2. 河北省人民医院药学部, 河北 石家庄 050051;
3. 河北化工医药职业技术学院制药系, 河北 石家庄 050026
2. Department of Pharmacy, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China;
3. Department of Pharmaceutical, Hebei Chemical and pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, China
基因治疗是将基因导入患者特定的组织甚至细胞内进行适当的表达, 从而达到治疗疾病的目的[1]。与传统的治疗方法相比, 基因治疗能够从根源上修正引起疾病的异常基因, 现已成为医药领域研究的新热点。基因治疗的关键是将目的基因输送至靶细胞, 期间存在许多障碍, 如细胞膜、内涵体膜、核膜等。裸露的基因易被降解, 转染效率低, 因此, 一个理想的基因输送系统, 应该能够保护负载物并具备克服上述生理屏障的功能性基团, 如靶向配体、pH敏感肽和核定位信号等。目前, 基因递送载体有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染率高, 但存在诱导机体产生免疫反应和致癌性等问题; 非病毒载体是利用非病毒的载体材料的理化性质介导基因的传递, 化学结构可控制, 易于大量制备, 与病毒载体相比, 具有低致瘤性、低免疫原性和低毒性等优点[2, 3]。但其转染效率明显低于病毒载体, 因此, 提高非病毒载体的转染效率是学者们关注的重点。2004年Kogure等[4]提出了“程序包装”的概念, 基于此概念建立了一种新的基因载体系统——多功能信封型纳米系统(multifunctional envelope-type nano device, MEND)。本文对近年来多功能信封型纳米系统的研究进行简要综述。
1 多功能信封型纳米系统 1.1 MEND的概念及制备MEND是以压缩的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)、DNA或蛋白质/多肽为核心, 用含有靶向因子和功能配体修饰的脂质体包封的一种类似于信封式外壳的微球, 被形象地称之为多功能信封型纳米系统。理想的MEND包括生物大分子压缩物和修饰各种功能基团的信封型脂质结构两部分(图 1)。以DNA为例, MEND的制备思路为[4]:第一步, 利用多聚阳离子如聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine, PLL)与DNA的静电作用, 室温涡旋将DNA压缩, 形成多聚阳离子-DNA复合物(DNA/PLL complex, DPC); 第二步, DPC通过静电及水合作用与脂质体膜亲和; 第三步, 用超声的方法, 将DPC包裹于脂质体中。
目前, 常用的基因非病毒载体有脂质体、纳米粒和阳离子多聚物等。这些载体通常借助静电吸附作用实现对核酸等荷负电性生物大分子类物质的包载, 这种装载形式的载药量和载药稳定性往往不甚理想, 显著降低了转染效率。MEND在制备过程中利用多聚阳离子将生物大分子物质压缩再包裹, 能够双重保护负载物免受体内酶系统的降解, 提高药物的稳定性; 与传统的非病毒载体相比, 生物大分子预压缩可以有效控制载体大小, 提升装载水平, 同时转染效率也随之提高[5, 6]。此外, MEND可赋予多功能修饰, 如靶向配体、pH敏感肽和核定位信号等, 用以克服生理屏障, 实现靶标递送。尽管MEND具备上述优势也面临一些问题, 如DNA不能有效地从压缩物中解压缩, 显著降低了核转录效率; 阳离子压缩材料与mRNA之间电荷吸引会抑制翻译过程等[7]。
2 MEND的应用 2.1 siRNA的递送RNA干扰[8] (RNA interference, RNAi)是指通过外源性或内源性的双链RNA在体内诱导靶基因mRNA的特异性降解, 从而引发基因沉默的现象。siRNA作为RNAi的效应分子, 已成为人们研究的热点。研究结果证实MEND能够很好地克服siRNA在体内易被核酸酶降解、半衰期短且转染效率低的缺点, 已被广泛用于载运siRNA。
2.1.1 聚乙二醇修饰的MEND许多研究人员将聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修饰于脂质体表面, 可改善脂质体的稳定性, 降低单核巨噬细胞系统的识别和摄取, 延长脂质体的体内循环时间, 并能通过“增强的渗透与滞留”效应将脂质体被动靶向于肿瘤组织中[9]。随着研究的深入, PEG化脂质体也产生了一些问题, 如PEG链抑制靶细胞对脂质体的摄取、阻碍pH敏感脂质体细胞内的“内涵体逃逸”及对同一动物体内重复注射PEG化脂质体诱发的加速血液清除现象等[10]。为了解决这一困境, Hatakeyama等[11]提出在PEG与MEND中间插入一种对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)敏感的肽, 制备了PEG-peptide-DOPE-MEND (PPD-MEND)。在肿瘤细胞周围会分泌大量的MMP, 当PPD-MEND到达肿瘤组织后, PEG被MMP剪切脱离MEND表面, 大大提高内化效率。在Balb/c裸鼠体内实验中, PPD-MEND能够引起约70%肿瘤细胞产生基因沉默效应, 并没有肝毒性和免疫刺激, 表现出良好的载体性质[12]。
2.1.2 pH敏感穿膜肽修饰的MEND传统的肺靶向非病毒载体一般使用阳离子脂质或阳离子聚合物[13, 14], 然而阳离子聚合物在肺毛细血管易被短暂的捕获与红细胞聚集形成大团聚体, 造成肺部血管的微梗塞, 从而诱发一系列临床问题。为了解决这一问题, 研究者从流感病毒递送基因的机制中获得启发, 设计出了一种pH敏感穿膜肽GALA (WEAALAEALAEALAE HLAEALAEALEALAA)修饰的MEND[15]。通过对比GALA-MEND和阳离子脂质体在肺部的激光共聚焦图像得知, 阳离子脂质体在肺部聚集成微米大小的团块, 而GALA-MEND则是均匀分散的。通过计算荧光强度的变异系数来量化两种载体的聚集程度, 结果可知, 阳离子脂质体的变异系数随着时间的推移逐渐降低, GALA-MEND则基本保持不变。有研究报道GALA-MEND用包膜水化法(film coated hydration method)制备, 2014年Kusumoto等[16]发现乙醇注入法(ethanol dilution method)可放大比例制备GALA-MEND, 并能提高GALA-MEND载体对肺部的靶向性, 产生更强的基因沉默。因此, GALA修饰的MEND能有效地增强siRNA转染效率和基因沉默效果。
2.1.3 pH敏感的阳离子脂质修饰的MENDYSK05是一种pH敏感的阳离子脂质, 具有良好的膜融合性能[17]。YSK05结构中的亲水部分含有叔胺基团(图 2A), pKa为6.6。在内涵体酸性环境中YSK05发生质子化, 促进与带负电的内涵体膜融合(图 2B)。因此YSK05修饰的MEND有利于siRNA内涵体逃逸进入细胞质中。Polo样激酶1 (polo-like kinasel, PLK1)是一种重要的细胞周期调节分子, PLK1基因沉默增强人肾癌细胞OS-RC-2对多柔比星的敏感性, 采用特异siRNA敲除PLK1基因的表达, 增强多柔比星对肾癌细胞的疗效[18]。Harashima课题组[18]将荷载沉默PLK1的siRNA (si-PLK1)的YSK05-MEND, 与多柔比星联合治疗肾细胞癌。实验表明, PLK1 mRNA的表达量比对照组下降了约50%, 多柔比星的IC50下降了90%。肿瘤抑制实验中, 联合用药组(多柔比星和YSK-MENDsi-PLK1合用)能够平稳地抑制肿瘤的生长, 平均肿瘤体积明显小于对照组。
树突状细胞(dendritic cell, DCs)是目前功能最强的抗原提呈细胞, 能摄取、加工及呈递抗原, 启动T细胞介导的免疫反应, 是目前肿瘤治疗的一种新的途径。研究发现, SOCS1基因沉默会增强DCs抗肿瘤的活性[19], 目前只有病毒载体可以有效地实现SOCS1基因沉默, 现利用RNA干扰调控DCs的功能。DCs的内涵体环境为偏中性, pKa为6.6的YSK05不能在内涵体中发生质子化。Warashina等[20]基于YSK05的结构, 合成了pKa为8.0的YSK12-C4 (图 2C), 将其用于修饰MEND制得YSK12-MEND。YSK12-C4可以在内涵体中质子化, 与内涵体膜发生融合促进siRNA释放到细胞质中。研究表明, anti-SOCS1/YSK12-MEND可达到90%的基因沉默, ED50为1.5 nmol·L-1; 而市售转染试剂Lipofectamine™ 2000的基因沉默率不到60%, ED50为25 nmol·L-1。由此可见, YSK12-MEND载体的应用是树突状细胞免疫治疗在生物学研究中的一个突破。Nakamura等[21]对YSK12-MEND进行稳定性考察, 在0.5、1、2、6 h粒径没有发生变化, 粒子之间没有产生聚集。可见, YSK12-MEND具有较好的稳定性, 有利于细胞摄取与转染。
Yamamoto等[22]对YSK05的结构进行了改进, 合成了YSK13-C3 (图 2D)。将靶向乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的siRNAmix包裹于YSK13-C3-MEND (HBV-siRNAmix/MEND)中, 用来治疗HBV。HBV-siRNAmix/MEND能抑制乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen, HBeAg)和HBV DNA的水平, 而传统的抗乙肝病毒药物恩替卡韦(entecavir, ETV)能有效降低HBV DNA的水平, 对降低HBV抗原的效果不明显。实验显示, 单剂量HBV-siRNAmix/MEND降低HBV DNA的效果与使用ETV 7天的效果相当。此外, ETV用药35天, 不能有效地降低HBsAg和HBeAg水平。因此, HBV-siRNAmix/MEND比逆转录酶抑制剂更能有效地治疗HBV, 有望成为治疗HBV的有效手段之一。
2.1.4 配体修饰的MEND肿瘤内皮细胞(tumor endothelial cells, TECs)是组成肿瘤血管的一部分, 由于其基因遗传稳定性, 产生耐药的可能性较小。Sato等[23]选用TECs作为治疗肿瘤的新型靶标, 将环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸[(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys, RGD), cRGD]修饰MEND (RGD-MEND), 其中cRGD可以特异性靶向TECs中的αVβ3整合素[24]。将荷载siRNA的RGD-MEND注射入荷瘤鼠体内, 激光共聚焦结果显示, siRNA/cRGD-MEND特异性聚集在肿瘤内皮细胞。Sakurai等[25]将cRGD和YSK05共同修饰MEND, 制备成cRGD-YSK05-MEND。研究表明, siRNA/cRGD-YSK05-MEND可特异性靶向TECs, 显著地使TEC中的基因产生沉默, 而其他内皮细胞及组织均未影响, 肿瘤生长显著抑制, 且没有肝毒性, 而传统的脂质体对肝脏有一定程度的损害。
2.2 DNA的递送成功的DNA递送系统要能够有效地进入细胞, 穿过细胞质, 定位到细胞核, 并将药物释放到细胞核内。在此过程中, 要克服细胞膜、内涵体膜和核膜等多重障碍。在非分裂细胞中, 核膜稳定, 外来物质很难进入核内。因此, 如何穿过细胞核的双层膜将是研究面临的最大难题[26, 27]。
2.2.1 细胞穿透肽修饰的MENDMEND具有良好的生物相容性, 能够提高转染效率, 有利于内涵体逃逸。未修饰的MEND粒径一般在300 nm左右, 电位约-40 mV。研究表明, DPC的转染率是裸露的DNA的1 000倍, DNA/MEND的转染率比DPC提高了10倍[4]。精氨酸八聚体(R8)是一种细胞穿透肽, 在生理条件下精氨酸的胍头基与细胞表面膜上带负电的磷酸基和硫酸基产生氢键结合, 进而产生细胞内化作用。高密度R8修饰的脂质体能够提高药物转染效率, 不易被溶酶体降解[28]。Kogure等[4]将细胞穿透肽R8修饰MEND, 制得R8-MEND, 研究表明, R8-MEND促进DNA细胞内化, 转染效率比未修饰的MEND提高了100倍, 且没有明显的细胞毒性。
2.2.2 麦芽三糖修饰的MEND研究证实, 非阳离子型、水溶性的糖分子能够作为核定位信号, 其中麦芽三糖(maltotriose, malto)具有良好的核聚集性质[29-31]。Akita等[32]利用Malto和GALA修饰MEND制备了GALA-Malto-MEND。粒径在220~240 nm内, 其转染活性是未修饰MEND的100倍。在与阳离子聚合物及市售转染试剂jetPEI-Gal (Polyplus-transfection Inc. USA)的对比研究中, GALA-Malto-MEND表现出明显的优越性, 转染活性分别是前者的20.8和15.8倍且未出现明显的细胞毒性。因此GALA-Malto-MEND将是一种高效、安全的基因载体。
2.2.3 pH敏感肽修饰的MENDKALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)是一种pH敏感的肽, 从酸性到中性的环境中, 其形态从无规则的线性变成α-螺旋状, 从而可以诱导载体膜与核膜融合, 完成药物在细胞核的释放[33]。基于此肽段, Miura等[34]设计了一种新型的DNA载体—KALA-MEND。KALA-MEND比传统的R8-MEND的转染活性提高了100倍。于C57BL/6 (H-2b)小鼠注射KALA-MEND, 能够诱发抗原特异性毒性T淋巴细胞的活性, 并产生预防性和治疗性的抗肿瘤作用。因此, KALA-MEND具有双重功能:基因转染和免疫促进作用。
2.2.4 四分子层的MENDAkita等[35]对R8-MEND进行了改进, 设计了四分子层的MEND (tetra-lamellar MEND, T-MEND)。外层膜为内涵体融合膜, 内层膜为细胞核融合膜。T-MEND通过阶梯式膜融合方式实现细胞内化, 进入细胞核, 能有效地将DNA带入细胞核中。T-MEND的转染率是R8-MEND的100倍; 与市售的转染试剂Lipofectamine 2000相比, T-MEND将转染率提高了10倍。因此, T-MEND是一种有效的基因载体, 能够将DNA送至细胞核。
有学者将KALA与R8同时修饰T-MEND, 构建了一种R8/KALA-T-MEND[36]。与传统的R8-T-MEND相比, R8/KALA-T-MEND的转染效率提高了30倍, 且远远超过市售的转染试剂(LFN Plus) 10倍。在体内抗肿瘤实验中, 注射R8/KALA-T-MEND组的小鼠肿瘤体积为0.5×104 mm3明显低于对照组的体积(2.6×104 mm3), 表现出了良好的抗肿瘤特性。因此R8/KALA-T-MEND为DNA载体开辟了一个新的方向。
2.2.5 类脂质材料修饰的MEND研究发现[7], 非病毒载体携带目的基因在细胞内转录和翻译是主要的限速步骤。其中DNA不能有效地从阳离子聚合物中解压缩, 靶向染色体能力减弱, 显著降低了核转录效率; 阳离子脂质体复合物与mRNA之间电荷吸引会抑制翻译过程。基于这些缺点, 学者们设计了一种装载有pDNA的纳米粒(lipid nano particle, LNP)[37], LNP在胞浆中呈中性, 避免与mRNA电荷吸引, 并可在胞浆内破裂从而释放pDNA。设计LNP关键的分子是一种含有二硫键的可被质子激活的类脂质材料(SS-cleavable proton-activated lipid-like material, ssPalm)。ssPalm具有双感应系统, 在胞浆中二硫键发生断裂, 信封式结构破裂, pDNA暴露; 在偏酸性细胞器中(内涵体/溶酶体)带正电的叔胺会破坏内涵体、溶酶体膜。第一代ssPalm (ssPalmM)是以肉豆蔻酸为疏水支架, 其基因表达水平比MENDDOTAP高, 细胞毒性低[38]; 第二代ssPalm (ssPalmA)是以脂溶性维生素为疏水性支架, 能强烈地破坏内涵体膜, 有利于目的基因从中逃逸, 以完整的形态到达细胞核边缘[39]。因此, ssPalm可改善非病毒载体的缺点, 提高目的基因的转染效率。
2.3 蛋白/多肽的递送 2.3.1 抑制素受体介导的MEND抑制素(prohibitin)是表达于人体白脂肪血管内皮细胞表面的受体, Kolonin等[40]首次发现小环肽CKGGRAKDC可特异性结合该蛋白受体。基于这一特点, Harashima课题组[41]设计了一种KGGRAKD肽修饰的的纳米粒(prohibitin-targeted nanoparticle, PTNP), 该载体能选择性地被脂肪血管内皮细胞摄取, 与脂肪组织内皮细胞的抑制素特异性结合。但含有靶向配体的PTNP容易被肝脏和肾脏的网状内皮系统识别, 致使PTNP从血液循环中快速清除。他们引入PEG修饰纳米粒表面以增加体内循环时间, 减少在肝脏中的分布水平。研究表明, 当PEG2000和PEG5000 (连接纳米粒和KGGRAKD)同时修饰纳米粒表面效果最好(图 3)。装载促凋亡肽[D(KLAKLAK)2]的PTNP (KLA-PTNP)可以显著地诱导肥胖小鼠脂肪组织血管内皮细胞凋亡。因此, PTNP潜力巨大, 为肥胖症的治疗提供了一个新的策略。
为了治疗线粒体基因组(mitochondrial deoxyribonucleic acid, mtDNA)突变与缺陷导致的疾病[42], 需要将活性大分子药物递送至线粒体内。该传递过程必须克服两个障碍, 即如何穿过细胞膜进入细胞质和穿过线粒体膜进入线粒体。Yamada等[43]成功开发出一种脂质体—MITO-Porter, 该载体可通过膜融合的方式将药物输送至线粒体内。利用绿色荧光蛋白作为模型分子, 通过激光共聚焦显微镜观察证实: MITO-Porter可以有效地将药物运输至线粒体内。基于这种传统的MITO-Porter, 研发出了双功能(dual function, DF)-MITO-Porter[44, 45]。DF-MITO-Porter是由两层信封型脂质膜构成。外层膜称为内涵体融合膜, 能够实现载体与内涵体膜的融合; 内层膜称为线粒体融合膜, 实现载体与线粒体膜的融合。在外层膜的表面修饰有高密度R8, 能够帮助载体高效地进入细胞。当载体进入细胞后, 载体的外层膜与内涵体膜融合, 载体释放到细胞质中。然后通过R8与线粒体的静电作用及内层膜的融合, 将药物释放到线粒体内。激光共聚焦实验显示, 与传统的MITO-Porter相比, DF-MITO-Porter能够更有效地将外源性生物活性大分子递送至线粒体内。进一步研究证实, DF-MITO-Porter运载DNaseⅠ蛋白能够显著降低线粒体内mtDNA水平。可见, DF-MITO-Porter作为mtDNA的靶向干预载体颇具潜力。
2.3.3 肿瘤疫苗肿瘤免疫治疗是通过激活或调动人体自身免疫系统, 增强机体抗肿瘤免疫力, 杀死细胞和肿瘤组织的抗癌疗法。与传统治疗肿瘤的方法手术、放疗和化疗相比, 肿瘤免疫治疗具有损伤小、不良反应小等优点。外源性抗原进入胞质内被溶酶体降解成短肽片段, 在主要组织相容性复合体-Ⅱ的作用下, 被辅助性T细胞识别, 启动免疫反应。因此, 将外源性抗原输送至细胞质是肿瘤免疫治疗的关键一步。Miura等[46]用KALA-MEND作为载体, 将卵清蛋白(ovalbumin, OVA)包裹, 制备肿瘤疫苗OVA/KALA-MEND, 皮下注射C57BL/6J小鼠体内, 产生免疫7天后接种肿瘤细胞, 观察肿瘤体积变化。结果显示, OVA/KALA-MEND能有效抑制肿瘤生长。接种15天, 肿瘤完全被抑制; 接种27天, 60%的小鼠肿瘤被抑制。通过检测OVA特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)效应, 当OVA剂量为13 μg时, OVA/KALA-MEND可引发强大的CTL效应。因此, KALA-MEND是一种具有潜力的肿瘤疫苗抗原递送载体。
3 展望与结语多功能信封型纳米系统是基于“程序包装”的概念设计出来的, 由于其独特的结构, 包含了诸多非病毒载体的优点, 如包封率高、转染效率高、低免疫原性和生物相容性好等。10余年来学者们研究开发了一系列基于MEND的载体, 不仅能够运输siRNA和DNA等核酸类成分, 还能够携载蛋白质、多肽等生物大分子物质并且通过引入不同的功能性成分能够实现细胞质、细胞核, 甚至线粒体等细胞器定位。如前所述, 在MEND载体规模化制备方面, Kusumoto等[16]发现乙醇注入法相比传统的包膜水化法更具优势, 然而为了将MEND类似载体的开发研究向临床试验阶段推进, 仍有必要对制备工艺进行全方位的优化和改进。
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