药学学报  2018, Vol. 53 Issue (4): 585-591   PDF    
天然蕈毒碱类似物1', 2'-二-O-异亚丙基二氧乙基异噁唑啉衍生物的合成及其对Cdc25B和CD45体外抗癌和白细胞共同抗原活性筛选
穆赫塔尔·伊米尔艾山, 萨特瓦尔迪·赫力力, 王婷     
新疆大学化学与化工学院, 新疆 乌鲁木齐 830046
摘要: 从蘑菇中提取的活性物质捕蝇蕈(muscimol)、环丝氨酰(cycloserin)和鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid)都含有异噁唑药效团结构,本文以捕蝇蕈(蕈毒碱)为结构模型,采用分子重组法,通过1,3-偶极环加成反应,合成了3-(1',2'-二-O-异亚丙基二氧乙基)-5-芳基-3a,6a-二氢-4,6-二氧代氮杂茂并[3',4'-d]异噁唑啉的蕈毒碱类似物,其结构经UV-Vis、1H NMR、IR和元素分析进行了表征。对合成的化合物进行了体外药物活性筛选,发现结构中的药效团作为潜在的非共价DNA结合体,显示了不同程度的抗癌、抗炎及免疫性疾病活性。初步体外抗癌活性结果表明,当样品浓度为20 μg·mL-1时,化合物3a~3o对细胞分裂周期25B磷酸酯酶(Cdc25B)的抑制率为56.99%~99.94%,甚至当样品浓度为5 μg·mL-1时,除了3f3h3i3m3o无活性外,其余化合物的抑制率仍为66.85%~99.84%,值得进一步研究。此外,体外白细胞共同抗原(CD45)活性实验结果表明,当样品浓度为20 μg·mL-1时,除了3i无活性外,其余化合物对白细胞共同抗原CD45蛋白酪氨酸磷酸酶A具有良好的抑制活性,其抑制率为63.08%~92.09%。这些具有活性的目标化合物是潜在的Cdc25B和CD45蛋白酪氨酸磷酸酶A抑制剂,在癌症、炎性及免疫性疾病治疗方面具有很好的应用前景。
关键词: 1', 2'-二-O-异亚丙基二氧乙基异噁唑啉     合成     体外抗癌活性     白细胞共同抗原活性    
Synthesis of 1', 2'-O-isopropylidendioxyethyl isoxazoline derivatives of natural muscarinic analogs and screening its anti-cancer and leukocyte common antigen activity on Cdc25B and CD45 in vitro
IMERHASAN Mukhtar, HELIL Setiwaldi, WANG Ting     
College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046, China
Abstract: Muscimol, cycloserin and ibotenic acid which are extracted from mushroom contain isoxazole pharmacophore structure. By using muscarinic structure as a model compound and molecular recombination method, we synthesized muscarinic analogues compounds 3-(1', 2'-di-O-isopropylidenedioxyethyl)-5-aryl-3a, 6a-dihydro-4, 6-dioxopyrrolino[3', 4'-d]isoxazoline derivatives through 1, 3-dipolar cycloaddition reaction. The structures of the target compounds were confirmed by UV-Vis, 1H NMR, IR and elemental analysis. The drug activities of obtained compounds were screened in vitro. The pharmacophore in the structure is a potential non-covalent DNA binding, the compounds have anticancer activity and the leukocyte common antigen activity in a different extent. The preliminary results of in vitro anticancer test suggest that the inhibitory rates of compounds 3a-3o to Cdc25A phosphatase in cell division cycle ranged from 56.99%-99.94%; at the test concentration of 20 μg·mL-1, 3f, 3h, 3i, 3m, 3o were no inhibition activity, and the rest of the compounds shows moderate to good excellent inhibition rate from 66.85% to 99.84%, even at the concentration as low as 5 μg·mL-1. At the test concentration of 20 μg·mL-1, except compound 3i, the rest compounds' inhibition activity of against leukocyte common antigen (LCA) CD45 protein tyrosine phosphatase A, are 63.08%-92.09%. These active compounds are potential inhibitors against Cdc25A and CD45 protein tyrosine phosphatase A, which have great application prospects in the treatment of cancers and Inflammatory and immune diseases.
Key words: 1', 2'-O-isopropylidendioxyethyl isoxazole     synthesis     in vitro anticancer activity     leukocyte common antigen activity    

第一个从蘑菇捕蝇蕈(飘蕈)中提取的蝇蕈醇(蕈毒碱)[1]是天然存在的异噁唑的蝇蕈醇(muscimol)、环丝氨酰(cycloserin)、鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid)等3个衍生物之一, 其中蝇蕈醇(muscimol)具有较强的精神治疗作用。蘑菇中的有效成分蕈毒碱以异噁唑环为基本结构单元, 对其结构进行修饰所合成的类似物, 作为一类重要的杂环化合物, 不仅成了合成中的重要中间体, 且表现出了广谱药理活性和生物活性。其主要的药理活性有止痛、消炎、抗痨、抗惊厥、抗菌[2]和治疗心血管病[3]、阿尔茨海默病[4]等; 异噁唑类化合物也是农药化学家研究的热点, 现在有很多已被开发成杀菌剂、除草剂、杀虫剂等多种农用化学品。腈氧化合物与烯烃的1, 3-偶极环加成反应是制备异噁唑啉的一种非常有用的方法[5-11]。近年的研究表明, 将几个不同骨架的杂环引入同一分子中所形成的稠杂环类化合物会表现出更多样的生物活性[12-14], 如抑制细胞分裂周期磷酸酯酶Cdc25A (cell division cycle25A)、抑制人白血病细胞的生长和抗炎症性及免疫性疾病活性[15]、抗-HIV[16]等。因此对异噁唑类化合物的结构改进研究一直没有停止过。细胞分裂周期蛋白Cdc25 (cell division cyclin 25)是调控细胞周期的重要蛋白, 主要有Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C 3种亚型。大量研究证实, 在多种人类肿瘤中细胞分裂周期25B磷酸酶(Cdc25B)是过度表达的, 因此, Cdc25B被认为是新的很有潜力的抗癌治疗药物靶点。高活性、高选择性的小分子抑制剂能为研究Cdc25B在细胞通路中的生物功能和作用机制提供工具化合物, 为抗肿瘤药物研究提供药物先导物。CD45分子是第一个被确认的典型的受体型蛋白酪氨酸磷酸酶A (receptor protein tyrosine phosphatase alpha, RPTPA), 是白细胞共同抗原, 而在非造血组织细胞无表达, 并且它几乎在所有的有核白细胞表面均有表达[17], 抗CD45抑制剂的研制为白血病的靶向治疗提供新的手段, 因此, 设计、合成并开发小分子Cdc25B和CD45抑制剂已经引起了人们广泛的关注。为了更好的研究具有生物活性的两个杂环聚集在同一个分子而形成的二元稠杂环化合物的构效关系, 本研究通过N-取代苯基马来酰亚胺与α-氯代-2, 3-O-异亚丙基-D-甘油醛肟的1, 3-偶极环加成反应得到了15种新的3-(1', 2'-二-O-异亚丙基二氧乙基)-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑啉衍生物, 未见文献报道, 化合物结构经UV、1H NMR、IR和元素分析确证。原料及目标化合物的合成见合成路线1~3。

结果与讨论 1 化合物的合成

参照文献[12, 18]合成N-取代苯基马来酰亚胺(1a~1o); 参照文献[18-21]D-甘露醇(1)为起始原料分别合成1, 2:5, 6-二-O-2-异亚丙基-D-甘露醇(2)、2, 3-O-异亚丙基甘油醛(3)、2, 3-O-异亚丙基甘油醛肟(4)和α-氯代-1', 2'-二-O-异亚丙基甘油醛肟(5)。

在三乙胺的作用下, N-芳基马来酰亚胺作为亲偶体, a-氯代-1', 2'-二-O-异亚丙基甘油醛肟作为偶极体, 通过1, 3-偶极环加成反应, 得到以异噁唑环为基本环的二元稠杂环化合物3a~3o。由实验可以看出, 亲偶体N-芳基马来酰亚胺, 因其取代基不同, 导致与偶极体的环加成反应速度不同。理论上, 亲偶体结构中存在-CH3和-OCH3等供电子基时, 致使N-芳基马来酰亚胺环碳-碳双键上电子云密度增高。另外由于偶极体带有二氧杂环的强吸电子基团, 使氧化腈上电子密度减少, 增强偶极体的极性, 有利于与偶极体的1, 3-偶极环加成反应。若亲偶体结构中存在-Cl、-NO2、-CO2H和-Br等吸电子效应的基团, 致使N-芳基马来酰亚胺环碳-碳双键上电子云密度降低, 不利于加成反应的进行。但反应结果表明, 芳环上的取代基供电子性越强, 反应速度越慢。而亲偶体的芳环上连有-Cl、-NO2、-CO2H和-Br等吸电子基团, 反应速度快且产率高。推测原因可能是α-氯代肟上二氧乙基推电子效应的影响, 偶极体的碳正离子不易生成, 所以当亲偶体苯环上取代基为吸电子基时, 反应速率快; 当苯环上取代基为给电子基时, 反应速率慢。同时, 我们对不同位置的同一取代基的N-芳基马来酰亚胺进行实验, 结果表明, 取代基在邻位的异噁唑反应产率较低, 可能是因为邻位位阻大, 不利于反应进行。

Scheme1 Synthetic route of 1a-1o

Scheme 2 Synthetic route of 5

Scheme 3 Synthetic route of 3a-3o
2 波谱数据分析

1H NMR中, 化合物3a~3oδ 1.50和1.10是化合物中异亚丙基的甲基氢的吸收; 化合物3a~3oδ 7.27~4.26和5.64~3.95处出分别现了由桥头6a-H和3a-H氢的相互偶合而产生的双重峰, 偶合常数为10.8~4.0 Hz和11.6~4.8 Hz, 在δ 8.41~6.83处出现芳环的吸收峰。若分子中带有-NO2、-CO2H、-X等较强吸电子的芳基时, 双杂环骈合环系中桥头两个氢的相互偶合而产生的两个双重峰的位置向低场移。在IR谱中, 化合物3a~3o在3 109~3 036 cm-1范围内出现了芳氢的吸收峰, 在2 986~2 923 cm-1范围内出现了饱和碳氢的吸收峰, 在1 711~1 745 cm-1范围内出现了酰胺的νC=O的伸缩振动, 在1 635~1 604 cm-1范围内出现了νC=N的吸收峰, 在1 411~1 380 cm-1和695~622 cm-1出现异噁唑啉上O-N的特征吸收, Ar-O-C键的特征吸收峰分别在1 173~1 199 cm-1和1 257~1 302 cm-1范围内。

为了研究供电子基和吸电子基的引入对化合物紫外吸收的影响, 对3a~3o进行了测定。化合物3aλmax为252 nm。以3a为参照, 当分子中含有-NO2、-CO2H等吸电子基的芳基时, 由于π-π共轭产生更强的共轭体系, λmax发生较大范围的红移。若苯环上取代基为卤素, 体系产生p-π共轭, λmax红移。实验数据表明, 卤素基团在对位时, λmax红移34~35 nm; 卤素基团在邻间位时, λmax未发生红移。若苯环上对位取代不同供电子基-CH3、-OCH3, λmax均发生蓝移。

3 生物活性和构效关系

经国家新药筛选中心对化合物3a~3o进行细胞分裂周期磷酸酯酶Cdc25B抑制活性测试和白细胞共同抗原CD45抑制活性测试。表 1是目标化合物3a~3o和正矾酸钠对Cdc25A磷酸酯酶的抑制率。阳性对照物为正矾酸钠(Na3VO4), 其IC50为9.821 ± 0.838 μmol·mL-1。若化合物3a~3o分子中带有-Br、-Cl、-NO2等吸电子基团时, 该类化合物具有较强的Cdc25B抑制活性。同一个较强吸电子的基团如-Cl, 在苯环的不同位置时, 间位取代的Cdc25B抑制活性大于邻位取代衍生物; 同一个较强供电子的基团如-CH3, 在苯环的不同位置时, 间位取代的Cdc25B抑制活性大于邻位取代衍生物; 不同间位取代的基团, 基团吸电性越强, Cdc25B抑制活性越强。

Table 1 Inhibition rate of target compounds 3a-3o against Cdc25B phosphatase. aThe positive control is sodium vanadate Na3VO4, concentration (μmol·mL-1)

表 2是目标化合物3a~3o和正矾酸钠对CD45蛋白酪氨酸磷酸酶A的抑制率。阳性对照物为正矾酸钠(Na3VO4), 其IC50为18.88 ± 1.41。14个化合物都具有一定的生物活性。若化合物3a~3o苯环上取代基为吸电子基团, 其生物活性要高于取代基为供电子基的化合物。同一个较强吸电子的基团如-Cl, 在苯环的不同位置时, 间位取代的CD45抑制活性大于邻位取代衍生物; 同一个较强供电子的基团如-CH3, 在苯环的不同位置时, 间位取代的CD45抑制活性大于邻位取代衍生物。

Table 2 Inhibition rate of target compounds 3a-3o against CD45 protein tyrosine phosphatase A. The concentration of target compounds is 20 μg·mL-1. aExperimental concentration of sodium vanadate Na3VO4 (μmol·mL-1). n = 3, x± s
4 小结

本文合成的3-(1', 2'-二-O-异亚丙基乙基)-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑啉衍生物(3a~3o), 对细胞分裂周期25B磷酸酯酶(Cdc25B)和体外白细胞共同抗原(CD45)活性筛选结果表明, 如芳环上带有吸电子基团则对Cdc25B磷酸酯酶和CD45蛋白酪氨酸磷酸酶A的抑制活性大于带有推电子基团芳环的衍生物, 如芳环上带有吸电子基团, 特别是对位-Br、-NO2取代的衍生物对Cdc25B磷酸酯酶和CD45蛋白酪氨酸磷酸酶A的活性具有较显著的抑制作用。

实验部分

核磁共振仪: Inona-400 (内标TMS, 溶剂CDCl3与DMSO-d6); 红外光谱仪: Bruker Equinox 55 FT-IR (KBr压片); 元素分析仪: Perkin-Elmer 2400型; 熔点仪: Buchi B-540型(温度计未经校正); 紫外可见分光光度计:岛津UV-2450。TLC选用青岛海洋化工厂硅胶GF254, 加0.5% CMC溶液自制, 未经活化直接使用, 于紫外灯下观察或碘蒸气显色。柱色谱硅胶100~200目, 展开剂: V (二氯甲烷):V (甲醇) = 8:2~9:1。试剂均为分析纯, 三乙胺、DMSO、DMF用前重蒸处理。

1 3-(1', 2'-二-O-异亚丙基二氧乙基)-5-芳基-3a, 6a-二氢-4, 6-二氧代氮杂茂并[3', 4'-d]异噁唑啉衍生物3a~3o的合成

将13 mmol α-氯代-1', 2'-二-O-异亚丙基甘油醛肟(5)和14.3 mmol (1.1 eq.) N-芳基马来酰亚胺1a~1o溶于二氯甲烷(或者DMF)中, 在室温电磁搅拌下, 将13 mmol三乙胺用30 mL二氯甲烷(或者DMF)稀释后滴加至反应瓶中, 滴加速度30 s一滴, 反应搅拌48~90 h [用TLC鉴测反应, N-芳基马来酰亚胺的斑点变小或消失, 展开剂为: V (二氯甲烷):V(甲醇) = 9:1], 反应完毕后, 在反应液中加1 mol·L-1盐酸至中性, 分离有机层后依次用10% NaHCO3 (3×30 mL)、H2O (3×20 mL)洗涤, 有机层用硫酸钠干燥, 浓缩, 真空干燥, 所得到的固体用石油醚重结晶, 柱色谱分离[洗脱剂: V (二氯甲烷):V(甲醇) = 8:2~9:1], 得相应化合物3a~3o

3a:淡褐色固体, 444 mg, 产率29.6%。mp 154~155 ℃; Rf = 0.52 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1); [α]D20 -5.56 (c 0.036, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 252、283 nm; IR (KBr) ν: 3 067、2 986、1 714、1 617、1 598、1 499、1 456、1 386、1 290、1 196、1 072、756、695 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.41~7.36 (m, 5H, ArH), 5.54 (d, J = 9.6 Hz, 1H, 6a-H), 5.18 (dd, J = 14.0, 12.0 Hz, 1H, 1'-H), 4.99 (d, J= 5.6 Hz, 1H, 3a-H), 4.27 (dd, J = 14.0, 6.8 Hz, 1H, 2'-Ha), 4.11 (dd, J = 14.0, 6.8 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.47, 1.45 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H16N2O5: C 60.75, H 5.10, N 8.86; Found: C 61.04, H 4.82, N 8.52。

3b:棕红色固体, 371 mg, 产率37.1%。mp 144~146 ℃; Rf = 0.57 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1); [α]D20 +2.38 (c 0.042, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 249、283 nm; IR (KBr) ν: 3 036、2 924、1 712、1 619、1 514、1 454、1 387、1 287、1 171、1 039、775、663 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.21~6.84 (m, 4H, ArH), 4.26 (m, 1H, 6a-H), 4.12 (dd, J = 6.8, 7.2 Hz, 1H, 1'-H), 3.95 (d, J = 4.8 Hz, 1H, 3a-H), 3.93 (dd, J = 5.2, 9.2 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.64 (m, 1H, 2'-Hb), 2.38 (s, 3H, CH3) 1.42, 1.41 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C17H18N2O5: C 61.81, H 5.49, N 8.48; Found: C 62.00, H 5.32, N 8.23。

3c:红褐色固体, 404 mg, 产率33.7%。mp 113~114 ℃; Rf = 0.53 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1); [α]D20 -5.26 (c 0.038, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 251、282 nm; IR (KBr) ν: 3 079、2 935、1 711、1 609、1 514、1 466、1 443、1 393、1 301、1 252、1 109、775、666 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.38~6.83 (m, 4H, ArH), 5.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H, 6a-H), 4.25 (dd, J = 10.0, 7.2 Hz, 1H, 1'-H), 3.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 3a-H), 3.83 (s, 3H, OCH3), 3.19 (dd, J = 9.6, 10.0 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.00 (dd, J = 5.2, 10.0 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.44, 1.42 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C17H18N2O6: C 58.96, H 5.24, N 8.09; Found: C 59.29, H 5.33, N 8.23。

3d:粉红色固体, 348 mg, 产率31.6%。mp 144~145 ℃; Rf = 0.48 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1); [α]D20+21.15 (c 0.052, DMSO); UV-vis (CH3OH) λmax: 286 nm; IR (KBr) ν: 3 101、2 923、1 715、1 615、1 535、1 494、1 459、1 385、1 277、1 194、1 092、759、675 cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.95~7.33 (m, 4H, ArH), 6.12 (d, J = 5.2 Hz, 1H, 6a-H), 5.95 (dd, J = 5.6, 6.8 Hz, 1H, 1'-H), 5.04 (d, J = 5.6 Hz, 1H, 3a-H), 4.46 (dd, J = 6.8, 8.8 Hz, 1H, 2'-Ha), 4.26 (dd, J = 6.0, 9.6 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.50, 1.42 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15ClN2O5: C 54.79, H 4.31, N 7.99; Found: C 54.39, H 4.24, N 7.61。

3e:红褐色固体, 298 mg, 产率37.2%。mp 207~208 ℃; Rf = 0.44 (CH2Cl2/CH3OH, 8.5:1.5); [α]D20 -15.79 (c 0.038, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 249、282 nm; IR (KBr) ν: 3 097、2 923、1 716、1 614、1 534、1 491、1 462、1 382、1 302、1 188、1 070、720、635 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.63~7.15 (m, 4H, ArH), 5.54 (d, J = 5.2 Hz, 1H, 6a-H), 5.07 (dd, J = 6.4, 6.8 Hz, 1H, 1'-H), 4.38 (d, J = 5.2 Hz, 1H, 3a-H), 4.26 (dd, J = 6.4, 6.4 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.87 (dd, J = 5.2, 6.4 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.46, 1.42 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15Br N2O5: C 48.63, H 3.83, N 7.09; Found: C 48.20, H 4.00, N 7.17。

3f:砖红色固体, 323 mg, 产率29.4%。mp 85~86 ℃; Rf = 0.47 (CH2Cl2/CH3OH, 8.5:1.5); [α]D20 -77.08 (c 0.048, DMSO); UV-vis (CH3OH) λmax: 287 nm; IR (KBr) ν: 3 085、2 929、1 715、1 604、1 512、1 458、1 389、1 292、1 199、1 097、758、666 cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.95~7.15 (m, 4H, ArH), 6.11 (d, J = 4.0 Hz, 1H, 6a-H), 5.97 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 1H, 1'-H), 5.04 (d, J = 5.2 Hz, 1H, 3a-H), 4.63 (dd, J = 7.2, 7.2 Hz, 1H, 2'-Ha), 4.45 (dd, J = 5.2, 6.4 Hz, 1H, 2'-Hb), 2.85, 2.73, [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15FN2O5: C 57.48, H 5.38, N 8.38; Found: C 56.96, H 5.20, N 8.50。

3g:红褐色固体, 322 mg, 产率24.8%。mp 163~164 ℃; Rf = 0.561 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1); [α]D20 -2.778 (c 0.038, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 252、283 nm; IR (KBr) ν: 3 067、2 924、1 718、1 617、1 479、1 438、1 385、1 284、1 184、1 049、753、688 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.33~7.26 (m, 4H, ArH), 5.34 (d, J = 6.8 Hz, 1H, 6a-H), 5.30 (dd, J = 6.0, 7.6 Hz, 1H, 1'-H), 4.32 (d, J = 5.6 Hz, 1H, 3a-H), 4.22 (dd, J = 5.6, 8.8 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.88 (dd, J = 8.0, 8.0 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.39, 1.35 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15BrN2O5: C 48.63, H 3.83, N 7.09; Found: C 48.27, H 3.72, N 6.84。

3h:红褐色固体, 456 mg, 产率30.4%。mp 138~139 ℃; Rf = 0.83 (C6H6/CH3OH/HAc, 2:2:1); [α]D20 +12.500 (c 0.008, DMSO-d6); UV-vis (CH3OH) λmax: 294 nm; IR (KBr) ν: 3 367、3 054、2 957、1 717、1 605、1 568、1 411、1 272、1 173、1 051、778、662 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CF3COOD) δ: 8.41~7.71 (m, 4H, ArH), 7.27 (d, J = 7.6 Hz, 1H, 6a-H), 6.66 (dd, J = 6.8, 5.6 Hz, 1H, 1'-H), 5.51 (d, J = 7.6 Hz, 1H, 3a-H), 4.53 (dd, J = 6.4, 6.4 Hz, 1H, 2'-Ha), 4.34 (m, 1H, 2'-Hb), 2.50, 2.30 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C17H16N2O7: C 56.67, H 4.48, N 7.77; Found: C 57.27, H 4.26, N 7.50。

3i:粉红色固体, 295 mg, 产率16.4%。mp 139~141 ℃; Rf = 0.53 (CH2Cl2/CH3OH, 8:2); [α]D20 -10.870 (c 0.046, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 254、283 nm; IR (KBr) ν: 3 063、2 925、1 712、1 610、1 495、1 462、1 380、1 287、1 199、1 089、751、680 cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.40~7.22 (m, 4H, ArH), 6.18 (d, J = 7.6 Hz, 1H, 6a-H), 5.92 (dd, J = 7.6, 6.4 Hz, 1H, 1'-H), 5.03 (m, 1H, 3a-H), 4.67 (dd, J = 7.6, 10 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.76 (dd, J = 6.4, 10.8 Hz, 1H, 2'-Hb), 2.11 (s, 3H, CH3), 1.26, 1.24 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C17H18N2O5: C 61.81, H 5.49, N 8.48; Found: C 61.57, H 5.29, N 8.13。

3j:黑色固体, 281 mg, 产率18.7%。mp 213~214 ℃; Rf = 0.59 (CH2Cl2/CH3OH, 8:2); [α]D20 -25.000 (c 0.008, DMSO); UV-vis (CH3OH) λmax: 292 nm; IR (KBr) ν: 3 109、2 923、1 720、1 608、1 589、1 489、1 438、1 384、1 274、1 183、1 104、738、658 cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.95~7.34 (m, 4H, ArH), 6.62 (m, 1H, 6a-H), 5.36 (m, 1H, 1-H), 4.72 (d, J = 5.6 Hz, 1H, 3a-H), 4.02 (dd, J = 5.6, 20 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.34 (dd, J = 19.6, 20 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.16, 1.15 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15N3O7: C 53.19, H 4.18, N 11.63; Found: C 53.43, H 4.09, N 11.93。

3k:粉红色固体, 312 mg, 产率20.8%。mp 169~171 ℃; Rf = 0.55 (CH2Cl2/CH3OH, 9:1); [α]D20 -9.091 (c 0.044, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 252、283 nm; IR (KBr) ν: 3 050、2 923、1 714、1 610、1 592、1 492、1 458、1 381、1 285、1 195、1 064、780、691 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.37~7.14 (m, 4H, ArH), 5.22 (d, J = 6.0 Hz, 1H, 6a-H), 4.79 (dd, J = 7.2, 9.2 Hz, 1H, 1'-H), 4.16 (d, J = 6.0 Hz, 1H, 3a-H), 3.97 (dd, J = 7.2, 6.4 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.79 (dd, J = 9.2, 6.4 Hz, 1H, 2'-Hb), 2.38 (s, 3H, CH3), 1.30, 1.25 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C17H18N2O5: C 61.81, H 5.49, N 8.48; Found: C 61.36, H 5.74, N 8.80。

3l:棕红色固体, 381 mg, 产率25.4%。mp 172~174 ℃; Rf = 0.59 (CH2Cl2/CH3OH, 8.1:1.5); [α]D20 -12.500 (c 0.008, DMSO); UV-vis (CH3OH) λmax: 303 nm; IR (KBr) ν: 3 084、2 924、1 718、1 613、1 525、1 497、1 380、1 257、1 175、1 014、749 (m)、688 cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.75~7.66 (m, 4H, ArH), 5.32 (m, 1H, 6a-H), 4.24 (m, 1H, 1-H), 4.16 (d, J = 15.6 Hz, 1H, 3a-H), 3.72 (m, 1H, 2'-Ha), 3.34 (dd, J = 20.4, 19.6 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.35, 1.31 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15N3O7: C 53.19, H 4.18, N 11.63; Found: C 53.38, H 4.23, N 11.32。

3m:砖红色固体, 269 mg, 产率17.9%。mp 140~142 ℃; Rf = 0.49 (CH2Cl2/CH3OH, 8.5:1.5); [α]D20 -11.905 0 (c 0.042, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 252 nm; IR (KBr) ν: 3 060、2 924、1 721、1 620、1 593、1 485、1 442、1 386、1 290、1 196、1 063、754、688 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.43~7.26 (m, 4H, ArH), 5.35 (m, 1H, 6a-H), 5.24 (dd, J = 11.2, 14.8 Hz, 1H, 1'-H), 4.30 (d, J = 11.6 Hz, 1H, 3a-H), 4.20 (dd, J = 12.0, 5.2 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.88 (dd, J = 15.6, 4.8 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.25, 1.00 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15ClN2O5: C 54.79, H 4.31, N 7.99; Found: C 54.43, H 4.11, N 7.42。

3n:红褐色固体, 403 mg, 产率40.3%。mp 150~151 ℃; Rf = 0.471 (CH2Cl2/CH3OH, 4.5:1); [α]D20 +4.762 (c 0.042, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 252、282 nm; IR (KBr) ν: 3 074、2 923、1 714、1 618、1 540、1 480、1 435、1 381、1 272、1 188、1 072、741、622 cm-1; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.97~7.31 (m, 4H, ArH), 5.35 (m, 1H, 1'-H), 4.29 (d, J = 6.4 Hz, 1H, 6a-H), 4.08 (d, J = 6.4 Hz, 1H, 3a-H), 2.85 (dd, J = 17.2, 12.6 Hz, 1H, 2'-Ha), 2.04 (dd, J = 6.8, 13.2 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.46, 1.43 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C16H15ClN2O5: C 54.79, H 4.31, N 7.99; Found: C 54.40, H 4.49, N 7.69。

3o:土黄色固体, 369 mg, 产率28.4%。mp 170~1 712 ℃; Rf = 0.80 (CH3OH/H2O, 2:8); [α]D20 -17.544 (c 0.006, CHCl3); UV-vis (CH3OH) λmax: 304 nm; IR (KBr)ν: 3 405、3 080、2 927、1 745、1 635、1 511、1 454、1 385、1 264、1 089、1 061、760、670 cm-1; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.04~7.87 (m, 4H, ArH), 7.09 (d, J = 10.8 Hz, 1H, 6a-H), 6.36 (dd, J = 20.0, 12.8 Hz, 1H, 1'-H), 5.64 (d, J = 11.2 Hz, 1H, 3a-H), 4.23 (dd, J = 20.8, 18 Hz, 1H, 2'-Ha), 3.76 (dd, J = 12.4, 18.0 Hz, 1H, 2'-Hb), 1.39, 1.37 [2s, 3H, each C(CH3)2]; Anal. Calcd. for C17H16N2O7: C 56.67, H 4.48, N 7.77; Found: C 56.40, H 4.77, N 7.34。

2 生物活性测试

Cdc25B磷酸酯酶是蛋白酪氨酸磷酸酯酶中一类双特异性磷酸酯酶, 它在许多肿瘤细胞中过度表达, 是有效的抗癌药物靶点。实验中邻甲基荧光磷酸酯OMFP (o-methyl fluorescence phosphate)作为荧光底物使用, 观察化合物3a~3o对重组酶活性的抑制。OMFP水解产物邻甲基荧光素OMF (o-methyl fluo rescence)在被485 nm激发光激发后可发射波长为530 nm的可检测荧光信号, 从而观察酶的活性变化, 化合物对其活性的抑制率按公式(1)计算。首先计算酶初速度期内单位时间光吸收强度的增量(单位: O.D./min), 以此代表酶的初速度, 然后依据公式(1)分别计算样品(3a~3o)对酶活性的抑制率(%)。

CD45又称为白细胞共同抗原(leukocyte common antigen, LCA), 是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)家族成员。它是一种单链跨膜糖蛋白, 广泛存在于造血系细胞中, CD45已成为炎性及免疫性疾病潜在的新型药物作用分子靶点。实验中对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenyl phosphate, pNPP)为底物使用, 采用光吸收法, 在96孔透明平底微孔板中检测酶活性。底物pNPP经CD45水解得到的产物pNP在405 nm处有最大光吸收。通过微孔板检测器监测405 nm处光吸收强度的变化, 反映化合物对酶活性的抑制效果, 按公式1分别计算样品(3a~3o)对酶活性的抑制率(Inhibition, %)。

$ {\rm{Inhibition (\% )}} = \frac{{{\nu _{{\rm{DMSO}}}}-{\nu _{{\rm{Sample}}}}}}{{{\nu _{{\rm{DMSO}}}}}} \times 100\% $ (1)

其中νSample表示加药组的初速度, νDMSO表示DMSO组(即不加药组)的初速度, 初步筛选选择的纯化合物浓度为20 μg·mL-1

致谢: 本工作中化合物的体外抗肿瘤活性, 与白细胞共同抗原CD45酶的抑制活性测试由国家新药筛选中心完成。
参考文献
[1] Dannhardt G, Kiefer W, Lambrecht G, et al. Regioisomeric 3-, 4- and 5-aminomethyl isoxazoles:synthesis and muscarinic activity[J]. Eur J Med Chem, 1995, 30: 839–850. DOI:10.1016/0223-5234(96)88303-6
[2] Lin ST, Kuo SH, Yang FM. Reaction of halogenated cyclo-propanesand nitrosyl cation:preparation of isoxazoles[J]. J Org Chem, 1997, 62: 5229–5231. DOI:10.1021/jo962297i
[3] Wittenberger SJ. An efficient synthesis of the cholinergic channel activator ABT2418[J]. J Org Chem, 1996, 61: 356–358. DOI:10.1021/jo9509723
[4] Rerine R, Michael S, Sabine L. Short access to 3-alkoxy isoxazole-5-carbaldehydes and 3-hydroxy isoxazole 5-car-baldehyde[J]. Eur J Org Chem, 1998, 3: 473–476.
[5] Bathich Y, Imerhasan M, Henneboehle M. N-Methylisoxa-zolinium Salts-an Inconspicuous Class of Compounds with High Potential for Organic Synthesis[C]. Germany: The 6th Iminiumsalz-Tagung, Stimpfach-Rechenberg, 2003: 99-107.
[6] Chiachio U, Casuscelli F. Stereoslective control in 1, 3-dipolar cycloaddition of nitrones to substituted system[J]. Tetrahedron, 1994, 50: 6671–6680. DOI:10.1016/S0040-4020(01)89695-2
[7] Jaeger V, Colinas PA. In Synthetic Applications of 1, 3-Dipolar Cycloaddtion Chemistry Toward Heterocycles and Natural Products[M]. New York: John Wiley & Sons Inc Press, 2002: 361-472.
[8] Fisera F, Ondrus V, Kuban J, et al. Steroselective 1, 3-dipolar cycloadditioans to heterocyclic compounds[J]. J Heterocycl Chem, 2000, 37: 551–556. DOI:10.1002/jhet.v37:3
[9] Frey W, Imerhasan M, Bathich Y, et al. Crystal structure of (5S, 8S)-8-hydroxymethyl-1-methyl-2, 7-dioxa-1-aza-spiro[4, 4] nonan-6-one[J]. New Cryst Struct, 2005, 220: 153–154.
[10] Huisgen R. Kinetics and mechanism of 1, 3-dipolar cycload-dition[J]. Angew Chem (Int Ed Engl), 1963, 2: 633–645. DOI:10.1002/(ISSN)1521-3773
[11] Jaeger V, Grund H, Buss W. Isoxazolines-key intermediates for syntheses of some naturally occurring amino compounds[J]. Bull Soc Chem Belg, 1983, 92: 1039–1054.
[12] Hudabergen A, Abdurashid A, Imerhasan M, et al. Inhibitory activity of dioxy-pyrrolino[3', 4'-d] isoxazoline derivatives containing (1', 2'-O-cyclohexylidendioxyethyl) against Cdc25A and CD45[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 1209–1214.
[13] Abdurexit A, Imerhasan M, Osman K, et al. Synthesis of novel dioxo-pyrrolino[3, 4-d]isoxazole derivatives[J]. Chin J Syn Chem (合成化学), 2009, 17: 337–341.
[14] Agirbas H, Güner S, Budak F, et al. Synthesis and structure antibacterial activity relationship investigation of isomeric 2, 3, 5-substituted perhydropyrrolo[3, 4-d] isoxazole-4, 6-diones[J]. Bioorg Med Chem, 2007, 15: 2322–2333. DOI:10.1016/j.bmc.2007.01.029
[15] Imerhasan M, Osman K, Muhammad T, et al. Synthesis and bioactivity of containing carboxyl or ester groups of novel pyrrolino[3', 4'-d] isoxazole derivatives[J]. Chin J Appl Chem (应用化学), 2008, 25: 931–936.
[16] Xiang Y, Schinazi RF, Zhao K. Synthesis of[3.3.0] bicyclic isoxazolidinyl nucleosides[J]. Bioorg Med Chem Lett, 1996, 13: 1475–1478.
[17] Pagel JM, Appelbaum FR, Eary JF, et al. I-anti-CD45 antibody plus busulfan and cyclophosphamide before allogeneic hema-topoietic cell transplantation for treatment of acute myeloid leukemia in first remission[J]. Blood, 2006, 107: 2184–2191. DOI:10.1182/blood-2005-06-2317
[18] Wang T. Synthesis and Bioactive Research of Novel Isoxa-zoline and N-methylisoxazolinium Salts (新型异噁唑啉和N-甲基异噁唑啉盐衍生物的合成和生物活性的研究)[D]. Urumqi: Xinjiang University, 2010.
[19] Zarbin PG, Princival JL, dos Santos AA, et al. Synthesis of (S)-(+)-2-methyl-4-octanol:male-specific compound released by sugarcane weevil Sphenophorus levis (Coleoptera:Curcu-lionidae)[J]. J Braz Chem Soc, 2004, 15: 331–334. DOI:10.1590/S0103-50532004000200028
[20] Schmid CR, Bryant JD. Synthesis of 2, 3-O-isopropylidene-D-glyceraldehyde in high chemical and optical purity:obser-vations on the development of a practical bulk process[J]. J Org Chem, 1991, 56: 4056–4058. DOI:10.1021/jo00012a049
[21] Liu KC, Shalton BR, Howe RK. A particulary convenient preparation of benzohydroximinoyl chlorides (nitrile oxide precursors)[J]. J Org Chem, 1980, 45: 3916–3918. DOI:10.1021/jo01307a039