熊果酸(ursolic acid, UA)又名乌索酸(乌苏酸), 存在于多种天然药用植物中, 近来有学者发现可以从苹果渣中提取熊果酸[1], 其市场发展潜力巨大。熊果酸具有五环三萜类化合物的典型结构, 具有抗炎[2]、护心脑血管[3]、抗癌保肝[4]、抗菌, 抗HIV病毒[5]等多种药理作用。目前, 对熊果酸的结构修饰多集中在A环、C-3位和C-28位[6, 7]。研究证明, 在熊果酸C-3位保持极性基团对其保持活性十分重要[8], 在C-28位连接氨基醇类化合物、成酯等结构改造均能使熊果酸抗肿瘤活性有不同程度的提高[9, 10], 而在其A环引入杂环时, 对其抗肿瘤活性也会产生较大影响[11-13]。本文以熊果酸为先导化合物, 参考前人对五环三萜类化合物进行结构改造的经验[14-16], 对熊果酸A环、C-11位、C-28位进行结构改造, 设计合成了两类共10个熊果酸A环衍生物。
以熊果酸为起始原料, 用三氧化铬将C-3位和C-11位同时氧化, 得到3, 11-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-酸(1), 将中间体1与卤代烷类化合物反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应, 生成一系列5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸酯类衍生物(3~8)。将中间体1与氨基醇类化合物反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应得到一系列5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰-氨基醇类衍生物(11~14), 见合成路线图 1。
以熊果酸为先导化合物, 对其A环、C-11和C-28进行结构改造, 设计并合成了两类共10个熊果酸衍生物, 其结构1H NMR、MS等确证。数据见表 1和表 2。
以紫杉醇(paclitaxel)和多柔比星(adriamycin)为阳性对照物, 采用四甲基偶氮唑盐法(MTT比色法)对合成的化合物进行初步的体外抗肿瘤活性测试, 实验结果见表 3。
从表中可以看出, 在化合物浓度为1×10-5 mol·L-1时所测试的目标化合物对HepG2和SGC7901细胞的生长均具有一定的抑制作用, 且优于母体熊果酸。C-28位羧基连接卤代烷类化合物成酯时, 化合物抗肿瘤活性化合物6 > 4 > 8 > 7 > 5 > 3, 结果表明连接具有支链的卤代烷较直链卤代烷有更好的活性; 同时, 随着卤代烷碳链的增长, 其抗肿瘤活性也有所增加。C-28位羧基连接氨基醇类化合物成醇胺时, 化合物12表现出较好的抗肿瘤活性, 对两种肿瘤细胞的抑制率分别为52.83%和49.56%, 与阳性对照药紫杉醇活性相当。综上所述, 认为化合物6、12值得进一步研究。
3 小结本文以熊果酸为先导化合物, 对其A环、C-11和C-28进行结构改造, 设计合成了两类共10个熊果酸衍生物, 经体外初步药理活性测试显示, 熊果酸A环骈合4-氯吲哚环, 同时C-28位羧基与卤代烷反应成酯可以提高熊果酸抗肿瘤活性, 卤代烷的长短及结构对其活性有较大影响; 而当C-28位羧基与氨基醇反应成醇胺时也可提高熊果酸的抗肿瘤活性, 连接氨基醇的结构是影响活性的主要因素。本研究结果对熊果酸的进一步结构修饰有一定的参考意义。
实验部分X-4数字显示显微熔点测定仪; ARX-300 MHz核磁共振仪, CDCl3为溶剂, TMS为内标; 热电-菲尼根LCQ型质谱仪。熊果酸购于陕西慧科植物开发有限公司; 薄层色谱硅胶GF254、硅胶H为青岛海洋化工有限公司生产, 显色剂为10%硫酸乙醇溶液; 活性测试所用的RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素); 溴化四氮唑盐(MTT)、蛋白酶K (proteinase K)和小牛血清蛋白(BSA)购于上海图赫实业有限公司; 阳性对照物紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素(adriamycin)购于阿斯利康制药有限公司; 人癌细胞HepG2、SGC7901细胞为沈阳药科大学提供。所用试剂均为分析纯或化学纯。
1 化学合成 1.1 3, 11-氧代-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸的制备(1)将熊果酸(228 mg, 0.5 mmol)溶解于5%乙酸酐的乙酸溶液中(0.75 mL乙酸酐, 14.25 mL乙酸), 加入CrO3 (99.6 mg, 0.99 mmol), 室温反应, TLC检测反应终点。4 h反应完毕, 加入水(20 mL)和二氯甲烷(20 mL), 分层后, 水层以二氯甲烷(20 mL)萃取两次, 合并有机相, 用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至微碱性, 再水洗至中性, 无水硫酸钠干燥, 减压抽滤, 滤液减压脱溶得到绿色胶状物。粗品经硅胶柱色谱分离纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=5:1, 得白色固体, 中间体1。
1.2 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸正丙酯(3)将中间体UA1 (126 mg, 0.22 mmol)溶于N, N-二甲基甲酰胺(DMF, 4 mL), 加入无水碳酸钾(0.06 g, 0.44 mmol), 缓慢滴加4倍当量1-溴丙烷(0.88 mmol), 室温反应, TLC检测反应终点(展开剂:石油醚-乙酸乙酯=5:1), 5 h反应结束。减压蒸出剩余的卤代烷后, 加入饱和食盐水(20 mL)和乙酸乙酯(20 mL), 分离有机相, 有机相用饱和食盐水(20 mL×3)萃取3次, 有机相用无水硫酸镁干燥, 过滤, 滤液减压脱溶得淡黄色固体。粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=13:1, 得白色固体2。
将4-氯苯肼盐酸盐(180 mg, 0.1 mmol)溶解于冰乙酸(10 mL), 118 ℃冷凝回流。将化合物2a (50 mg, 0.1 mmol)溶解在冰乙酸(5 mL)中, 缓慢滴加到4-氯苯肼盐酸盐溶液中, 继续回流, 以TLC监测反应终点。4 h反应结束, 向反应体系中缓慢滴加水(10 mL), 降至室温, 析出黄褐色固体, 减压抽滤, 水洗滤饼至中性。室温干燥, 得黄褐色固体。粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=3:1, 得白色粉末状固体3。产率为58.3%, mp 157~159 ℃。
1.3 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸异丙酯(4)按照化合物3的合成方法, 由中间体1与1-溴异丙烷反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=13:1, 得白色粉末状固体4, 产率为54.6%。mp 140~144 ℃。
1.4 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸正丁酯(5)按照化合物3的合成方法, 由中间体1与1-溴正丁烷反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=15:1, 得白色粉末状固体5, 产率为46.6%。mp 229~233 ℃。
1.5 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸异丁酯(6)按照化合物3的合成方法, 由中间体2与1-溴异丁烷反应再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=15:1, 得白色粉末状固体6, 产率为44.8%, mp 225~227 ℃。
1.6 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸正戊酯(7)按照化合物3的合成方法, 由中间体2与溴代正戊烷反应再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=13:1, 得白色粉末状固体7, 产率为53.2%。mp 241~245 ℃。
1.7 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-羧酸正己酯(8)按照化合物3的合成方法, 由中间体2与溴己烷反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=7:1, 得白色粉末状固体8, 产率为45.5%。mp 249~254 ℃。
1.8 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰-氨基乙醇(11)将中间体1 (120 mg, 0.2 mmol)溶解于5 mL二氯甲烷, 加入草酰氯(0.8 mmol), 并加入2滴DMF作为催化剂, 在室温下搅拌4 h, 生成5'-Cl-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰氯(9)。蒸除溶剂二氯甲烷和草酰氯, 残余物加入2 mL环己烷, 减压蒸除环己烷, 反复操作两次。向产物中加入二氯甲烷, 用三乙胺调pH至8~9, 待pH稳定后再加入氨基乙醇(0.8 mmol), 室温搅拌24 h, TLC监测反应终点, 反应完成后, 加入30 mL水, 使其分层, 用盐酸调pH至3, 减压蒸除反应溶剂, 析出黄色固体。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=7:1, 得白色粉末状固体10。
将4-氯苯肼盐酸盐(180 mg, 0.1 mmol)溶解于冰乙酸(10 mL), 118 ℃冷凝回流。将化合物10 (50 mg, 0.1 mmol)溶解在冰乙酸(5 mL)中, 缓慢滴加到4-氯苯肼盐酸盐溶液中, 继续回流, 以TLC监测反应终点。4 h反应结束, 向反应体系中缓慢滴加水(10 mL), 降至室温, 析出黄褐色固体, 减压抽滤, 水洗滤饼至中性。室温干燥, 得黄褐色固体。粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=3:1, 得白色粉末状固体11。产率为48.7%。mp 186~189 ℃。
1.9 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰-2-氨基-1-丙醇(12)按照化合物11的合成方法, 由中间体1与2-氨基-1-丙醇反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=7:1, 得白色粉末状固体12, 产率为44.8%。mp 184~186 ℃。
1.10 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰-3-氨基-1-丙醇(13)按照化合物11的合成方法, 由中间体1与3-氨基-1-丙醇反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=7:1, 得白色粉末状固体13, 产率为44.6%。mp 142~144 ℃。
1.11 5'-氯-[2, 3-b]-吲哚-乌苏烷型-11-羰基-12-烯-28-酰-2-氨基苄醇(14)按照化合物11的合成方法, 由中间体1与邻氨基苄醇反应后再与4-氯苯肼盐酸盐反应。最终粗品经硅胶柱色谱纯化, 洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=7:1, 得白色粉末状固体14, 产率为61.2%。mp 244~248 ℃。
2 初步体外活性测试选择人肺癌细胞(HepG2)和人胃癌细胞(SGC7901)靶细胞, 以紫杉醇(paclitaxel)和阿霉素(adriamycin)为阳性对照物。用MTT比色法测定化合物细胞毒活性。
取0.25%胰蛋白酶消化单层培养的SGC7901 (HepG2)细胞, 用含10%胎牛血清RPMI 1640培养液调整细胞数为每毫升2×104~4×104个的单细胞悬液, 以每孔200 μL接种于96孔培养板中。将培养板放入CO2培养箱, 在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养, 待培养细胞贴壁后, 分别加入浓度为1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8 mol·L-1的待测药物, 每浓度6个孔, 实验设空白对照组, 继续放入CO2培养箱, 在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养72 h。培养72 h后, 每孔加入MTT溶液(5 mg·mL-1 20 μL, 37 ℃继续培养4 h, 中止培养, 离心弃去孔内上清液, 每孔加入DMSO 150 μL溶解甲臜沉淀, 超声振荡10 min混均。在MR700型酶联免疫检测仪上测定570 nm处各孔吸收度(A)值, 按公式:抑制率/% = [1-(A实验组-A空白组) / (A对照组-A空白组)] × 100%。计算化合物对细胞的抑制率, 重复测试3次, 取平均值为最终结果。
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