抑郁症是一种常见的威胁患者生活自理能力甚至生命的一种神经精神疾病。目前全球患抑郁症的人数高达11%[1]。全球卫生组织预测, 到2020年抑郁症引起的死亡率将上升为全球第二。根据精神障碍诊断和统计手册(第4版, DSM-Ⅳ)标准, 抑郁症的典型症状为情绪低落, 日常活动兴趣减少, 快感缺失等[2]。该疾病的流行学和病理学机制目前还没有阐明清楚。但是大量研究表明, 应激和压力在抑郁症的发病过程中扮演着重要角色[3, 4]。
葛根(Radix Puerariae)豆科多年生藤本植物野葛或甘葛藤的干燥根部, 其主要功能有生津、透疹、解肌退热、升阳止泻, 是中医临床上的常见常用药。葛根素是从中药葛根中提取出来的, 化学成分是一种单体异黄酮化合物。现代研究表明, 葛根有扩张脑血管、增加脑血流量、改善大脑供氧和脑部微循环等作用, 还有抗氧化、保护神经元、抗凝血和抗肿瘤等作用[5]。近年研究表明, 葛根具有较强的抗抑郁作用[6]。Shi等[7]采用小鼠行为绝望模型研究表明, 葛根复方制剂奔豚汤(李根白皮、半夏、川芎、当归、白芍、葛根、黄芩、甘草和生姜)能缩短绝望模型中小鼠悬尾和强迫游泳不动时间, 并对其有显著性影响, 对小鼠自主活动无明显影响, 表明奔豚汤具有抗抑郁作用。Yan等[8]研究发现葛根的乙醇提取物可显著缩短在大脑缺血再灌注模型中小鼠强迫游泳实验(FST)和悬尾实验(TST)的不动时间, 同时有逆转大脑缺血再灌注小鼠海马和纹状体中去甲肾上腺素和4-二羟苯乙酸含量降低的作用。Wang等[9]采用葛根异黄酮(50、100、200 mg·kg-1)对雄性昆明小鼠连续灌胃, 给药14天后, 葛根异黄酮各剂量均显著缩短了FST和TST不动时间, 显著增强了5-HT诱导的小鼠甩头行为, 且呈剂量依赖性。以上研究均表明, 葛根在动物实验中具有抗抑郁的作用。目前, 葛根素对CUMS诱导的大鼠抑郁样行为的影响还尚未见研究报道。本研究拟观察葛根素对CUMS诱导的大鼠抑郁行为的影响, 初步探讨葛根素的抗抑郁作用机制。
材料与方法仪器 大鼠旷场实验装置、强迫游泳实验装置(上海欣软信息科技有限公司); Biometra T-gradient梯度PCR (德国Biometra公司); ABI-7500荧光实时定量PCR仪(美国应用生物系统公司); ELX-800全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司); 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。
药物与试剂 葛根素(中国食品药品检定研究院); 盐酸氟西汀分散片(礼来苏州制药有限公司); 荧光定量PCR试剂盒(美国Promega生物技术有限公司); IL-1β、TNF-α和IL-10 ELISA抗体[圣克鲁斯(上海)生物技术公司]; PGE2 (上海酶研生物科技有限公司); 过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所), 其余试剂为国产分析纯。
实验动物 选取SPF级雄性SD成年大鼠72只、体重180~220 g, 由广东省医学实验动物中心提供, 动物合格证号: SCXK (粤) 2013-0002。
动物分组及造模 72只大鼠随机分为6组, 每组12只, 即对照组、模型组、氟西汀对照组(10 mg·kg-1)、葛根素低、中、高(50、100、200 mg·kg-1)剂量组。各组大鼠实验前适应环境1周, 结束后进行为期6周的慢性不可预知温和刺激抑郁模型的构建, 造模方法参考文献[10], 适当改动。对照组大鼠正常摄食饮水, 不给予任何刺激; 其余各组每天选用应激方式的1种, 避免重复。应激方式包括昼夜颠倒24 h、鼠笼倾斜45° 24 h、4 ℃冰水游泳5 min、束缚1 h、潮湿垫料24 h、夹尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、足底电击2次(2 mA持续4 s, 间隔10 s)、独笼应激、合笼应激等。慢性应激3周后开始给药, 每天1次, 连续给药3周(给药期间继续造模), 对照组和模型组大鼠每天灌服等体积的生理盐水。
行为学检测
糖水偏爱实验 实验前, 大鼠训练适应1% (w/v)糖水:每笼放置两瓶1%糖水, 24 h后将其中一瓶1%糖水换成纯水, 放置24 h。适应后, 大鼠禁水禁食24 h, 进行糖水偏爱实验。实验中, 大鼠可自由饮用2瓶水, 一瓶为1%糖水20 mL, 另一瓶为纯水20 mL, 实验开始之前称量每瓶水的重量。24 h后, 测量剩余的重量, 得出糖水和纯水的消耗量(g)。用糖水消耗量与总液体消耗量(糖水消耗量+纯水消耗量)之比表示糖水偏爱度。
旷场实验实验 在一个100 cm × 100 cm × 50 cm的开放木箱内进行, 木箱底面等分成25个正方形, 四周全部涂黑。实验在安静的环境下进行, 把大鼠放在木箱中央, 观察5 min内的活动情况。由不知实验方案的人员记录其水平运动得分(穿越底面格子数)、垂直运动得分(直立次数)。
强迫游泳实验 实验在高为50 cm, 直径为25 cm的透明圆柱形游泳桶。实验第1天, 塑料桶装入30 cm高的水, 水温为23 ± 3 ℃, 使大鼠后肢无法靠塑料桶底部支撑身体, 让其自由游泳6 min以适应环境。第2天, 塑料桶内装入同样温度和高度的水, 让大鼠游泳6 min, 由不知实验方案的人员记录大鼠后4 min内的不动时间。不动状态定义为大鼠停止挣扎, 漂浮于水面或仅做一些支持浮在水面的细小肢体活动。
海马CAT、SOD活性及ROS含量的检测 强迫游泳实验次日给药30 min后, 断头取脑, 冰上迅速剥离双侧全海马组织, 用预冷的PBS冲洗海马组织(除用于本部分实验外其他剩余组织存放于液氮中保存), 检测CAT、SOD酶活性及ROS、PGE2含量, 按试剂盒说明书操作。
海马IL-1β、TNF-α及IL-10 mRNA水平检测 提取总mRNA:大鼠海马组织加入TRIzol匀浆, 使组织完全裂解。加入氯仿200 μL振荡, 离心10 min, 弃去上清。加入预冷的75%乙醇清洗沉淀, 离心5 min弃上清。将沉淀晾干, RNase free water溶解RNA沉淀。逆转录体系, PCR反应体系扩增条件: 94 ℃变性45 s, 退火45 s, 周期为40个循环, 最后72 ℃延伸45 s。内参为GAPDH, 引物序列见表 1。RT-PCR定量分析IL-1β、TNF-α及IL-10基因表达水平:按照荧光定量PCR检测试剂盒(TaqMan® 2×Universal PCR Master Mix, NoAmpErase® UNGb)的说明进行实验, 整个操作在冰上进行, 注意避光。PCR结束后得到扩增曲线和Ct值, ΔΔCt = (Ct目的基因 -Ct管家基因)实验组 -(Ct目的基因 -Ct管家基因)对照组, 基因差异表达水平用2-ΔΔCt方法计算。
海马IL-1β、TNF-α及IL-10蛋白含量测定 海马组织用含有蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸化抑制剂的RIPA缓冲液匀浆, 以13 000 ×g离心30 min, 取上清用Bradford蛋白分析方法测定蛋白质含量。将上清液与SDS样品缓冲液稀释后于沸水中煮3 min。上样(12% SDS-PAGE凝胶)分离, 湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜, 封闭2 h, TBST洗5 min, 加IL-1β抗体(1:1 000稀释)、TNF-α抗体(1:1 000稀释)、IL-10抗体(1:500稀释)或GAPDH抗体(1:1 000稀释)。于4 ℃摇床上过夜。然后用TBST洗3次, 每次5 min, 加荧光标记的二抗, 室温下振荡60 min, 用TBST洗3次之后用荧光扫描仪扫描特异性条带并定量(Odyssey Infrared Imaging System, 美国LI-COR Biotechnology公司)。
统计学方法 数据采用SPSS18.0统计软件进行分析。结果均用mean ± SEM (均数±标准误)的格式表示。数据用单因素多水平设计定量资料的方差分析(one-way ANOVA)及LSD检验(方差齐性)或者Dunnett T3检验(方差不齐)。P < 0.05定义为显著性差异有统计学意义。
结果 1 葛根素对旷场实验的影响造模6周后, 与对照组大鼠相比, 模型组大鼠穿越格子数及直立次数明显减少(P < 0.01), 表明大鼠的自发活动能力显著降低。给予中、高剂量葛根素及氟西汀后, 与模型组相比, 大鼠穿越格子数及直立次数显著性增加(P < 0.05或P < 0.01), 结果如图 1所示。
造模6周后, 模型组大鼠对糖水的偏爱度较对照组大鼠明显降低(P < 0.01), 而在给予中、高剂量葛根素和氟西汀处理3周后, 大鼠的糖水偏爱度明显升高(P < 0.05, P < 0.01), 表明葛根素能改善应激造成的快感缺失, 缓解抑郁症状, 结果如图 2所示。
造模6周后, 模型组大鼠的不动时间明显高于对照组, 差异具有统计学意义(P < 0.01), 而给药中、高剂量葛根素及氟西汀后可明显缩短大鼠在强迫游泳中的不动时间(P < 0.05或P < 0.01), 表明动物的抑郁状态得到改善, 结果如图 3所示。
造模后大鼠海马内ROS及PGE2含量较对照组明显升高(P < 0.01), 但是CAT和SOD酶活性显著降低(P < 0.05或P < 0.01), 提示海马内氧化应激水平明显升高。而在给予3周的葛根素及氟西汀后均能明显降低以上指标的水平(P < 0.05, P < 0.01), 表明葛根素能降低大鼠海马内氧化应激水平, 具有较强的抗氧化作用, 结果如图 4所示。
模型组大鼠海马IL-1β、TNF-α及IL-10的mRNA水平较对照组明显升高, 差异具有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。在给予葛根素及氟西汀处理后, 大鼠海马促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平均出现显著性降低(P < 0.05或P < 0.01), 而抗炎因子IL-10的mRNA水平则有不同程度的提高, 其中200 mg·kg-1葛根素给药组出现显著性上升, 差异具有统计学意义(P < 0.05), 结果如图 5所示。
海马内IL-1β、TNF-α及IL-10蛋白表达水平与mRNA检测结果相一致, 造模6周后, 模型组大鼠IL-1β、TNF-α和IL-10蛋白表达明显升高(P < 0.05或P < 0.01)。在给予葛根素及氟西汀处理后, 大鼠海马内促炎因子IL-1β和TNF-α的蛋白水平均有不同程度的降低, 而抗炎因子IL-10的含量则有不同程度的提高, 结果如图 6所示。
抑郁症的发病机制复杂, CUMS模型是公认的经典的抑郁症动物模型。大鼠在CUMS造模后所表现的抑郁行为与人长期暴露在的多重压力下引起的抑郁临床表现相似[11]。动物行为学变化, 是评价模型制作是否成功的标志, 也是判定药物是否有效的标准。本实验中大鼠在经过CUMS后成功模拟了抑郁状态, 表现为旷场实验中自主活动减少, 糖水偏爱实验中糖水偏爱度降低, 及在强迫游泳实验中不动时间增加。而葛根素能逆转应激引起的以上行为学改变, 表明葛根素具有很好的抗抑郁作用。
研究表明, 肿瘤、心血管疾病、糖尿病、脑卒中和阿尔茨海默病等在内的多种疾病均可能引发抑郁症[12-14]。抑郁症的发生与细胞介导的免疫激活、炎症反应和氧化应激密切相关。临床研究表明, 抑郁症患者外周血中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等明显高于正常人, 而在给予抗抑郁药物治疗之后这些炎症因子的水平得到了抑制[15]。在动物实验中, 通过腹腔或脑内注射脂多糖(LPS)均能引起小鼠抑郁样的行为学改变[16, 17], CUMS大鼠皮层及海马小胶质细胞被激活引起炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的过度表达, 炎症因子表达的增加又能进一步促进小胶质细胞的激活, 小胶质细胞的过度激活直接对神经元产生神经毒性作用。研究显示, 葛根素对于炎症因子的分泌能起到一定的抑制作用, 可以降低脑损伤后脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等的含量, 减轻病灶处白细胞的聚集, 从而阻止局部的炎症级联反应[18]。Wan等[19]发现脑缺血再灌注损伤模型大鼠经过葛根素处理之后, IL-1β的水平明显低于模型组。另有临床研究报道, 葛根素能显著降低急性脑梗死患者血清IL-6和TNF-α的水平[20]。本研究发现, 大鼠在经过CUMS应激之后, 海马内炎症因子IL-1β、TNF-α、PGE2和IL-10表达增加, 表明海马出现了明显的炎症反应损伤。而在给予葛根素及氟西汀干预之后, 可以改善由应激导致的炎症反应损伤, 这表明葛根素的抗抑郁样作用可能与其抗炎作用相关。
已有研究报道, 抑郁症的发生与氧化应激损伤关系密切[21]。抑郁症是慢性的心理及生理应激过程, 可引起体内神经内分泌系统的功能变化, 并伴有氧化应激系统的激活, 引起中枢神经系统的氧化损伤。临床研究发现, 重度抑郁症患者体内SOD活性降低, 而MDA含量升高, 给予清除自由基的药物, 能改善大鼠的抑郁症状[22]。Tao等[23]研究结果显示, 慢性抑郁模型大鼠大脑海马MDA含量显著升高, 而SOD活性显著降低, 提示大鼠脑内氧化应激系统失衡, 并出现脂质过氧化损伤。研究表明, 葛根素可以提高脑组织内一种或多种内源性抗氧化剂活性, 减轻因自由基引起的氧化损伤, 起到神经保护作用。脂质过氧化产物(如MDA的含量)能在一定程度上反映细胞所受到的氧化损伤程度。Li等[24]研究证实葛根素能有效增加帕金森病模型大鼠黑质中GSH-Px和SOD活性, 降低MDA含量, 提高帕金森病模型大鼠抗氧化能力, 减轻氧化应激损伤。本研究发现, 大鼠在经过6周的应激之后, 海马内ROS水平升高, SOD及CAT酶活性下降, 表明海马出现了明显的氧化应激损伤。而在给予葛根素及氟西汀干预之后, 可以改善由应激导致的氧化应激损伤, 这表明葛根素的抗抑郁样作用可能与其抗氧化作用相关。
综上所述, 本实验研究结果显示, 葛根素能够逆转CUMS诱导的大鼠抑郁样症状, 且该作用可能是通过缓解CUMS引起的过度炎症反应和氧化应激反应起作用的。但是, 该机制的研究只是初步的探索, 具体的信号通路过程尚需进一步探讨。
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