1 作用靶标和研发目标

精氨酸加压素(1, arginine vasopressin, AVP)是含有精氨酸的九肽, AVP作为内源性肽作用于血管V_1a受体引起血管收缩; 也可作用于肾脏V₂受体产生抗利尿作用。在生理情况下, AVP的功能是维持血浆的渗透浓度、血液体积和调节血压。AVP的V₂受体拮抗剂可促进体液的排泄而利尿, 因而是治疗慢性充血性心力衰竭(CHF)和低钠血症的利尿药。大冢制药研发V₂拮抗剂的目标, 是能够口服吸收的小分子药物, 通过排水利尿作为治疗CHF和低钠血症的非肽类AVP受体拮抗剂。

2 活性评价方法

体外评价化合物对V_1a和V₂活性的方法, 是[³H]-AVP分别与大鼠肝细胞膜的V_1a受体和大鼠肾细胞膜的V₂受体发生的特异性结合, 被置换出50%的受试化合物浓度(IC₅₀)为活性指标, IC₅₀值越小, 化合物的拮抗作用越强。评价体内活性的方法是用清醒大鼠首先静脉注射一定量AVP使血管收缩血压升高, 然后灌胃不同剂量的受试化合物, 在不同的时间点测定血压的变化, 计算比对照组加压素引起的血压降低50%的化合物剂量(ID₅₀)作为化合物活性的量度。

3 苗头化合物的发现和向先导物的过渡 3.1 随机筛选发现苗头化合物

由于V_1a和V₂受体的三维结构尚属未知, 而且也未发现较小的肽化合物有抑制活性, 因而采用随机筛选方法评价公司内的2万个化合物样品, 发现数个含有四氢喹啉酮的化合物具有初步活性, 尤其是化合物2对V_1a的IC₅₀为2.5 μmol·L^-1, 对V₂的IC₅₀＞1 000 μmol·L^-1。

3.2 噻吩甲酰基的变换

初做结构变换, 最容易想到和做到的是变换噻吩甲酰基, 因为酰化仲胺容易进行合成。将杂环替换噻吩环的结果表明, 化合物3 ~5的活性反而降低, 推测是这些杂环的极性比噻吩强的缘故。而极性弱的苯甲酰化合物6与2的活性相近。但苯甲酰基变换成苯乙酰基(7)或苄基(9)活性都显著降低。表 1列出了化合物2 ~9的结构和活性, 不过这些化合物对V₂受体均未显示活性。

3.3 苯甲酰环上取代基的变换

苯甲酰化合物6的活性可与苗头物比肩, 继之用取代苯甲酸做优化变换, 合成有代表性的化合物列于表 2中, 由于原料易得, 合成了相当“整齐”的化合物, 这在难以合成或步骤较多的结构优化中较少遇到。表 2的化合物构效关系如下: ① 苯环对位取代的活性强于间位, 间位强于邻位, 无论是氯代、硝基、甲基或甲氧基取代, 都遵循这个规律, 提示以后的结构变换都在苯环的对位。② 因4-甲氧基和4-甲基的活性强, 进而合成C₂~C₄取代的化合物, 对V₁受体都处于高活性范围, 其中4-乙氧基(22)和4-正丙氧基(23)活性最强。③ 还合成了对位氨基、羟基、酰氧基、羧基、羧酯基、酰胺基、氰基等取代物, 但活性都低于4-烷氧基化合物。

对V_1a受体抑制活性高的化合物15、22、23和27进一步做体内实验, 大鼠注射AVP后灌胃受试物, 测定血管舒张压的变化, 结果表明这些化合物活性弱, 提示体内对AVP的拮抗作用低, 例如22灌胃30 mg·kg^-1, 抑制加压素的作用只有75%。分析原因, 可能是化合物的亲脂性过强, 影响了溶解和吸收, 须增加分子的亲水性, 调整化合物的分配性以利于吸收。

3.4 提高溶解性—引入助溶性基团

根据上述的构效关系, 引入助溶基团比较适宜的位置是在苯环的侧链上, 因为链的长短对活性的影响不大。将氨基或酰胺基等极性基团连接到链端, 合成了有代表性的化合物29 ~45, 变换链长以获得最佳活性。表 3列出了化合物的结构和活性。

分析表 3化合物的构效关系, 归纳如下: ① 侧链端基为游离氨基的化合物29 ~34活性随链的碳数增加而提高, C₈化合物34对V_1a受体的活性最强, IC₅₀ = 0.068 μmol·L^-1。② 端基为甲酰胺基或乙酰胺基化合物35 ~45的活性与碳链的变化不明显, 41是该系列的活性最强的化合物。③ 相同烷链的氨基化合物(29 ~34)与酰胺基化合物(37 ~42)的活性相近, 提示碱性或中性侧链对活性影响的差异较小。④ 酰胺化合物45的氮原子被甲基化, 氮上无氢, 活性无显著变化, 提示化合物没有同V_1a受体发生氢键结合作用。

以上合成的化合物体外活性多数显示对V_1a受体的抑制作用, 只有少数化合物对V₂有中等强度的作用。含游离氨基的化合物30 ~32体外抑制V_1a受体活性很强, 但大鼠实验并未显示抑制加压素的增高血压作用, 但被酰化的化合物37 ~39体内活性有所提高, 不过距离既定目标相差甚远(Ogawa H, Yamamura Y, Miyamoto H, et al. Orally active, nonpeptide vasopressin VI antagonists. A novel series of 1-(1-substituted 4-piperidyl)-3, 4-dihdyro-2(1H)-quinolinone. J Med Chem, 1993, 36: 2011-2017)。

4 针对V₂受体的新结构 4.1 骨架变换的探索

研发至此, 继续坚持上述的路径难以实现对V₂受体的拮抗作用, 须另辟蹊径。为此回到初始合成的化合物12, 由于12对V₂受体有弱抑制活性(IC₅₀ = 78 μmol·L^-1)。研发者考虑到两个因素促使他们对12的结构改造转轨到新的方向。一是认为哌啶环作为饱和环状结构有多变的构象体, 可能不利于同V₂受体结合, 因而试图用刚性的苯环替换哌啶以期化合物有稳固的结构骨架; 另一是结构中的两个酰胺的连接方向“不顺”, 呈......CONH......NHCO......样的配置与天然肽链的连接方向不同, 因而拟将骨架的连接方式变成......NHCO......NHCO......, 这样, 就将化合物12的结构变换成46。

4.2 新结构类型—先导化合物的发现

由四氢喹啉酮-哌啶类化合物(如12)变换为苯甲酰四氢喹啉骨架的相应化合物46, 对V₁和V₂受体的抑制活性发生了质的飞跃, 首次获得了对V₂活性超越了V₁受体的分子, 而且活性很高, IC₅₀ = 1.9 μmol·L^-1, 从而将46作为先导化合物进行优化。在化学结构的层面上, 这类化合物是由3个模块经两个酰胺连接在一起, 对于基团变换和位置的变迁的化学合成也是容易实现的。

4.3 末端苯环取代基的结构优化和构效关系

在进行末端苯环取代基变换之时, 要考察中间苯环的1, 4-位连接是否是最佳位置配置, 因而合成了1, 3和1, 2连接的相应化合物, 发现对V₂受体的活性几乎降低了2个数量级, 提示对位连接是优势骨架, 因而末端苯环的取代基变换都是按1, 4连接配置的。表 4列出了这些化合物的结构及其活性。

分析表 4中化合物的构效关系, 概括如下: ① 4-Cl被4-OCH₃取代, 活性(指对V₂受体的活性, 下同)基本未变, 但延长烷氧基的碳链, 活性显著下降(例如化合物48和49)。这与前述烷氧链长对V₁受体无显著影响是不同的。② R在2-或3-位取代比4-位取代的活性高(化合物54的2-OCH₃例外), 可能是处于4-位的R基团有位阻效应而不利于结合。③ 2-甲基化合物55是优选的化合物之一, 2, 4-二氯和2, 4-二甲基化合物(分别为62和63)的活性也很高, 可能是2-位基团的邻位阻迫效应, 使构象处于稳定的有利状态, 并避开了4-R的不利因素。④ 活性最强的是3, 5-二氯化合物(64), IC₅₀ = 0.082 μmol·L^-1。

4.4 末端苯环的变换

在新型骨架下因为分子形状的改变, 会影响在受体部位的分子取向和结合模式, 因而需要探求末端苯环是否仍是最佳结构, 为此合成了化合物65 ~72, 考察将苯环变换成烷基、芳烷基或杂芳基对活性的影响。表 5列出了化合物的结构和活性。

前已述及的R=苯基的化合物52有中等强度活性, IC₅₀ = 0.98 μmol·L^-1, 变换成烷基(65 ~67)导致活性降低。苯环被苄基代替, 化合物68的活性未变, 而苯乙基、吡啶环、呋喃环和噻吩环的置换都使活性显著下降, 所以, 末端苯环不宜改变。

4.5 四氢喹啉环的变换

优化至此, 构成分子骨架的结构片段只剩下另一末端即四氢喹啉环的变换了。在四氢喹啉环的杂环中再加入一个杂原子或扩环成七或八元环, 末端苯环作2-位取代, 合成的化合物结构与活性列于表 6中。

由于前述的末端苯环上2-甲基取代可提高抑制V₂受体的活性(如化合物55), 故本系列合成的化合物大都含有2-甲基的取代, 更换成氯(76)或无取代的化合物(77)也是为了佐证2-甲基的必要性。

表 6化合物的构效关系总结如下: ① 杂环上再引入一个杂原子如化合物73和74, 导致活性降低, 可能是增加了环的极性缘故。② 扩环成七元环如化合物75和76, 不仅显著提高了对V₂的抑制活性, 而且也对V_1a呈现强抑制活性。③ 苯并二氮䓬 80和苯并氮杂环辛烷82对V₂有选择性抑制活性。

值得提及的是化合物81虽然抑制V₂受体的活性不是很高(IC₅₀ = 0.17 μmol·L^-1), 但大鼠灌胃100 mg·kg^-1显示有利尿作用, 给药后4 h内的排尿量比对照组增加了5~6倍, 利尿作用显著。分析原因可能是81含有碱性氮原子, 提高了受试物的生物利用度。这个发现促使研究者在母核上引入碱性基团。

5 里程碑式化合物—莫扎伐普坦上市 5.1 苯并氮片段的优化

基于合成化学的考虑, 以化合物75为新的起点, 在苯并氮的5位引入不同的烷胺基, 同时变换末端苯环的2-位取代基, 以双位点变换优化结构, 合成了化合物83 ~106, 化学结构和体外活性列于表 7。

分析表 7中化合物的构效关系可概括如下: ① 在苯并氮的5位引入二甲胺基, 化合物83 ~87保持对V₂受体强抑制活性, 也降低了对V₁的抑制, 因而提高了化合物的选择性。② 末端苯环固定为2-甲基取代, 母核苯并氮5位变换为伯胺、仲胺或各种取代的叔胺, 提示对V₂受体的活性影响较小, 大都仍保持较高的活性。然而哌啶环取代(97)的活性较低, 可能是环状结构位阻较大的缘故。③ 5位为乙酰氨基化合物99活性较低, 但脲基(化合物100)的活性很高, 推测碱性不是活性的决定因素。④ 5位为羟基的化合物98活性很高, 也佐证了碱性不是呈现高活性所必需。

用这个系列的高活性化合物灌胃大鼠, 体内评价抑制加压素增加利尿的作用, 发现5位胺基简单取代的化合物的利尿活性与离体的抑制V₂受体相平行。然而化合物92 ~94的体外抑制V₂受体的活性很高, 体内活性却较差。

5.2 选择性V₂受体拮抗剂—莫扎伐普坦

化合物84的体内实验呈现最强的口服利尿作用, 灌胃3.8 mg·kg^-1, 2 h内排尿量比对照组增加了3倍(ED₃ = 3.8 mg·kg^-1), 多种实验动物模型证明84是V₂受体选择性拮抗剂, 从而大冢制药命名化合物84为莫扎伐普坦(mozavaptan)作为候选化合物进入开发阶段, 经临床研究证明莫扎伐普坦适于治疗抗利尿激素分泌失调综合征(SIADH)所引起的低钠血症, 于2006年在日本上市(Ogawa H, Yamashita H, Kondo K, et al. Orally active, nonpeptide vasopressin V2 receptor antagonists: a novel series of 1-[4-(benzoylamino)benzoyl]-2, 3, 4, 5-tetrahydro-1H-benzazepines and related compounds. J Med Chem, 1996, 39: 3547-3555)。

6 以莫扎伐普坦为先导物的继续优化 6.1 苯并氮苯环上的取代

由于苯并氮在5位作二甲胺基取代, 对提高口服生物利用度和体内活性方面有突破性进展, 并以莫扎伐普坦(84)的上市成为里程碑式的标志。但优化的空间仍然存在。继续优化结构的位点是并合氮的苯环和中央的苯环, 这两个位置还没有作系统的研究。

以莫扎伐普坦为先导结构进行优化, 首先是在苯环的6、7、8、9位分别做氯原子取代(避免极性原子和基团), 得到化合物107、108、109和110, 其化学结构及其体内外活性列于表 8中。

表 8的数据表明, 莫扎伐普坦的苯并氮的6、8或9位引入氯原子, 对V₂受体的抑制作用降低5~16倍, 体内抑制加压素的抗排尿作用也弱于莫扎伐普坦, 但7-氯代莫扎伐普坦(108)却完全不同, 它的体外活性与莫扎伐普坦相当, 体内活性却非凡的强。

6.2 苯并氮的5位再优化

前面的研究表明, 5位的胺基体积的大小对与V₂受体的结合有重要影响, 为了考察7-位连接了氯原子之后母核5位基团对活性的影响, 合成了化合物111 ~116, 其结构与体内外活性列于表 9。

表 9中所列的体外抑制V₂活性, 表明5-甲胺基(化合物111)的活性强于二甲胺(108) 3.6倍, 变换为烯丙基(112)尤其是N-甲基烯丙基化合物(113)则活性下降。然而5-羟基或5-烃氧基的体外活性很高, 尤其是化合物114的IC₅₀ = 0.003 μmol·L^-1。不过, 口服体内活性达不到莫扎伐普坦水平。

6.3 终极的优化—托伐普坦的诞生和上市

为了消除7-氯-5-羟基化合物114的体内外活性的差距, 提高口服的活性, 进行优化的位点只有未经变换的中央苯环上的取代了。为了提高体内吸收和生物利用度, 在极性基团较多的化合物114结构中加入疏水性基团, 以平衡化合物的亲脂-亲水性, 合成了表 10列出的化合物。

表 10的数据显示, 化合物117 (2-Cl)和119 (2-CH₃)体外抑制V₂受体的活性与114相当, 但对V₁受体的抑制作用很弱, 因而这两个化合物的选择性比114强。化合物120对V₁和V₂受体的作用都很强, 选择性低的原因推测甲氧基是氢键的接受体, V₁受体的结合需要形成氢键的结合。

化合物119不仅对V₂的选择性高, 而且大鼠灌胃的体内拮抗加压素的抗利尿作用也很强, 提示有良好的药代动力学性质, ED₃的剂量为0.54 mg·kg^-1, 是体内活性最强的化合物。进而分别用转染人V₂和V₁受体HeLa细胞实验, 表明119有很强的选择性抑制人V₂受体的活性。119分子中含有一个手性碳原子, 经拆分成R和S异构体, 分别评价了对人V₂和V₁受体的活性, 结果表明消旋体与光学异构体没有差异, 因而使用消旋体。通过安全性实验和药代动力学研究, 确定了化合物119进入临床研究, 定名为托伐普坦(tolvaptan)。经临床研究证明托伐普坦可用于治疗由充血性心衰、肝硬化以及抗利尿激素分泌不足综合征导致的低钠血症, 遂于2009年经美国FDA批准上市, 成为第一个选择性抑制加压素V₂受体的药物(Kondo K, Ogawa H, Yamashita H, et al. 7-Chloro-5-hydroxy-1-[2-methyl-4-(2-methylbenzoylamino)benzoyl]-2, 3, 4, 5-tetrahydro-1H-1-benzazepine (OPC-41061): a potent, orally active nonpeptide arginine vasopressin V2 receptor antagonist. Bioorg Med Chem, 1999, 7: 1743-1754)。