白木香(Aquilaria sinensis)是我国特有而珍贵的药用植物^[1], 也是国产名贵药材沉香的唯一正品植物来源, 已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ^[2]和国家濒危二级保护植物^[3]。沉香是我国传统名贵中药, 具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效, 对于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等有显著疗效^[1], 药理研究表明, 沉香具有消化系统和中枢神经系统的保护作用。另外, 沉香是一种名贵香料, 具有龙涎香与檀香混合物的香味, 至今仍旧无法复制这种香味^[4]。健康的白木香并不产生沉香, 只有通过自然因素(雷劈、火烧、虫蛀等)或者人为因素(砍伤、打洞、接菌等)的作用才能形成沉香, 但是沉香形成的分子机制一直没有揭示, 严重制约高效人工结香技术的建立^[5]。化学成分分析结果表明, 倍半萜类物质与苯乙基色酮类物质是决定沉香品质的主要化学成分^[6], 文献报道茉莉酸甲酯能够明显诱导白木香愈伤组织与悬浮细胞产生倍半萜类物质^{[7, 8]}, 而盐胁迫能够诱导白木香悬浮细胞及愈伤组织中苯乙基色酮物质的产生^[9], 因此沉香结香机制与茉莉酸途径及植物防御反应密切相关。

茉莉酸(jasmonic acid, JA)及其挥发性甲酯衍生物茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate, MeJA)和氨基酸衍生物统称为茉莉酸类物质(jasmonates, JAs), 对植物的生长发育、系统防御以及次生代谢产物的合成起着关键的调控作用。丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase, AOC)是JA合成中的关键酶, 它能够特异性地环化催化丙二烯氧化物[12, 13(S)-epoxylin-olenic acid]进行结构重排, 并生成茉莉酸产物的前体10, 11-二氢-12-氧植物二烯酸(12-oxo-phytodienoic acid, OPDA)^[10], 其活性对于代谢中间产物最终转化成茉莉酸产物至关重要^[11]。研究表明, AOC基因的功能与植物的胁迫反应相关。Stenzel等^[12]研究发现番茄叶片受伤诱导后, 诱导维管束中AOC表达促进JA的合成, 通过JA的增加来调节AOC依赖的局部伤反应, 说明AOC在植物伤害防御反应中起到关键作用。Yamada等^[13]和Pi等^[14]分别发现红树与喜树中的AOC基因具有很好的耐盐性, 说明AOC基因能够提高植物的抗逆性。因而分离丙二烯氧化物环化酶的编码基因并分析其表达对于理解其在植物生长发育和逆境胁迫中的作用具有重要意义。目前在玉米^[15]、番茄^[16]、拟南芥^[17]等植物中克隆得到了AOC基因并对其相关功能进行了研究, 在白木香中, 茉莉酸甲酯参与沉香特征性成分—倍半萜类物质的生物合成调控。但目前白木香AsAOC基因的克隆、蛋白原核表达以及生长发育及防御反应尚未见文献报道, 因此研究白木香中AsAOC的生物信息学、原核表达及在非生物胁迫和激素处理下的表达方式有利于丰富AOC的生物合成功能及在植物防御反应中的重要作用, 同时有利于阐明白木香结香机制。本研究中通过分析高通量测序结果, 在白木香愈伤组织中克隆得到一条AOC基因的cDNA全长, 命名为AsAOC1, 并对其序列进行了生物学信息分析, 通过荧光定量PCR技术分析其在不同组织中的表达差异, 并研究其在受到盐、干旱、低温及重金属胁迫和外源茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸和赤霉素处理不同时间愈伤组织中的表达及积累情况, 为研究沉香结香机制及植物的防御反应机制奠定基础。

材料及处理   本实验使用从广州移植、现种植于北京中医药大学中药现代研究中心3年的白木香, 于6月份采集新鲜的根、茎、茎尖及叶提取总RNA, 检测AsAOC1基因在不同器官中的特异性表达。利用白木香叶片和茎尖诱导的愈伤组织, 选取长势相同的白木香愈伤组织, 分别经NaCl (150 mmol·L^-1)、低温(4 ℃)、CdCl₂ (500 µmol·L^-1)、甘露醇(750 mmol·L^-1) 4种非生物胁迫及脱落酸(ABA) (150 µmol·L^-1)、茉莉酸甲酯(MeJA) (150 µmol·L^-1)、赤霉素(GA3) (150 µmol·L^-1)、水杨酸(SA) (150 µmol·L^-1) 4种外源激素处理, 在处理后0、12、24、36、48 h提取RNA作为样品检测AsAOC1基因在各种处理下的表达差异。所用菌种为大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、BL21 (DE3), 购自天根生物科技有限公司; pET28a (Novagen)由本实验室保存。

白木香组织及愈伤组织中总RNA的提取和cDNA的合成   按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab, 中国)实验操作步骤进行植物总RNA提取, 利用NanoDrop 2000C检测RNA浓度, 同时利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和质量。利用Sigma公司的反转录酶M-MLV将白木香的总RNA反转录为第一链(cDNA), 反转录的条件按照说明书进行。

AsAOC1基因序列全长克隆  从白木香转录组高通量测序结果中获得1个由表达序列标签拼接而成的序列, 经注释分析发现为具有完整开放阅读框的AsAOC基因, 依据该序列利用Primer软件设计两端特异性引物(AOC-1, AOC-2), 引物序列见表 1。以白木香总RNA的反转录产物为模板, 按照下列体系对白木香中AsAOC1基因进行扩增: cDNA 1 µL、LA Taq (2.5 U·µL^-1) 0.5 µL、10×LA Taq buffer 5 µL、dNTP Mix (2.5 mmol·L^-1) 4 µL、10 µmol引物各1 µL, 终体积为50 µL。反应: 94 ℃预变性5 min; 然后进行35个循环(94 ℃ 40 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s), 循环结束后72 ℃延伸反应10 min, 4 ℃保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 利用Axygen DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。将回收后的PCR产物与pMD19-T连接, 转化到DH5α菌株, 在氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选, 并经过菌落PCR检测后送上海英潍捷基公司测序。

表1(Table 1)

表 1 Primers sequences Primer role Primer name Primers sequence (5'-3') AOC-1 ATGGCTTGCTCAAGCTCGGCCCT Sequence AOC-2 TTAATCGGTGAAATTGGCGATGG Amplification AOC-5B CGCGGATCCATGGCTTGCTCAAG CTCGGCCCT AOC-3X CCGCTCGAGTTAATCGGTGAAAT TGGCGATGG AOC-3 AGACTACGGTCACATCTCTG qRT-PCR AOC-4 AGGTAGAAGGTGTAGAAGAGC GAPDH-1 CTGGTATGGCATTCCGTGTA GAPDH-2 AACCACATCCTCTTCGGTGTA

表 1 Primers sequences

白木香AsAOC1生物信息学分析   通过在线软件ProtParam预测蛋白结构, 分析目的基因编码蛋白质的氨基酸组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点及稳定性等参数; 采用SignalP 4.1 Server进行细胞定位预测; 通过ExPASY中的SOPMA工具分析蛋白质序列的二级结构; 利用SWISS-MODEL Workspace在线分析软件构建蛋白质三级结构模型; 利用软件TMHMM 2.0进行蛋白质跨膜结构分析; 将所获得的AsAOC1基因编码的氨基酸序列在GenBank数据库中进行Blast P对比分析, 利用DNAMAN对其他物种的AsAOC1基因编码的氨基酸序列进行同源性分析; 通过MEGA 6.0软件构建Neighbor-joining系统进化树, 进化距离的计算采用泊松校正法, Bootstrap重复次数为1 000次。

AsAOC1原核表达载体的构建及异源表达   利用引物AOC-5B和AOC-3X (表 1)扩增AsAOC1基因全长, 用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切包含有目的基因AsAOC1的PCR产物以及表达载体pET28a, 酶切产物纯化后, 利用T4 DNA连接酶, 将酶切PCR产物与酶切载体连接, 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取经扩增筛选、测序鉴定正确的单克隆; 提取质粒pET28a-AsAOC1, 将重组质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。挑取单菌落接种于含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LB液体培养基中, 37 ℃活化过夜; 活化菌液按1:100比例加入到适量新鲜含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LB液体培养基中, 37 ℃振荡培养至OD₆₀₀达0.6左右, 加IPTG至终浓度0.8 mmol·L^-1。先180 r·min^-1, 37 ℃振荡培养至OD₆₀₀达0.4~0.6, 调节温度至18℃振荡培养16 h诱导AsAOC1过度表达; 4 ℃, 12 000 r·min^-1离心收集大肠杆菌菌体之后, 悬浮于40 mmol·L^-1 KPB缓冲液(pH 7.9, 含有100 mmol·L^-1 NaCl, 5 mmol·L^-1咪唑)中。将菌体置于冰上, 用超声破碎仪(Colo Parmer)来破碎细胞, 破碎液高速离心30 min以上。取上清液, 利用镍离子亲和色谱柱纯化AsAOC1蛋白, 先以20 mmol·L^-1 KPB缓冲液(pH 7.9, 含有500 mmol·L^-1 NaCl和40 mmol·L^-1咪唑)洗脱以去除杂蛋白, 再以15 mmol·L^-1 KPB缓冲液(pH 7.5, 含10%甘油和500 mmol·L^-1咪唑)洗脱目的蛋白, 利用SDS-PAGE检测重组蛋白表达。

白木香AsAOC1基因在不同组织和不同的冷胁迫时间的表达分析   利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)的方法检测白木香不同组织中AsAOC1基因表达情况和不同胁迫处理和激素处理时间的表达情况。分析使用SYBR Green Ⅰ荧光染料法, 在qRT-PCR仪上进行。选取白木香GAPDH基因作为目标基因定量表达的内参基因, 引物序列见表 1。每个样品设3个重复, 重复3次。反应体系中含有10 µL STBR Premix Ex Taq酶、上下游引物(10 µmol·L^-1)各0.4 µL、模板0.5 µL, 总体系为20 µL。反应程序是: 95 ℃预变性3 min, 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火/延伸30 s (每次循环后采集荧光), 40个循环后, 95 ℃变性10 s, 65~95 ℃做熔解曲线分析, 每个温度以每步0.5 ℃上升, 每个温度停留5 s。根据溶解曲线判断RT-PCR产物的特异性, 相对定量分析采用2^-ΔΔCt方法进行分析。

根据白木香愈伤组织转录组测序结果, 以白木香愈伤组织的cDNA为模板进行扩增, 利用PCR方法进行扩增后得到约750 bp片段, 扩增结果见图 1, 将PCR产物连接到pMD19-T载体上, 测序结果经过NCBI的BLAST比对, 确定该扩增产物是AOC基因的全长, 基因命名为AsAOC1, 其序列长度为753 bp, 编码251个氨基酸。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Cloning of AsAOC1 gene from Aquilaria sinensis calli. M: DNA marker; 1: PCR product of AsAOC1 gene

通过Protparam软件预测AsAOC1基因编码的蛋白的理化性质。推测AsAOC1编码的蛋白分子式为C₁₂₄₁H₁₉₃₁N₃₂₅O₃₆₆S₈, 相对分子质量为27 516.42, 理论等电点为8.85, 不稳定系数Ⅱ为50.09, 属于不稳定蛋白, 总平均亲水性GRAVY为-0.283, 为亲水性蛋白; 通过蛋白质亚细胞定位软件SignalP 4.1 Server预测结构表明, 白木香AsAOC1蛋白主要定位于细胞质。利用TMHMM 2.0预测白木香AsAOC1的跨膜区域, 预测结果表明AsAOC1没有跨膜区域。

利用ExPASY中的SOPMA工具预测AsAOC1基因编码蛋白的二级结构, 结果显示AsAOC1蛋白的二级结构由46.80%的随机卷曲(random coil)、21.20%的α-螺旋(α-helices)、25.60%的延伸链(extended strand)和6.4%的β-折叠(β-turn)组成(图 2), 推测随机卷曲是其最大量的二级结构元件, 而α-螺旋、延伸链和β-折叠散布于整个蛋白中。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Predicted secondary structure of AsAOC1 protein with SOPMA. α: α-helices; β: β-turn; E: Extended strand; R: Random coil

将白木香AsAOC1的氨基酸序列通过SWISS-MODEL Workspace在线分析软件建立了AsAOC1的三维结构模型, 选择拟南芥AOC的结构模型为模板, 对白木香AsAOC1的结构进行预测, 结果表明, 白木香AsAOC1与拟南芥AOC一致性为64.74%, 具有参考价值。具体三维结构如图 3所示。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 The deduced three-dimensional structure of AsAOC1 protein

将白木香AsAOC1氨基酸序列与GenBank中其他植物中的AOC氨基酸序列进行比对, 通过DNAMAN软件与多种植物进行多序列比对分析(图 4), 发现AsAOC1含有1个高度保守的allene-ox-cyc结构和8个β延伸连(图 4中用箭头标出), 并且还含有保守活性位点的保守氨基酸(图 4中用*标出)。同时比对结果显示, 白木香AsAOC1氨基酸序列与土瓶草(Cephalotus follicularis)、石榴(Punica granatum)、可可(Theobroma cacao)中AOC氨基酸序列相似性分别为73%、71%和70%。为了进一步了解白木香AsAOC1蛋白在植物AOC家族中的进化位置, 从NCBI blastp的比对结果中选取来源于其他植物的39条AOC蛋白序列, 包括乔木类植物甜橙、橡胶等, 模式植物拟南芥、玉米、烟草等, 以及其他植物如茄、苜蓿等利用MEGA6.0构建了系统进化树(图 5)。从图 5可以看出, 白木香AsAOC1与桑树(Morus notabilis) AOC蛋白亲缘关系比较接近。

Figure 4

Figure 4

Figure 4 Multiple sequence alignment of AsAOC1 and AOC from other plant species. Black shading indicates amino acid identities, red and blue shading indicates amino acid with different similarity. The catalytic residues which is the active site of AOC proteins are shown with asterisk. The black arrow stands for β-extend strand. As: Aquilaria sinensis; Cs: Citrus sinensis; Ga: Gossypium arboretum; Mn: Morus notabilis; Gm: Glycine max; Hl: Humulus lupulus; Me: Manihot esculenta; Nt: Nicotiana tabacum; Tc: Theobroma cacao

Figure 5

Figure 5

Figure 5 Phylogenetic analysis of AOC proteins from plants

将原核表达载体pET28a-AsAOC1质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)后, 通过预实验探索及SDS-PAGE电泳检测蛋白是否可溶并确定最佳诱导条件, 使用终浓度为0.8 mmol·L^-1的IPTG于18 ℃下诱导16 h达到最佳效果。由于AsAOC1在其氨基酸序列的N端带有一个6个His (组氨酸)的标签, 用镍离子亲和色谱柱纯化AsAOC1蛋白, 利用SDS-PAGE检测发现在30 kD出现一条AsAOC1蛋白纯化条带(图 6)。

Figure 6

Figure 6

Figure 6 SDS-PAGE analysis of recombinant AsAOC1 protein. M: Marker; 1: Uninduced E. coli containing pET28a-AsAOC1; 2: Soluble protein from induced E. coli containing pET28a-AsAOC1; 3: Insoluble fraction from the induced E. coli containing pET28a-AsAOC1; 4: The purified recombinant AsAOC1 protein

利用荧光定量PCR检测AsAOC1基因的组织特异性表达, 结果显示AsAOC1基因在白木香所有组织中均有表达, 在茎中表达最高, 根和茎尖次之, 在叶中表达最低, 说明AsAOC1基因表达具有器官特异性(图 7)。

Figure 7

Figure 7

Figure 7 Relative expression level of AsAOC1gene in different tissues. Note: Repeat 3 samples, each for 3 times

为验证白木香AsAOC1在植物防御反应中的作用, 对白木香的愈伤组织分别进行盐、干旱、低温及重金属处理, 以相同生长情况下未进行任何处理的愈伤组织做对照, 不同时间点取样提取RNA后进行实时荧光定量PCR分析, 检测AsAOC1的表达水平。实验结果显示盐、干旱、低温和重金属胁迫下均可以诱导AsAOC1基因的表达。经NaCl处理后AsAOC1基因表达量在36 h时达到最高, 之后随时间的增加表达量逐渐降低(图 8)。而甘露醇诱导产生的干旱胁迫条件下, AsAOC1的表达出现双峰现象, 在12 h表达量升高, 24 h降低, 之后上升在48 h达到最高。在低温处理后, AsAOC1的表达也出现双峰现象, 12 h表达量达到最高, 是对照的15.8倍, 24 h降低, 之后上升, 48 h达到最高(图 8)。在重金属胁迫下, 12 h AsAOC1表达量达到最高, 是对照的31倍, 之后48 h内的表达量逐渐降低(图 8)。

Figure 8

Figure 8

Figure 8 Relative expression level of AsAOC1 gene under different abiotic stresses in Aquilaria sinensis calli. Note: Repeat 3 samples, each for 3 times

研究发现苹果MdAOC1基因能够被茉莉酸甲酯、水杨酸诱导^[18], 说明植物激素的调控可能是交叉作用的。本研究对白木香的愈伤组织进行茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸和赤霉素处理, 实验结果表明, 茉莉酸甲酯诱导AsAOC1基因的表达, 在24 h达到最高, AsAOC1基因的表达量是对照的4倍, 之后逐渐下降(图 9)。水杨酸、赤霉素和脱落酸处理后使AsAOC1基因表达量上升, 在12 h表达量到达最高点, 之后逐渐降低(图 9)。

Figure 9

Figure 9

Figure 9 Relative expression level of AsAOC1 gene under different hormone treatments in Aquilaria sinensis calli. MeJA: Methyl jasmonate; SA: Salicylic acid; GA3: Gibberellin; ABA: Abscisic acid. Note: Repeat 3 samples, each for 3 times

茉莉酸广泛存在于植物的幼嫩组织与器官中, 能够通过信号转导调节植物生长发育与应激反应。AOC蛋白作为JA合成途径中的关键酶, 在苹果^[19]、玉米^[20]、拟南芥^[17]等多种植物中已有研究, AOC能够参与茉莉酸及其衍生物的合成代谢, 对于植物的生长发育和抵抗逆境胁迫起到重要作用^[18]。而茉莉酸能够调控白木香中倍半萜类物质的生物合成^{[7, 8]}, 同时研究表明盐胁迫能够诱导沉香中另一特征性成分—苯乙基色酮的生物合成, 所以研究白木香的AsAOC1基因的原核表达及在不同非生物胁迫和激素处理下的表达分析, 有利于研究AsAOC1基因体外的生物合成功能和在植物防御反应中的作用, 为进一步研究AsAOC1基因在白木香的结香过程中的作用奠定基础。

目前多种植物中已经分离得到AOC基因, 本研究首次在白木香愈伤组织中扩增得到AsAOC1基因全长, 并对基因进行生物学信息分析, 细胞定位预测结果表明, 白木香AsAOC1定位于细胞质中; 三维结构预测结果表明白木香中AsAOC1与拟南芥中AOC的三维结构相似; 多重序列分析, 发现AsAOC1与其他物种具有较高的同源性, 含有1个高度保守的allene-ox-cyc结构, 聚类分析结果表明AsAOC1与桑树的相似性较高。本研究首次在大肠杆菌中表达了白木香的AsAOC1蛋白, 希望能够在蛋白水平研究白木香中AsAOC1蛋白的生物学功能和体外研究AsAOC1蛋白的生物合成功能。通过构建原核表达载体pET28a-AsAOC1在BL21 (DE3)菌株中诱导表达了白木香AsAOC1蛋白, 而且重组蛋白AsAOC1在表达菌中能够以可溶性蛋白存在, 经SDS-PAGE电泳结果显示, 纯化产物浓度较高且条带单一, 为进一步研究AsAOC1的功能奠定基础。

不同植物AOC在不同的组织器官中具有不同的表达模式, Stenzel等^[21]发现拟南芥中AOC基因具有不同的表达模式, AtAOC1和AtAOC2在叶中的表达量很高, AtAOC3则在花组织中表达量较高, 而AtAOC4主要在根中表达。在苹果^[19]中MdAOC1基因在各组织中均有表达, 并且在茎中的表达量最高。本研究表明, 白木香的AsAOC1基因具有器官特异性, 在茎中表达量最高, 根和茎尖次之, 叶中的表达量最少。茉莉酸作为植物体内广泛存在的植物激素, 能够作为信号分子参与植物的抗逆反应。番茄在受到机械损伤时, 发现伤害处理后叶片中AOC的表达量上升^[22]; 高盐或低温处理麻风树, 发现经处理后JaAOC基因的表达量快速增加, 对其过表达可以提高转基因烟草的耐盐性和抗冻性^[23], 这表明AOC的表达可能在植物防御反应中起着重要作用^[24]。在植物生长过程中, 盐、干旱、低温和重金属是最常见的非生物胁迫, 本研究表明, 盐、低温、干旱以及重金属胁迫均能促进白木香AsAOC1基因的表达, 并且重金属镉对AsAOC1的表达量影响最大。这些实验结果表明AsAOC1基因参与植物的非生物胁迫防御反应, AsAOC1基因也可能与盐胁迫诱导的沉香特征性成分2-苯乙基色酮的生物合成相关。

茉莉酸、水杨酸、赤霉素、脱落酸等植物激素不仅能够单独发挥作用, 而且还可以依赖于各激素彼此间的相互作用, 它们一起共同调节植物体重要的生命活动, 形成复杂的应答网络^[25]。外源茉莉酸能够诱导苹果^[19]、水稻^[26]、拟南芥^[27]中AOC基因的表达; SA处理能够促进水稻AOC基因的表达^[26], 玉米中SA不仅促进AOC的表达, 还刺激依赖AOC活性的OPDA的增加^[20]。水杨酸抑制喜树CaAOC基因的表达, 而脱落酸能够极大的增强喜树CaAOC基因的表达, 有意思的是, 在研究水稻OsAOC基因的表达量时, 发现脱落酸明显抑制其表达量, 而水杨酸不但不抑制其表达, 反而有增强其表达量的趋势^[28]。以上研究均表明多种激素参与调控AOC基因的表达。本研究中利用外源的茉莉酸、水杨酸、脱落酸和赤霉素处理白木香的愈伤组织, 首次表明茉莉酸甲酯、水杨酸以及脱落酸均可以诱导白木香中AsAOC1基因的表达, 说明AsAOC1基因的表达受多种激素调控。AsAOC1基因是茉莉酸生物合成的关键酶, 因此在沉香特征性成分生物合成过程中起重要作用, AsAOC1基因的蛋白表达及非生物胁迫和激素处理下的表达分析, 为进一步研究白木香结香的分子调控机制奠定基础, 同时有利于丰富植物的防御反应的研究。