布洛芬(ibuprofen, IBP)为非甾体抗炎药, 主要通过抑制前列腺素或其他炎症介质合成而发挥抗炎、解热、镇痛作用。目前, 布洛芬主要以消旋体给药, 其左右旋体在体内的药理活性存在显著的差异, 其中右旋布洛芬(S-IBP)在抑制前列腺素生成上优于左旋布洛芬(R-IBP)。布洛芬以消旋体给药后, 部分左旋布洛芬可通过形成辅酶A硫脂单向地转化为右旋布洛芬^{[1, 2]}, 所以有必要研究布洛芬对映体各自的药动学参数。

目前, 国内外血浆中布洛芬对映体浓度的测定方法主要包括LC-UV法^[3-6]和LC-MS/MS^[7-10]。血浆样品前处理方法有: ① 液液萃取法^{[3, 4, 7-10]}:样品经提取、吹干、复溶等步骤后测定, 操作繁琐。② 固相萃取法^{[5, 9]}: SPE柱成本相对较高。③ 蛋白沉淀法^[6]:此方法应用犬血浆样品测定。

本研究首次采用甲醇沉淀蛋白前处理方法, 使用液质联用仪测定人血浆中布洛芬对映体浓度, S-IBP和R-IBP定量下限均为0.05 μg·mL^-1, 并将此方法应用于布洛芬缓释胶囊中国健康受试者人体药动学研究。

仪器  液质联用仪: API4000三重串联四极杆质谱仪, AB Sciex公司; Agilent1200液相色谱仪, Agilent公司; 数据处理系统为Analyst 1.4.2, AB Sciex公司。分析天平: XS 105DU型(Max₂ = 41 g, d₂ = 0.01 mg), Mettler Toledo公司。

对照品和试剂   S-IBP对照品(批号101203-201201, 中国食品药品检定研究院, 含量为99.9%)。R-IBP对照品(批号1175-070A2, TLC Pharmachem, 含量为99.6%)。萘普生对照品(批号100198-201205, 中国食品药品检定研究院, 含量为99.6%); 乙腈和甲醇(HPLC级, Merck KGaA); 甲酸(AR级, 上海凌峰化学试剂有限公司); 水(灭菌注射用水, 石家庄四药有限公司)。空白血浆来自健康志愿者。

试验药物  布洛芬缓释胶囊(中美天津史克制药有限公司生产、商品名芬必得^®, 产品批号13030887, 含量99.3%, 规格300 mg/粒)。

色谱条件  色谱柱为Daicel公司Chiralpak AD-3R (4.6 mm × 150 mm, 3.0 μm), 保护柱为Chiralpak AD-3R (4.0 mm × 10 mm, 3.0 μm); 流动相为乙腈-0.01%甲酸水溶液(40:60);流速750 μL·min^-1; 分析时间23.0 min, 0~8.0 min A通道(排废), 8.0~23.0 min B通道(质谱系统); 进样量20 μL; 柱温25 ℃。

质谱条件  电喷雾离子源(ESI), 负离子电离模式; 雾化气50 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 加热辅助气50 psi, 离子源温度550 ℃; 采用多反应监测(MRM); S-IBP和R-IBP监测离子对均为m/z 205.1→161.0, 去簇电压(DP)为-60 V, 射入电压(EP)为-10 V, 碰撞能量(CE)为-11 V, 碰撞室的射出电压(CXP)为-6 V; 内标萘普生监测离子对为m/z 229.1→185.0, 去簇电压(DP)为-40 V, 射入电压(EP)为-10 V, 碰撞能量(CE)为-9 V, 碰撞室的射出电压(CXP)为-6 V。

储备液和工作液配制  S-IBP和R-IBP标准曲线储备液和工作液:称量S-IBP和R-IBP各10.00 mg于10 mL量瓶用甲醇定容, 混匀得1.000 mg·mL^-1 S-IBP和R-IBP标准曲线储备液, 用甲醇稀释至浓度为1.000、3.000、10.00、30.00、100.0、300.0和600.0 μg·mL^-1的标准曲线系列工作液。将1.000 mg·mL^-1 S-IBP和R-IBP储备液, 用甲醇稀释至浓度为2.400、48.00和480.0 μg·mL^-1的质控系列工作液。内标萘普生储备液及工作液:称取萘普生对照品10.00 mg于10 mL量瓶用甲醇定容, 混匀得1.000 mg·mL^-1内标储备液, 并用甲醇稀释5.000 μg·mL^-1内标萘普生工作液。

标准曲线和质控血浆样品制备和处理  取空白血浆200 μL置1.5 mL离心管中, 加入S-IBP和R-IBP标准曲线或质控工作液10 μL和内标萘普生工作液50 μL, 混匀后加入甲醇600 μL沉淀血浆蛋白, 涡旋1 min, 于23 755×g、4 ℃离心10 min。离心后取上清液400 μL置进样瓶中, 加入水相400 μL, 涡旋混匀后, 置于自动进样器中进样测定S-IBP和R-IBP浓度。

方法学验证

特异性实验  分别取S-IBP和R-IBP对照溶液、萘普生对照溶液、空白血浆按“标准曲线和质控血浆样品制备和处理”项方法处理样品; 空白血浆200 μL和S-IBP和R-IBP对照品溶液(均30.00 μg·mL^-1) 10 μL混匀后按“标准曲线和质控血浆样品制备和处理”项方法操作样品; 受试者口服布洛芬缓释胶囊300 mg后2.0 h的血浆按“受试者血浆样品处理”项方法操作样品, 进样检测。

标准曲线和定量下限  取空白血浆200 μL, 分别加入S-IBP和R-IBP标准曲线系列工作液10 μL, 制备血浆中S-IBP和R-IBP浓度均为0.05000、0.1500、0.5000、1.500、5.000、15.00和30.00 μg·mL^-1的标准曲线系列血浆样品, 按“标准曲线和质控血浆样品制备和处理”项方法处理, 进样检测, 以S-IBP或R-IBP浓度为横坐标, S-IBP或R-IBP峰面积与内标萘普生峰面积的比值为纵坐标, 权重系数为1/C², 进行线性回归。

精密度与准确度  取空白血浆200 μL, 分别加入S-IBP和R-IBP质控系列工作液10 μL (2.400、48.00和480.0 μg·mL^-1), 制备血浆中S-IBP和R-IBP浓度分别均为0.1200、2.400和24.00 μg·mL^-1的质控系列血浆样品, 每个浓度6样品, 按“标准曲线和质控血浆样品制备和处理”项方法处理, 测定3批, 根据每批随行标准曲线, 计算样品的实测浓度, 用Excel软件中单因素方差分析计算S-IBP和R-IBP批间和批内精密度, 同时计算相对偏差。

提取回收率  按精密度与准确度实验方法制备含S-IBP和R-IBP分别为0.120 0、2.400和24.00 μg·mL^-1的血浆样品, 每个浓度6个样品, 按“标准曲线和质控血浆样品制备和处理”项方法处理, 以其进样测定得到的峰面积除以空白血浆经蛋白沉淀后直接加入低、中、高S-IBP和R-IBP质控系列工作液及内标萘普生工作液后检测得到的峰面积, 计算血浆中S-IBP、R-IBP和内标萘普生的提取回收率。

基质效应  取6个不同来源的空白血浆200 μL至1.5 mL离心管中, 分别加入甲醇600 μL, 涡旋1 min, 4 ℃离心(23 755×g) 10 min, 取上清液700 μL作血浆基质; 另取纯化水200 μL至1.5 mL离心管中, 同法处理得到对照基质。分别取对照基质和血浆基质700 μL, 加入S-IBP和R-IBP质控系列工作液10 μL和内标萘普生工作液50 μL混匀, 吸取该溶液400 μL至进样瓶中, 加入水相400 μL, 混匀。上述样品每个浓度6份并按“色谱条件”和“质谱条件”项检测, 获得S-IBP、R-IBP和内标萘普生峰面积, 以每一浓度样品两种基质的峰面积比值计算基质效应。

受试者血浆样品处理  取受试者血浆样品200 μL置1.5 mL离心管中, 加入甲醇10 μL和内标萘普生工作液50 μL, 混匀后加入甲醇600 μL沉淀血浆蛋白, 涡旋1 min, 于23 755×g、4 ℃离心10 min。离心后取上清液400 μL置进样瓶中, 加入水相400 μL, 涡旋混匀后, 置于自动进样器中进样测定S-IBP和R-IBP浓度。

人体药动学研究方案  临床试验方案经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准。12名男性健康受试者均签署知情同意书, 年龄在(23 ± 3) 岁, 试验开始两周前至试验期间未服用其他任何药物, 体重指数均在19~24内, 心电图正常, 肝、肾功能正常, 均符合受试者入选标准。12名受试者空腹口服布洛芬缓释胶囊(芬必得^®, 300 mg/粒) 1粒, 250 mL温开水送服, 于服药前和服药后0.50、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10、12、15和24 h由肘静脉取血4 mL。所有血液样品置肝素化采血管中, 离心(2 304×g, 4 ℃, 5 min), 分离上层血浆, 于-30 ℃冰箱中保存, 待测。

结果显示, S-IBP和R-IBP的保留时间分别为16.60和15.02 min, 内标萘普生的保留时间为11.75 min, 内源性物质不干扰S-IBP和R-IBP和内标萘普生的测定, 见图 1。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 LC-MS/MS Chromatograms of S-IBP (S-(+)-ibuprofen) and R-IBP (R-(-)-ibuprofen). A: Standard solution of S-IBP (1.500 μg·mL-1); B: Standard solution of R-IBP (1.500 μg·mL-1); C: Standard solution of naproxen (1.250 μg·mL-1); D: Blank plasma; E: Spiked plasma sample obtained by the addition of 10 μL standard solution of S-IBP and R-IBP (1.000 μg·mL-1) to 200 μL blank plasma; F: Spiked plasma sample obtained by the addition of 10 μL standard solution of S-IBP and R-IBP (30.00 μg·mL-1) to 200 μL blank plasma; G: Plasma obtained from a volunteer at 2.0 h after orally administration ibuprofen extended-release capsule

S-IBP回归方程为ƒ = 0.526×C + 0.005 83 (r = 0.999 7)。R-IBP回归方程为ƒ = 0.501×C + 0.005 41 (r = 0.998 3)。结果表明, S-IBP和R-IBP在0.05~30.00 μg·mL^-1内线性关系均较好, 定量下限LLOQ均为0.05 μg·mL^-1。

结果显示, S-IBP和R-IBP低、中、高三浓度质控样品批间和批内RSD均小于15%, RE均在± 15%范围内。

结果显示, 血浆中S-IBP低、中、高三个浓度的提取回收率分别为96.7% ± 4.6% (n = 6)、104.1% ± 1.9% (n = 6) 和103.3% ± 4.7% (n = 6);血浆中R-IBP低、中、高三个浓度的提取回收率分别为100.3% ± 4.4% (n = 6)、97.5% ± 2.6% (n = 6) 和99.7% ± 2.0% (n = 6);内标萘普生的提取回收率为101.3% ± 2.8% (n = 18)。

结果显示, 血浆中S-IBP低、中、高三个浓度的基质效应分别为100.8% ± 2.2% (n = 6)、100.6% ± 1.9% (n = 6) 和96.3% ± 3.5% (n = 6);血浆中S-IBP低、中、高三个浓度的基质效应分别为101.5% ± 4.1% (n = 6)、97.4% ± 3.6% (n = 6) 和96.7% ± 2.7% (n = 6);内标萘普生的基质效应为98.4% ± 3.4% (n = 18)。

结果显示, S-IBP和R-IBP血浆样品室温放置(25 ℃) 6 h、-30 ℃冰冻47天和反复冻融3次情况下均稳定; 待测样品自动进样器放置(4 ℃) 48 h, 血浆蛋白沉淀离心后上清液样品室温放置(25 ℃) 6 h。S-IBP和R-IBP储备液在室温放置24 h和在冷藏(2~8 ℃) 26天情况下稳定; 内标萘普生储备液在室温放置24 h和在冷藏(2~8 ℃) 26天情况下稳定。

12名受试者空腹口服布洛芬后S-IBP和R-IBP的平均血药浓度-时间曲线见图 2, 主要药动学参数见表 1。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of ibuprofen enantiomers after a single oral dose of 300 mg ibuprofen extended-release capsule in 12 healthy male volunteers. n = 12, x± s

表1(Table 1)

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of ibuprofen (IBP) enantiomers after a single oral dose of 300 mg IBP extended-release capsule. n = 12, x± s. NA: Not applicable Parameter 300 mg 300 mg (Literature[3]) Racemic IBP S-IBP R-IBP Racemic IBP S-IBP R-IBP AUC0-24 h /μg·h·mL-1 104.3 ± 21.3 63.60 ± 12.20 40.73 ± 13.05 111.26 ± 13.90 66.39 ± 11.21 44.89 ± 5.85 AUC0-∞ /μg·h·mL-1 105.3 ± 21.2 64.14 ± 12.20 41.04 ± 12.99 NA NA NA Cmax /μg·mL-1 14.62 ± 3.49 8.239 ± 1.593 7.042 ± 2.274 13.94 ± 2.23 8.15 ± 1.58 5.98 ± 1.04 tmax /h 5.33 ± 1.07 5.67 ± 0.89 4.58 ± 0.67 5.25 ± 1.07 5.25 ± 1.07 4.44 ± 0.32 t1/2 /h 2.90 ± 0.86 2.75 ± 0.61 2.7 8 ± 1.62 3.45 ± 2.11 3.97 ± 2.11 3.34 ± 0.84 CL/F /L·h-1 2.959 ± 0.607 2.435 ± 0.561 4.015 ± 1.296 3.00 ± 0.42 2.65 ± 0.52 3.72 ± 0.82

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of ibuprofen (IBP) enantiomers after a single oral dose of 300 mg IBP extended-release capsule. n = 12, x± s. NA: Not applicable

本研究建立的LC-MS/MS测定人血浆中布洛芬对映体浓度, 定量下限为0.05 μg·mL^-1, 低于文献^{[3, 5-10]}报道, Shi等^[4]采用液液萃取法, 操作繁琐。本方法可满足布洛芬缓释胶囊的药动学研究大量样品测定。

手性拆分是药物分析的热点, 也是定量测定手性药物的前提。Xiang等^[3]采用大赛璐多糖衍生物正相手性柱, Chiralcel OJ-H, 流动性为正己烷-异丙醇-三氟醋酸, 不适合LC-MS/MS。本文采用大赛璐多糖衍生物反相手性柱Chiralpak AD-3R, 硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3, 5-二甲苯基氨基甲酸酯), 与正相柱Chiralpak AD-H比较, 反相柱涂敷的手性聚合物与正相柱相同, 但是所用的硅胶不同。反相柱使用水/有机溶剂流动相, 适合分析水溶性样品(比如生物活性样品), 可应用于LC-MS/MS中。

本研究对色谱和质谱条件进行了优化考察, 初期尝试使用Daicel公司官网推荐的色谱条件:乙腈-pH 2.0甲酸水溶液(50/50), 结果显示: S-IBP和R-IBP仪器响应低, 考虑负离子监测模式下, 流动性pH低, 不利于负离子的形成, 故减小甲酸水溶液中甲酸的比例。最终选择乙腈-0.01%甲酸水溶液(40:60) 为流动相, S-IBP和R-IBP的响应较高且保留时间适中。

血浆样品沉淀蛋白, 离心后, 取上清液400 μL, 并加入水相400 μL, 是为了将进样样品中水的比例提高至近似流动相的比例, 防止发生二次化学平衡现象, 改善峰形。

12例受试者口服布洛芬缓释胶囊胶囊300 mg后, 血浆中S-IBP和R-IBP主要药动学参数AUC、C_max、t_max、t_1/2和CL/F与文献^[3]基本一致。布洛芬消旋体、S-IBP和R-IBP之间除AUC、C_max和CL/F外, 其他主要药动学参数均无统计学差异。S-IBP的AUC_0-24h均数是布洛芬消旋体的61.0%, 是R-IBP的156.2%; S-IBP的C_max均数是布洛芬消旋体的56.4%, 是R-IBP的C_max的117.0%。R-IBP的清除较S-IBP快。