2017, Vol. 52
2. 江西中医药大学 中药资源与民族药研究中心, 江西 南昌 330004
2. Research Center for the Resourcing of Traditional Chinese Medicine and Minority Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸[Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.]、石虎[E. rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis (Dode) Huang]或疏毛吴茱萸[Euodia. rutaecarpa (Juss.) Benth. var. bodinier (Dode) Huang]的干燥近成熟果实[1], 主要含有生物碱、柠檬苦素、萜类、黄酮、香豆精、甾体、挥发油、木脂素、多糖等化学成分[2, 3]。吴茱萸具有明确的镇痛止呕功效, 常用于眩晕、头痛、肋痛、呕吐、腹泻、痛经、脑震荡后遗症等多种疾病的治疗。目前, 对吴茱萸药理作用研究大多集中在其镇痛、抗炎、保护心脏、降血压等方面[4, 5], 有关吴茱萸止呕作用研究则相对较少。已有研究表明, 吴茱萸50%醇洗脱液、70%醇洗脱液、生物碱组分和水煎液具有止呕作用[6, 7], 但吴茱萸具体的止呕成分尚不清楚。基于此, 有必要对吴茱萸止呕药效物质基础做进一步研究。
近年来, 谱-效关系已广泛应用于中药物质基础的研究[8, 9]和质量控制[10, 11]等领域。谱-效关系是通过对指纹图谱和药效作用进行分析, 进而阐明指纹图谱特征与药效的相互关系, 确定相应的药效物质基础[12]。构建中药谱-效关系需借助复杂系统建模的方法, 正交偏最小二乘法(OPLS)是一种改进的偏最小二乘法, 能有效去除预测矩阵中与因变量Y无关的信息, 改善模型的解释性和真实性[12], 能够较为准确地给出色谱峰与药效的相关性以及贡献大小, 从而找出发挥药效的活性物质。
本文首先建立了吴茱萸药材的超高液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS)指纹图谱, 然后采用经典的呕吐研究方法—灌服硫酸铜致家鸽呕吐来研究吴茱萸不同部位的止呕效应, 最后以正交偏最小二乘(OPLS)法进行谱-效分析, 初步探索吴茱萸发挥呕吐作用的主要药效成分, 为进一步明确吴茱萸止呕作用的物质基础提供实验依据。
材料与方法 实验动物健康家鸽170只, 体重(350 ± 50) g, 雌雄各半, 由南昌市湾里区市售。
药物与试剂吴茱萸药材采集于江西新干县淦川镇, 经江西中医药大学曹岚副教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的干燥近成熟果实。盐酸昂丹司琼(福安药业集团宁波天衡制药有限公司, 批号: 160101011);硫酸铜(天津市福晨化学试剂厂); 石油醚(60~90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为分析醇(西陇化工股份有限公司); 色谱纯甲醇、乙腈(TEDIA公司, 美国); 水为超纯水。
仪器Nexera X2高效液相色谱仪(岛津公司, 日本), 包括DGU-20A5R脱气器, SIL-30AC自动进样器, SPD-M20A二极管阵列检测器, CTO-30A柱温箱, LC-30AD二元泵; AB SCIEX Triple TOF 5600质谱仪(AB SCIEX, 美国); 数据采集软件: Analyst TF 1.6 software (AB SCIEX, 美国); 数据处理软件: Marker View 1.2.1/PeakView 2.0 software (AB SCIEX, 美国); SIMCA-P+14.1 (MKS Umetrics, Umea, 瑞典); 电子分析天平(AE-240, 北京赛多利斯仪器有限公司, 中国)。
药材样品制备采用醇水双提法以使吴茱萸提取完全。精密称取吴茱萸药材2.5 kg, 加入8倍量75%乙醇, 回流提取2次, 时间分别为1.5、1.0 h, 合并滤液得醇提液。药渣加入10倍量水煎煮2次, 时间分别为1.0、0.5 h, 合并滤液得水提液。醇提液减压回收乙醇至无醇味, 与水提液合并, 浓缩得到药液浸膏, 加水稀释浸膏, 依次用石油醚(60~90 ℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取, 重复3~5次, 合并, 得到5个不同提取部位的浸出物, 分别挥干有机溶剂, 冷冻干燥, 得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水相部分浸膏, 密封置冰箱中冷藏, 临用前加入5%聚山梨酯-80助溶配成一定浓度的溶液即得吴茱萸不同提取部位的供试液, 以备不同提取部位的药效实验用。
分析溶液的制备精密称取浸膏1.0 g, 以甲醇定容至25.0 mL, 摇匀, 经0.22 μm微孔滤膜滤过, 即得供试品溶液, 以备建立不同提取部位UHPLC指纹图谱用。
色谱条件采用ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm, 1.8 µm); 流动相: A: 0.2%甲酸水, B: 0.2%甲酸乙腈; 流速: 0.3 mL·min-1; 柱温: 30 ℃, 进样量: 2.0 µL。进样梯度如下: 0~20 min, 5% B→62% B; 20~40 min, 62% B→95% B; 40~42 min, 95% B→5% B; 42~45 min, 5% B。
质谱条件离子源:电子喷雾离子源(ESI); 离子化方式:正离子扫描; TOF-MS质量扫描范围(m/z): 100~2 000 Da; TOF-MS/MS质量扫描范围(m/z) 50~2 000 Da; GS1: 60 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); GS2: 60 psi; 气帘气压力(CUR): 35 psi; 离子源温度(TEM): 500 ℃; 离子喷雾电压(ISVF): 5 000 V; 去簇电压(DP): 100 V, 母离子碰撞能量(CE): 10 V, 子离子碰撞能量(CE): 35 V, 子离子碰撞能量差(CES): 15 V。
动物实验[6]健康家鸽170只, 雌雄各半, 按性别、体重随机分为17组, 每组10只, 编号。即正常组、盐酸昂丹司琼组、石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位的高、中、低剂量组, 以吴茱萸临床常用剂量为依据, 按成人(60 kg)处方日用量(10 g)的临床等效量的1、2、4倍设计, 设定高、中、低剂量分别为1.40、0.70和0.35 g·kg-1, 阳性药组2 mg·kg-1, 给药组按10 mL·kg-1每天灌服样品一次, 对照组给予等量蒸馏水, 连续给药7天。末次给药1 h后, 每鸽灌服3%硫酸铜溶液10 mL·kg-1。完毕立即观察并记录各鸽出现第1次呕吐的时间(呕吐潜伏期)和给硫酸铜后1 h内呕吐的次数(呕吐频率)。
统计学方法数据用x± s表示, 采用SPSS 17.0统计软件对各组参数进行单因素方差分析, 进行组间比较, P＜0.05为数据统计有显著性差异。
质谱数据处理将采集到的原始质谱数据利用MarkerView 1.2.1软件进行峰提取、峰匹配、峰对齐、峰识别以及归一化等预处理, 导出由样品名称、保留时间、质荷比、以及对应的离子强度组成的数据集。
多元统计分析将导出的质谱数据和药效数据导入SIMCA-P软件中, 采用自适换算(Unit Variance Scaling)进行标准化。通过变量权重重要性排序(variable importance in the projection, VIP)值筛选贡献大的药效成分。
结果 1 UHPLC指纹图谱的建立经过色谱条件和质谱条件的优化, 选择正离子模式下, 取供试品溶液进行分析, 建立吴茱萸不同提取部位的UHPLC-MS指纹图谱, 见图 1。
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Figure 1 UHPLC fingerprints of different fractions of Euodiae Fructus. About 54 chromatographic peaks were numbered by Arabic numerals from 1 to 54. These peaks were used for the subsequent spectrum-effect analysis, and their numbers are consistent. A: Petroleum ether Fr (fraction); B: Chloroform Fr; C: Ethyl acetate Fr; D: n-Butanol Fr; E: Water Fr |
与模型组比较, 盐酸昂丹司琼阳性药组能显著地延长家鸽呕吐潜伏周期, 呈现显著性差异, 显示出较好的止呕效果。实验组除乙酸乙酯部位外, 吴茱萸不同提取部位各剂量组均能减少家鸽的呕吐次数(P＜0.05, P＜0.01), 5个不同提取部位对家鸽止呕作用大小为:水部位＞氯仿部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞乙酸乙酯部位, 说明水部位止呕效果最好, 见表 1。
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Table 1 The influence of different fraction of Euodiae Fructus on pigeon vomiting induced by copper sulfate. n = 10, x± s. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
对由色谱峰变量(X)和药效数据变量(Y)构成的矩阵采用SIMCA软件进行OPLS分析, 结果见图 2。
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Figure 2 OPLS results of the five Euodiae Fructus fractions on pigeon vomiting induced by copper sulfate. A: Score scatter plot of different fractures; B: Loading scatter plot of the variants (compounds corresponding to the chromatography peaks. Blue dots, the Y variants; red dots, significant X variants; and green dots, insignificant X variants); C: Coefficient overview plot of different compounds in three doses (the compounds are marked in the right bar with the same colors); D: VIP values of different compounds |
图 2A为Score Scatter Plot, 5个不同提取部位分布在不同的区域。X轴由左至右, 呕吐次数从小变大, 即止呕作用由大变小。从图中可以观察到:从左至右依次为水部位、氯仿部位、正丁醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位, 表明不同部位提取物对家鸽止呕作用存在差异, 且水部位止呕作用效果最好。
图 2B (loading scatter plot)表征了所有X变量对于Y变量的影响作用。在本研究中, 揭示的是各色谱峰所代表的化合物如何影响呕吐次数的大小。在Loading Scatter Plot上, 若X变量与Y变量在相同象限, 则该部分X变量与Y变量成正相关; 若X变量与Y变量在相对象限, 则成负相关。同时, X变量的分布位置离原点越远, 则相关性越大。基于此, 可以初步选取和呕吐次数大小成正相关的数10个变量。
图 2C (coefficient pverview plot)直观展示了高、中、低3个剂量组中各化合物对呕吐次数的影响, 其柱高代表的是相关系数, 相关系数越大, 影响越大。分布在X轴的上方的化合物是正影响(正相关); 位于X轴下方的化合物为负影响(负相关)。
图 2D为VIP值图, VIP值是OPLS中评价变量贡献大小最常用的方法, 一般认为VIP＞1的X变量对于Y变量的影响是显著性的, 因此具有统计学意义。图中所有VIP＞1的色谱峰中, 7、22以及37号色谱峰对止呕药效的贡献最为显著, 其次为35、4、3、47、6、8、9和5号色谱峰。除17、18号色谱峰与止呕活性呈负相关外, 其余色谱峰对止呕活性影响均为正相关, 这些呈正相关的变量能够较为明显地减少呕吐次数, 其表征的化学成分很有可能是吴茱萸的止呕成分。
4 吴茱萸止呕作用活性化合物的鉴定基于先前的UHPLC-Q-TOF-MS分析方法[13], 对吴茱萸提取物中的化学成分进行了结构解析, 鉴定了吴茱萸提取物中47个主要化学成分(另文发表)。与本文相关的化合物的Q-TOF/MS数据及鉴定结果见表 2, 共鉴定了11个止呕活性成分, 3个化合物尚需进一步确证。
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Table 2 MS/MS data from (+/-) ESI-MS of antiemetic active compounds in ER |
本研究建立了吴茱萸不同提取部位的UHPLC-MS指纹图谱, 采用的超高液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS)技术能够快速、准确的指认出特征峰所表征的化学成分。
止呕实验结果表明, 与对照组比较, 吴茱萸不同部位提取物除乙酸乙酯部位外, 均具有止呕作用, 能显著减少家鸽的呕吐次数(P＜0.05, P＜0.01), 各部位高剂量组止呕效应最为突出, 强于中、低剂量组, 随着给药剂量的增加, 家鸽呕吐的次数逐渐减少, 呕吐潜伏期逐渐延长, 呈现一定的剂量依赖关系。不同提取部位对家鸽止呕作用强度为:水部位＞氯仿部位＞正丁醇部位＞石油醚部位, 说明水部位止呕作用最强, 极性大的组分止呕效果最好, 与文献结果[6, 7]基本一致。
本研究采用OPLS方法, 使用SIMCA软件分析, 使用散点图、得分图等可以使分析结果图形化, 从而更直观准确地筛选出吴茱萸止呕活性物质。OPLS结果显示, 色谱峰变量(X)对药效数据变量(Y)呈现正相关和负相关。正相关表明色谱峰变量(X)表征的化合物能显著减少呕吐次数, 具有明显得止呕效果, 其可能为吴茱萸止呕活性成分; 负相关则表示色谱峰变量(X)无止呕效应。在止呕实验中, 11个色谱峰与镇痛的药效作用呈正相关, 其中7、22、37号色谱峰对止呕的药效作用有显著贡献, 这些与止呕药效作用呈正相关的色谱峰表征的化合物很有可能是吴茱萸的止呕成分。此外, 研究还发现17号色谱峰和18号色谱峰与止呕的药效作用呈负相关, 能显著增加呕吐次数, 推测其表征的化合物可能为催吐成分, 尚需进一步研究。
基于谱-效相关分析方法, 本研究初步筛选出了11个物质, 包括芦丁(rutin)、柠檬苦素(limonin)、金丝桃苷(hyperoside)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(narcissoside)、柯伊利素-7-O-芸香糖苷(chrysoeriol-7-O-rutinoside)、异鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷(isorhamnetin-3-O-β-D-galactoside)、1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮(1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolone)、1-甲基-2-[(Z)-4-壬烯基]-4(1H)-喹诺酮(1-methyl-2-[(Z)-4-nonenyl]-4(1H)-quinolone)等。大部分化合物为生物碱类化合物, 这与文献[7]的结果基本吻合, 表明生物碱可能是吴茱萸主要止呕活性成分。此外, 本研究还筛选到了5个黄酮类化合物(芦丁、金丝桃苷等), 且这些成分在吴茱萸水溶液中含量相对较高[5], 说明这些水溶性成分与吴茱萸的止呕药理活性相关, 可能也是吴茱萸止呕活性成分。
本研究初步探讨了吴茱萸指纹图谱与药效之间的关系, 为研究吴茱萸止呕物质基础提供更全面、可靠的实验依据, 同时为吴茱萸的质量控制和临床使用提供科学依据。
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