吉非替尼的靶向通路的上下游相关基因: EGFR rs2293347; MAPK1 rs13515、rs13943、rs3810610; STAT4 rs2278940; STAT3 rs3744483; SHC1 rs3766920;调控吉非替尼主要代谢酶CYP3A4的基因NR1I2 rs1054191、rs3814057、rs3814058;参与吉非替尼在体内生物转化、转运与分布的相关基因: ABCC4 rs1059751、rs61967163、rs55845549; UGT1A1 rs10929303; ABCG2 rs1448784; ABCB4 rs6465112、rs6465113; GSTM3 rs1055259、rs3814309; GSTA1 rs4147615; SOD1 rs2070424;参与肝损伤相关的一些炎症因子: CXCL12 rs1065297、rs10900031、rs17881575; IL10 rs3024496; IL1A rs2856838, 系统地研究吉非替尼肝毒性的发生机制。

数据分析  所有统计分析结果均使用SPSS 21.0 (IBM^®)进行。使用Pearson χ²检验比较分类变量, 并使用Mann-Whitney U检验分析连续变量以比较两个亚组之间的平均值。功率计算由G^*power版本3.1.9.2 (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf)进行。考虑到表 1中列出的混杂因素, 如性别、年龄和体表面积(BSA), 并通过多因素Logistic回归再分析每个SNP的统计学意义。进行多因素Logistic回归分析以确定危险因素与肝毒性的相关性。使用Haploview 4.2 (Broad Institute)来确定Hardy-Weinberg平衡的偏差。在各项统计中P < 0.05即认为统计学显著。

表1(Table 1)

Table 1 Clinical characteristics of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. BSA: Body surface area; CNS: Central nervous system; ECOG: Eastern cooperative oncology group score standard; EGFR: Epidermal growth factor receptor Characteristic No. of patients Median age, years (median, [range]) 52, [32-82] Gender (male/female) 42/48 BSA, m2 (median, [range]) 1.77, [1.37-2.34] Smoke status (yes/no) 25/65 Hepatotoxicity (grade 0/1/2+) 62/11/17 CNS metastasis (yes/no) 15/75 ECOG (0–1/2–3) 0/90 EGFR mutation status (exon19 deletions/exon 21 L858R/other sensitive mutations) 34/41/15

Table 1 Clinical characteristics of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. BSA: Body surface area; CNS: Central nervous system; ECOG: Eastern cooperative oncology group score standard; EGFR: Epidermal growth factor receptor

总共有90名患者被纳入最终分析。患者临床特征如表 1所示。75位患者具有主要的EGFR敏感型突变(即外显子19缺失或外显子21 L858R突变), 15位患者携带其他致敏突变, 如外显子21 L861Q突变、外显子20插入等。90名患者的平均BSA为1.77平方米(范围为1.37~2.34平方米)。中位年龄为52岁(范围为32~82岁), 男性和女性的数量大致相当。25名(27.8%)患者是前吸烟者或现吸烟者。发生肝毒性的患者共有28名(31.1%), 发生2级以上肝毒性的患者有17名(18.9%)。对于患者的临床特征, 如性别、BSA、吸烟者、EGFR突变情况和年龄进行相关性分析后, 统计结果显示这些因素与吉非替尼诱导的肝毒性没有相关性(表 2)。

表2(Table 2)

Table 2 The association of patients' characteristics with hepatotoxicity. r: Correlation coefficient; P: P-value, P ≤ 0.05 was considered statistically significant Item Hepatotoxicity (grade) 0 vs 1+ 0, 1 vs 2+ Age r 0.079 -0.01 P 0.46 0.928 BSA r 0.08 0.005 P 0.451 0.963 Gender r -0.093 -0.004 P 0.383 0.972 CNS metastasis r -0.107 -0.014 P 0.314 0.189 EGFR mutation r 0.087 0.083 P 0.413 0.439 Smoke status r -0.095 -0.173 P 0.372 0.104

Table 2 The association of patients' characteristics with hepatotoxicity. r: Correlation coefficient; P: P-value, P ≤ 0.05 was considered statistically significant

候选SNP的基因型频率都符合文献所报道的Hardy-Weinberg平衡, 详见表 3。通过Pearson χ²检验分析每个SNP与吉非替尼所诱导肝毒性的关联性, 本研究发现肝毒性的发生与EGFR rs10228436 (P = 0.022, Co-dominant model)以及MAPK1 rs13515 (P = 0.031, Dominant model, Fisher’s exact test)相关, 而肝损害(grade≥2)与MAPK1 rs13515 (P = 0.09, Dominant model, Fisher’s exact test)相关, 其余SNP与吉非替尼的肝毒性的发生率及严重程度均无相关性(表 4)。

表3(Table 3)

Table 3 Hardy-Weinberg equilibrium (HWP) of all single nucleotide polymorphisms (SNPs) Gene SNP Allele (wide/mutation) HWP EGFR rs2293347 C/T 0.11 MAPK1 rs3810610 C/T 0.54 MAPK1 rs13515 C/T 0.77 MAPK1 rs13943 C/G 0.28 STAT4 rs2278940 C/T 0.58 STAT3 rs3744483 C/T 0.86 SHC1 rs3766920 G/A 0.71 NR1I2 rs1054191 C/G 0.93 NR1I2 rs3814057 A/C 0.15 NR1I2 rs3814058 T/C 0.12 ABCC4 rs55845549 A/C 0.13 ABCC4 rs61967163 A/G 0.44 ABCC4 rs1059751 A/G 0.72 UGT1A1 rs10929303 C/T 0.26 ABCG2 rs1448784 A/G 0.28 ABCB4 rs6465112 C/T 0.58 ABCB4 rs6465113 T/A 0.57 CXCL12 rs1065297 G/A 0.8 CXCL12 rs10900031 G/A 0.82 CXCL12 rs17881575 G/A 0.05 IL10 rs3024496 G/A 0.8 IL1A rs2856838 G/A 0.38 GSTM3 rs3814309 T/C 0.3 GSTM3 rs1055259 T/C 0.82 GSTA1 rs4147615 T/C 0.58 SOD1 rs2070424 A/G 0.57

Table 3 Hardy-Weinberg equilibrium (HWP) of all single nucleotide polymorphisms (SNPs)

表4(Table 4)

Table 4 Association between candidate SNPs and gefitinib- induced hepatotoxicity (univariate analysis). P-values between 0.05 and 0.10 were regarded as marginally suggestive of an association, whereas P ≤ 0.05 was considered statistically significant; NS means no significant different P > 0.10; #: Fisher's exact test; Φ: Dominant model; Ω: Co-dominant model;& : P-value of patients with hepatotoxicity vs patients without hepatotoxicity; θ: P-value of patients with hepatotoxicity (grade 0 + 1) vs patients with serious hepatotoxicity (grade ≥ 2) Gene SNP Genotype n H (grade) 0 1 2+ P MAPK1 rs13515 CC 54 38 8 8 0.031Φ#& CT 33 23 3 7 0.09Φ#θ TT 3 0 1 2 EGFR rs10228436 GG 20 11 6 3 0.022Ω& GA 49 39 1 9 NSθ AA 21 12 4 5

Table 4 Association between candidate SNPs and gefitinib- induced hepatotoxicity (univariate analysis). P-values between 0.05 and 0.10 were regarded as marginally suggestive of an association, whereas P ≤ 0.05 was considered statistically significant; NS means no significant different P > 0.10; #: Fisher's exact test; Φ: Dominant model; Ω: Co-dominant model;& : P-value of patients with hepatotoxicity vs patients without hepatotoxicity; θ: P-value of patients with hepatotoxicity (grade 0 + 1) vs patients with serious hepatotoxicity (grade ≥ 2)

对于表 4中P值低于0.1的所有SNP, 即MAPK1 rs13515和EGFR rs10228436, 同时纳入患者血药稳态谷浓度、性别、吸烟状况及BSA等混杂因素, 进行Logistic回归分析, 评价各SNP在综合临床因素的矫正下对肝损伤(所有等级或等级≥2)的综合作用, 结果如表 5所示。在预示吉非替尼所导致严重肝毒的Logistic预测方程中只有MAPK1 rs13515被纳入方程(OR = 9.467, 95% CI = 0.805~111.274, P = 0.074)。

表5(Table 5)

Table 5 Multivariate logistic regression analyses of candidate SNPs with hepatotoxicity Hepatotoxicity Variable P OR (95% CI) Grade 0, 1 vs 2+ MAPK1 rs13515 0.074 9.467 (0.805-111.274) Constant 0.005 0.022

Table 5 Multivariate logistic regression analyses of candidate SNPs with hepatotoxicity

从上述研究中发现, MAPK1 rs13515和EGFR rs10228436与吉非替尼导致的肝毒具有相关性, 故本研究将同时携带EGFR突变纯合型及MAPK1突变纯合型的患者纳入研究, 发现同时具有MAPK1 rs13515及EGFR rs10228436突变的患者与吉非替尼所导致的肝毒性的严重程度相关, 研究结果如表 6和7所示。考虑各种临床混杂因素进行多因素分析后, 只有MAPK1 rs13515及EGFR rs10228436共同突变这个因素被纳入了Logistic回归方程当中(P = 0.999, OR = 3.59×10⁹), 具体结果如表 7所示。

表6(Table 6)

Table 6 Association between the patients with co-mutation and gefitinib-induced hepatotoxicity (univariate analysis). P-values between 0.05 and 0.10 were regarded as marginally suggestive of an association, whereas P ≤ 0.05 was considered statistically significant. #: Fisher's exact test;& : P-value of patients with hepatotoxicity vs patients without hepatotoxicity; θ: P-value of patients with hepatotoxicity (grade 0 + 1) vs patients with serious hepatotoxicity (grade ≥ 2) Gene SNP Genotype n H (grade) 0 1 2+ P MAPK1 rs13515 TT+AA 2 0 0 2 0.101#& MAPK1 rs10228436 Other genotypes 88 61 12 15 0.034#θ

Table 6 Association between the patients with co-mutation and gefitinib-induced hepatotoxicity (univariate analysis). P-values between 0.05 and 0.10 were regarded as marginally suggestive of an association, whereas P ≤ 0.05 was considered statistically significant. #: Fisher's exact test;& : P-value of patients with hepatotoxicity vs patients without hepatotoxicity; θ: P-value of patients with hepatotoxicity (grade 0 + 1) vs patients with serious hepatotoxicity (grade ≥ 2)

表7(Table 7)

Table 7 Multivariate logistic regression analyses of patients with co-mutation with hepatotoxicity Hepatotoxicity Variable P OR (95% CI) Grade 0, 1 vs 2+ MAPK1 and EGFR (TT+AA) 0.999 3.59×109 Constant 0.999 0

Table 7 Multivariate logistic regression analyses of patients with co-mutation with hepatotoxicity

本研究发现, 吉非替尼导致肝毒性的严重程度与MAPK1 rs13515的遗传突变相关, 携带rs13515 TT基因型的患者发生严重肝毒的可能性远高于携带rs13515 CC以及CT基因型。而同时携带MAPK1 rs13515 TT基因型及EGFR rs10228436 AA基因型的患者全都发生了2级以上的肝损伤(P = 0.999, OR = 3.59×10⁹), 但是由于样本量的限制, 符合此项要求的患者只有两例, 需要后续扩大样本量进行验证。

众所周知, 由药物引发的肝毒性是许多药物无法成功上市的重要原因, 也是受到强烈关注的公共健康问题, 据报道, 迄今为止批准上市的大多数TKI都能诱导各种程度的肝损伤。除了本研究关注的吉非替尼外, 还包括厄洛替尼、帕唑帕尼、普那替尼和舒尼替尼等, 因此用药时需要时刻关注患者的肝酶情况。TKI诱发肝毒性的发作通常在开始治疗的前2个月内, 但可能会延迟, 并且通常是可逆的。与其他类别的肝毒性药物相比, 来自TKI诱导的肝毒性的死亡率是罕见的, 但可能导致诸如肝硬化的长期后果, 严重影响临床上TKI的使用^[10]。

之前有许多研究都致力于寻找可以预测TKI在治疗癌症时疗效反应和毒性的遗传标志物, 其中也不乏许多已经获得公认的权威的研究, 如拉帕替尼相关的肝损伤已经确定与包含DRB1^*07:01/DQA1^*02:01等位基因的Ⅱ类人类白细胞抗原(HLA)具有强烈的相关性^[11]。而帕唑帕尼引起的相关丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高与HFE多态性之间也具有确凿的关系^[12]。最近Spraggs等^{[13, 14]}的综述也强调了基因的遗传突变的确可以预测TKI治疗时所导致的肝脏毒性, 基因遗传突变的研究对于TKI的临床使用具有巨大的益处, 因为它将帮助研究者洞察药源性肝损伤的复杂机制, 并可以起到预测和预防的作用。

MAPK/ERK级联反应可以调节转录、翻译和细胞骨架重排, 也可以介导多种生物功能, 如细胞生长、黏附、存活和分化。也有文献报道, ERK和mTOR参与胎儿肝细胞的促有丝分裂信号传导, 调节其发育^[15]。此外也有研究提出, MAPK1/3在细胞自噬过程中发挥作用且与脂质代谢之间存在联系, MAPK1/3通过刺激ATG7依赖性自噬影响肝脏中脂质的代谢^[16]。而也有研究提示, miR-224通过与其靶基因直接结合而在肝癌细胞的细胞增殖、迁移、侵袭和抗凋亡中发挥作用, 而基因CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2和MAPK1被证实是miR-224的重要靶点^[17]。EGFR信号通路在各种类实体癌发展中发挥重要的作用^[18]。也有众多研究表明, EGFR信号系统已被确定为肝损伤反应各个阶段(从早期炎症和肝细胞增殖到纤维发生和肿瘤转化)的关键参与者, EGFR信号系统与其他信号通路进行广泛的串扰, 作为其他生长因子、细胞因子和炎症介质的真正信号枢纽^[19]。而强大的遗传数据表明, COX2之所以可以保护小鼠免受由激动性抗FAS抗体引发的致命性肝炎, 是因为其可以调控EGFR的表达^[20]。综上所述, MAPK1以及EGFR在预测吉非替尼所导致的肝损伤方面有重要意义。

本研究的主要局限性是仅针对NSCLC患者的中国人群, 而没有纳入其他种族的患者进行调查, 而且本研究仅为回顾性实验, 因此实验样本量应进一步扩大以证实结果的真实性和可信性。综上所述, 本研究中证明的MAPK1 rs13515和EGFR rs10228436基因突变是能够反映吉非替尼诱导NSCLC患者肝脏毒性的遗传标志物。实现吉非替尼个体化用药时应该考虑到本研究发现的这些有希望的生物标志物。同时, 也希望本研究能为其他研究人员为其他类似靶向药物临床试验设计和治疗策略的开创性工作提供启发。