2018, Vol. 53
2. 西安医学院药物研究所, 陕西 西安 710021
, ZHAO Ning1,2, CHEN Zhuo1,2, HAN Wen-xia1, FU Li-na1,2, HE Shu-miao1, FU Wen-bo1, HE Sheng-sheng1, LI Jian1
2. Institute of Medicine, Xi'an Medical University, Xi'an 710021, China
肿瘤是当今社会人类健康的最大威胁之一。最新文献[1]研究表明, 肿瘤在我国已超过传染性疾病和心脑血管疾病, 成为死亡率最高的人类疾病。肿瘤的生长和转移均依赖于血管的形成, 新生血管为肿瘤组织提供营养物质, 其内皮细胞可表达多种生长因子而刺激肿瘤细胞的增殖。因此, 通过阻断肿瘤组织的血液供应而治疗肿瘤的方法被称为“肿瘤饥饿疗法”(starving tumor therapy)[2], 该方法在2003年被《Science》杂志评为年度十大科学成就之一。临床上常通过栓塞剂闭塞肿瘤部位的供血动脉, 以阻断瘤区的营养与供血而实现“饥饿”肿瘤组织; 如果栓塞剂包载药物, 则可起到靶向化疗与栓塞的双重协同作用[3, 4], 从而使瘤体组织坏死缩小, 也避免了传统给药方法存在的药物瘤体靶向作用差、药效持续时间短与毒副作用大等弊端[5, 6]。
目前, 临床上使用的新型栓塞剂为载药微球制剂, 微球在单次影像导引下经导管动脉灌注实现其肿瘤部位的动脉递送。制备微球的常用材料为明胶、淀粉、纤维素、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸与壳聚糖类[3, 7-9], 尽管这些材料均具有良好的生物相容性或可降解性, 但无止血与抑制新生血管生成等作用。因此, 栓塞后肿瘤部位的侧支循环再建立成为影响栓塞效果的重大因素[10, 11]。基于此, 本文提出采用具有止血与抑制侧支循环再建立活性的功能性材料制备微球, 那么微球的栓塞效果将会进一步增强。白及多糖(Bletilla striata polysaccharide, BSP)是从中药白及[Bletilla striata (Thunb.) Reichb.f.]中提取得到的一种水溶性高分子多糖, 相对分子质量约为1.35×105, 主要由β-葡萄糖和α-甘露糖组成, 糖苷键型为β型; BSP呈白色粉末状, 在热水中易溶解, 冷水中较难溶, 且其水溶液的黏稠度较高[12]; BSP还具有良好的止血、抗肿瘤、抗炎、抑制血管生成与侧支循环再建立等药理作用[13, 14]。近年来, 由于BSP良好的生物相容性与可生物降解性而作为一种新型医用高分子材料, 得到广泛研究与应用。苦参碱(matrine, ME)是中药苦参(Sophora flavescens Air.)的主要活性成分, 可通过作用于相关靶点而发挥抑制癌细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡等抗肿瘤作用[15, 16], 因此, 本文以ME为模型药物, 以BSP为骨架材料制备栓塞微球并评价其相关药剂学性能, 以期为肿瘤的栓塞治疗提供一种新型高效的血管栓塞剂。
材料与方法试剂与药品 ME对照品(中国食品药品检定研究院, 批号: 110805-200508), 苦参碱(纯度≥98%, 西安小草植物科技有限责任公司); Tween-80、Span-85、环氧氯丙烷(成都市科龙化工试剂厂); 乙二胺(天津市北联精细化学品开发有限公司); 石油醚(天津市河东区红岩试剂厂); 液体石蜡、异丙醇、丙酮(天津市富宇精细化工有限公司); 白及多糖(自制); 其他试剂均为分析纯, 水为双蒸水。14-KD透析袋(上海新睿生物科技有限公司)。
主要仪器 CKX31-A11RC倒置显微镜(日本奥林巴斯公司); Hitachi-3500扫描电镜(日本日立公司); Angilent-1260高效液相色谱仪(DAD检测器, 美国安捷伦公司); DSC1差式扫描量热仪(Stare系统, 瑞士梅特勒-托利多公司)。
苦参碱的测定 采用高效液相色谱法(HPLC)测定ME浓度。色谱柱为C18柱, 流动相为甲醇-水(70:30), 检测波长230 nm, 流速1.0 mL·min-1, 进样量20 μL。取ME对照品, 精密称定后用双蒸水配制成质量浓度为20.35、85.25、101.52、203.00和406.00 μg·mL-1对照品溶液, 取各浓度溶液20 μL, 注入HPLC中测定峰面积(A), 以ME的A为纵坐标、浓度(C)为横坐标, 进行线性回归, 得到标准曲线为A=11.977 C + 68.013 (r = 0.999 7), 线性范围20.35~406.00 μg·mL-1。
微球的制备空白白及多糖微球(BSPMS) 称取处方量的BSP溶于纯化水中, 制成水相; 液体石蜡、Tween-80与Span-85混合均匀, 作为油相; 将水相和油相于50 ℃水浴预热, 然后将水相缓慢加入到油相, 并持续搅拌45 min后, 加入交联剂乙二胺-环氧氯丙烷(3:1), 于50 ℃密闭条件下搅拌60 min; 待体系降至室温, 石油醚稀释、静置, 弃去油相, 再用异丙醇、丙酮交替洗涤3次, 将所得微球用氮气流吹干, 即得。
苦参碱白及多糖微球(ME-BSPMS) 称取处方量的BSP与ME溶于纯化水中, 制成水相; 其余操作同上。
评价方法 微球的外观形态对于微球的流动性、悬浮性、成球率和栓塞性等均具有重要的影响[4, 8, 17, 18]。因此, 对微球的外观形态包括表面光滑致密、无黏连、球状圆整和粒径分布均匀等4项进行打分, 每项各占2.5分, 满分10分, 逐项评分后再计算综合得分(CS), 并以CS为微球成型条件优化评价指标。
微球制剂处方的筛选 考察不同质量浓度BSP (0.09、0.12、0.15、0.18、0.21 g·mL-1)、水相/油相比(1:2、1:3、1:4、1:5、1:6)、Span-85/Tween-80比(0.5:2.5、1.0:2.0、1.5:1.5、2.0:1.0、2.5:0.5)和交联剂用量(2%、4%、6%、8%、10%)对微球外观形态的影响。
微球制备条件的优化 考察不同搅拌速度(500、800、1 000、1 200、1 500 r·min-1)、交联固化温度(5 ℃、20 ℃、35 ℃、50 ℃、65 ℃)与交联反应时间(30、45、60、75、90 min)对微球外观形态的影响。
微球的药剂学性质表征外观形态评价 取微球样品适量, 用导电胶固定后溅金, 喷金, 然后在高压条件成像, 用扫描电镜(SEM)观察其外观形态与表面结构特征。
粒度测定 用倒置显微镜测定50个微球样品的粒径, 以粒径的平均值表示微球的平均粒径。
载药量测定 取微球样品50 mg, 精密称定后置于研钵中研成细粉, 用少量甲醇溶解后, 将其转移到50 mL量瓶中, 补加甲醇稀释至刻度, 超声10 min后过0.45 μm微孔滤膜, 取滤液20 μL, 注入HPLC中测定ME含量。载药量(DL)按照如下公式计算: DL = (Wd / W) ×100%, 其中Wd为被微球包封的药量, W为微球的质量。
吸水膨胀率与悬浮性测定 取微球样品50 mg, 精密称定后置于37 ℃生理盐水中振荡30 s后静置, 记录微球悬浮时间(以肉眼观察完全分层为止); 并分别于5、10、20、35和60 min取出, 用滤纸拭去溶胀微球表面的水, 迅速用电子天平称其质量, 按照如下公式计算吸水膨胀率(WSR): WSR = (W2 -W1) / W1 × 100%, 其中W2为吸水后微球的质量, W1为干燥状态微球的质量。
药物包埋情况表征 取ME-BSPMS、BSPMS、ME和ME+BSPMS混合物适量, 使用差示扫描量热仪(DSC)对各样品进行检测分析。检测分析条件:扫描温度为0~200 ℃, 升温速率为20 ℃·min-1, 测定气氛为高纯度氮气。
微球体外释药行为评价 取微球样品250 mg, 精密称定后混悬于25 mL生理盐水中, 然后置于14-kD透析袋中, 并悬于盛有50 mL生理盐水的具塞三角瓶; 密闭, 于37 ℃水浴恒温振荡, 分别于0.5、2.0、5.0、8.0和12 h取接收液1.0 mL, 同时补加新鲜生理盐水1.0 mL; 将样品过0.45μm微孔滤膜, 取滤液20 μL, 注入HPLC中测定ME含量; 计算各时间点的药物累积释放百分率(Ft), 以Ft为纵坐标、时间(t)为横坐标制作释药曲线。
统计学分析 实验结果数据采用方差分析与t-检验进行统计学分析, P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 1 微球制剂处方的筛选 1.1 白及多糖浓度对微球外观形态的影响BSP是微球的骨架材料与球体成型的关键。BSP是一种水溶性高分子多糖, 其溶于水后可形成稠厚的凝胶, 凝胶的内聚力和黏稠度与BSP的浓度成正相关, 也是影响液态微球在表面张力作用下收缩成圆整球体的重要因素。不同浓度BSP对于微球外观形态CS的影响如图 1A所示, 由图可知, 随着BSP浓度的增加, 微球CS逐渐增大而后降低, 且当BSP质量浓度为0.15 g·mL-1时, 微球CS值达到最大, 其原因为BSP质量浓度低于0.15 g·mL-1时, 由于骨架材料不足而难于支撑微球的球体结构, 在干燥过程中易发生球体皱缩与干瘪塌陷; 而当BSP质量浓度高于0.15 g·mL-1时, 由于其分子链之间发生紧密无序“缠结”而使体系黏稠度与内聚力进一步增大[19], 因而不易在搅拌与表面活性剂作用下分散成微滴并收缩球形, 进而导致微球的圆整度不足、黏连与粒径分布较宽。尽管BSP质量浓度为0.15 g·mL-1时微球CS值高于0.18 g·mL-1, 二者之间无显著性差异(P > 0.05), 但是CS的微小改善对于微球体系整体质量的提高至关重要。因此, 0.15 g·mL-1 BSP有利于微球的成型。
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Figure 1 Effects of concentration of Bletilla striata polysaccharide (BSP) (A), ratio of water phase to oil phase (B), ratio of Span-85 to Tween-80 (C) and concentration of crosslinker (D) on the comprehensive score (CS) of the appearance shape of microspheres. n= 3, x± s |
本文采用乳化-交联法制备微球, 其中乳化过程是决定微球形态与成型的关键。由于乳剂分散系统是一个热力学和动力学均不稳定的体系, 影响乳化效果的一个重要因素就是水相/油相比。由图 1B可知, 当水相/油相比为1/5时, 微球CS值高于水相/油相比为1/2、1/3、1/4时(P < 0.05), 而当水相/油相比为1/5与1/6时, 二者之间无显著性差异(P > 0.05)。结果表明, 当油相比例低于1/5时, 内水相乳滴在系统中所占比例较高、单位体积内液态微球数目较多, 加之乳化过程的搅拌作用、乳滴本身的热力学不稳定性, 增大了液态微球乳滴间的摩擦、碰撞与聚集几率, 影响了微球的成型与外观形态; 而当油相比例高于1/5时, 油相在乳化体系中的比例较高, 使单位系统体积中液态微球数目减少, 因而能很好地降低/避免液态微球乳滴间的摩擦、碰撞、聚集与合并几率而提高微球的外观形态, 并有利于制剂成型。因此, 确定1/5为制备ME-BSPMS的最佳水相/油相比。
1.3 不同乳化剂比例对微球外观形态的影响乳化过程是将BSP水溶液(水相)以微小液滴的形式分散于液体石蜡(油相)中, 水相由水溶液变成比表面积较大的微小液滴(乳滴)而分散于油相中形成W/O型乳剂, 由于比表面积较大, 使内水相乳滴具有较高的表面自由能而不稳定。因此, 需要表面活性剂以降低内水相乳滴的表面自由能而减少其聚集合并, 增加稳定性。由图 1C可知, 随着Span-85比例的增大微球CS值先增大后降低, 当Span-85/Tween-80比为2.0:1.0时, 微球CS值达到最大, 其原因为Span-85属于W/O型乳化剂, 随着Span-85比例增大能够形成利于水相乳化于油相中的HLB值, 且Span-85与Tween-80能够形成牢固的复合乳化剂膜而增加内水相乳滴的稳定性, 利于形成粒径均匀的液态微球乳滴并抑制其聚集合并; 当Span-85用量进一步增大后, 其与Tween-80形成的复合乳化剂体系的乳化能力也进一步增强, 在乳化过程易于形成更多粒径较小的乳滴, 因而造成微球的粒径分布差异增大, 微球CS值降低。因此, 制备ME-BSPMS时选择Span-85与Tween-80比为2.0:1.0的复合乳化剂体系。
1.4 交联剂用量对微球外观形态的影响通过乳化作用, BSP水溶液以微小液滴的形式分散于液体石蜡中, 但此时内水相形成的液态微球是可逆的, 即在分离油相后会相互黏连、合并成团块而不形成微球, 因此, 需要通过交联固化作用以增加其稳定性。BSP由葡萄糖和甘露糖组成, 以乙二胺-环氧氯丙烷作为交联剂, 糖分子上的羟基在乙二胺提供的碱性环境下, 使环氧氯丙烷的环氧环开环并与之形成醚键, 而后该环氧氯丙烷上的氯原子与新生成的羟基关环形成新的环氧基, 这个环氧基再与另一分子的糖基开环成醚, 从而将糖分子交联并使BSP液态微滴固化成球、稳定性提高[20, 21]。由图 1D可知, 随着交联剂用量增加, 微球的CS逐渐增大而后降低, 且当交联剂用量为8%时, 微球CS值达到最大。这是因为当交联剂用量低于8%时, 微球由于交联程度不足、强度较低而易发生黏连、变形; 而当交联剂用量高于8%时, 则会导致微球表层局部交联过度而刚性较强, 易于发生微球表面的局部皲裂(图 2), 交联剂用量大也使交联反应速度加快, 可造成多个微球黏连特别是有细小微球存在时黏连更为严重。因此, 制备ME-BSPMS选择交联剂用量为8%。
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Figure 2 SEM images for matrine loaded Bletilla striata poly saccharide microspheres (ME-BSPMS) of different concentration of crosslinker. A: 8%; B: 10% |
BSP凝胶液具有较高的黏稠度和内聚力, 在乳化过程中不易分散, 此外, BSP凝胶液由整体变成微小液滴的乳化过程中, 体系由于表面积的急剧增大而需要提供较大的能量, 搅拌速度与搅拌所提供的能量成正相关。因此, 搅拌过程的速度对于微球的成型具有重要作用。由图 3A可知, 随着搅拌速度的增加, 微球的CS逐渐增大而后降低, 当搅拌速度为1 000 r·min-1时, 微球CS值达到最大。当搅拌速度低于1 000 r·min-1时, 由于搅拌速度过慢而提供的能量不足, 不利于BSP凝胶液的分散与乳化, 致使BSP多为团块状, 微球不易成型, 且圆整度不足、粒径较大; 而当搅拌速度高于1 000 r·min-1时, BSP凝胶液分散、乳化充分, 但增大了已分散的液态微球发生碰撞的几率, 同时, 也增大了微球和分散介质间的摩擦力而易发生变形, 造成微球黏连与圆整度降低而影响了其外观形态。因此, 选择1 000 r·min-1为制备ME-BSPMS时搅拌速度。
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Figure 3 Effects of mixing speed (A), temperature (B) and crosslinking reaction time (C) on CS of the appearance shape of micro spheres. n = 3, x± s |
BSP的分子质量较大而溶于水后形成凝胶液的黏稠度较高。特别是在低温下, 分子热运动减弱, BSP的溶剂化作用束缚了大量水分子使自由流动的溶剂减少, 同时BSP分子链间的“缠结”作用加强而易发生胶凝, 进而形成“冻胶”状团块而不易分散。此外, 交联反应过程的速度也与体系的温度有关。因此, 温度对于微球的成型过程有着重要影响。由图 3B可知, 随着体系温度的增加, 微球的CS逐渐增大而后降低, 当体系温度为50 ℃时, 微球CS值达到最大。当体系温度低于20 ℃时, 由于BSP凝胶液易于发生胶凝作用而黏稠度与内聚力急剧增大, 导致液态微球很难在表面张力作用下收缩成规则的球体, 且交联反应过程较为缓慢而导致微球间易发生黏连; 当体系温度为35~50 ℃时, 有效抑制了BSP凝胶液发生胶凝, 体系黏稠度降低而使分散、乳化过程易于进行, 且交联反应速度合适, 得到的微球具有良好的外观形态; 而当体系温度较高(65 ℃), 使交联反应速度过快, 导致微球发生黏连, 也易使液态微球在充分交联固化前发生变形而圆整度不足。尽管35 ℃、50 ℃与65 ℃三者之间无显著性差异(P > 0.05), 为了制备良好的微球, 选择CS值最大的体系温度即50 ℃为交联反应过程的温度。
2.3 交联反应时间对微球外观形态的影响交联剂与BSP发生交联反应是一个逐渐进行的过程, 需要一定的时间, 因此, 交联反应时间对于微球成型也具有重要的影响。由图 3C可知, 随着交联反应时间的延长, 微球的CS值逐渐增大并趋于稳定。当反应时间为60 min时, 微球CS值达到最大; 交联反应时间低于60 min时, 微球CS值较低, 这是由于BSP微球的交联程度不足而不利于微球固化成型, 也易发生变形与黏连。而当反应时间为60、75和90 min时, 所制备微球的CS值之间无显著性差异(P > 0.05), 结果表明, 在本文实验条件下, 60 min可以保障BSP微球发生充分的交联固化反应而具有良好的外观形态, 而继续延长交联反应的时间, 可能由于已发生交联反应的微球表层的交联固化膜的保护作用而不会对微球的外观形态造成进一步的影响。
3 微球的性能表征 3.1 微球的外观形态、粒度苦参碱白及多糖微球(ME-BSPMS)在扫描电镜下呈表面光滑的规整球体结构(图 4), 其平均粒径为(85 ± 7) μm (n = 5);有研究表明, 大小均一且规整的微球不易堵塞动脉栓塞用微导管[22]。
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Figure 4 The SEM images for ME-BSPMS. A: (×1 000); B: (×10 000) |
微球制剂的载药量决定了药物的治疗作用, ME-BSPMS对ME的载药量为(30.12 ± 3.25)% (n = 3), 这可能是由于BSP分子质量较大、分子链较长而使微球内部的网状空隙较大, 而ME为小分子药物(相对分子质量为248.37)。因此, BSPMS可以容纳较多的药物分子。DSC检测显示(图 5), 制成微球后ME的固有特征峰在ME-BSPMS中消失, 而ME+BSPMS则显示了ME的特征峰, 结果显示ME能够充分被包埋于BSPMS的空间骨架空隙中, 且二者相容性良好。
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Figure 5 DSC image of BSPMS, ME, ME-BSPMS and ME+BSPMS |
ME-BSPMS在生理盐水中易于分散且无聚集与黏连, 悬浮时间为2~3 min, 表明其分散悬浮性良好, 可保证微球在生理盐水中以良好的悬浮状态被注射器抽取; ME-BSPMS在生理盐水中发生吸水后膨胀(图 6), WSR随着时间延长而迅速增大, 20 min时WSR可达(53 ± 4.2)%(n = 3), 且溶胀前后球状外观形态无显著变化。这些性质可以使ME-BSPMS能够通过常规动脉穿刺而进行肿瘤动脉栓塞[3, 23], 栓塞后再通过膨胀作用与BSP材料本身的止血、抑制侧支循环再建立作用而进一步提高其栓塞效果。
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Figure 6 Water swelling ratio (WSR) of ME-BSPMS in physiological saline solution.n= 3, x±s |
由图 7可知, ME从ME-BSPMS中随着时间延长而缓慢释放。12 h时, ME在生理盐水中的累积释药量为(25.38 ± 1.57)% (n = 3), 表明将药物包载于BSPMS后具有缓慢的释药行为, 这有利于肿瘤栓塞后而发挥长效缓释作用。BSPMS通过与交联剂发生交联反应以及BSP高分子链本身相互“缠绕聚结”而形成丰富的空间网状结构, 小分子药物ME填充分布于其中, 因此, 其释放过程需要通过微球内部曲折分布的“空间网状孔道”, 使药物具有良好的缓释行为而利于肿瘤的局部靶向治疗。
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Figure 7 The permeation profiles of ME from ME-BSPMS in vitro. n = 3, x± s. Ft: Accumulation drug release |
经动脉化疗栓塞术是中晚期肿瘤的有效治疗方法。载药微球通过动脉递送可以起到靶向化疗与栓塞肿瘤血管的双重协同作用, 因此成为临床常用的栓塞剂。但是, 目前采用常规材料制备的微球在栓塞后难以有效抑制肿瘤新生血管生成与侧支循环再建立, 这严重影响了栓塞疗法的效果[10, 11]。因此, 寻找制备栓塞微球的新型高分子材料具有重要的临床价值和意义。
本文以BSP为骨架材料用乳化-交联法制备了微球, 并以微球的外观形态为评价指标, 阐明了处方因素(如BSP浓度、水/油相比、Span/Tween比与交联剂用量)与制备条件(如搅拌速度、交联固化温度与时间)对微球成型的影响规律及机制, 从而优化了ME-BSPMS的制备方法。ME-BSPMS外观呈表面光滑的规整球体结构, 平均粒径为(85 ± 7) μm; 其在生理盐水中分散性、悬浮性与膨胀性均良好, 为通过常规动脉穿刺而实施肿瘤动脉栓塞奠定了基础。DSC检测分析显示了ME与BSP的相容性良好, 小分子ME能够充分被包埋于BSPMS内部的空间网状骨架空隙中, 载药量可达(30.12 ± 3.25)%; 由于药物释放过程需要通过微球内部不规则曲折“孔道”的扩散, 因此具有良好的缓释行为, 这利于药物在肿瘤局部发挥长效靶向化疗作用。综上所述, 本文为肿瘤经动脉化疗栓塞术, 提供了一种可生物降解与有效抑制侧支循环再建立的新型肿瘤血管栓塞载体, 具有一定的科学意义和广阔的应用前景。
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