2017, Vol. 52
2. 中国科学院上海药物研究所, 上海 201203
2. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China
罗汉果为葫芦科植物罗汉果的干燥果实, 具有清热润肺、利咽开音、滑肠通便的功效[1]。现代的药理学研究表明罗汉果具有抗糖尿病、抗癌、抗氧化等作用[2-4]。
罗汉果皂苷类成分是罗汉果的主要化学成分。体内、外实验结果均表明罗汉果皂苷ⅠA1、ⅠE1、ⅡE、Ⅲ、Ⅳ、ⅣE、Ⅴ和赛门苷Ⅰ可脱掉糖基变为相应苷元——罗汉果醇(结构见图 1A)[5-7]。近年来, 一些体外实验研究显示, 罗汉果醇具有抗白血病[8]和糖尿病[9,10]的作用。然而, 当前仅有少数文献[10,11]报道有关罗汉果醇体内药代动力学过程, 可能与罗汉果醇属于四环三萜类化合物、缺少共轭以及易于电离的基团、体内分析的方法较难建立有关。
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Figure 1 Chemical structures of mogrol (A) and internal standard (IS) paclitaxel (B) |
本文旨在采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF/MS)法鉴定大鼠血浆中罗汉果醇主要代谢产物, 并建立一种简单、快速、准确的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法来测定主要成分血浆浓度, 以评价其药代动力学, 从而为罗汉果醇进一步药用开发奠定基础。
材料与方法药品和试剂 罗汉果醇(纯度99.0%)购自成都普瑞法生物科技有限公司; 内标紫杉醇(图 1B) (纯度99.6%, 批号: 100382) 购自中国食品药品检定研究院。甲醇(德国Merck公司)、乙腈(德国Merck公司)、醋酸铵(美国ROE公司)、甲酸(德国Fluka公司)均为色谱纯。碳酸锂(纯度99%, 批号: F20090310) 购自国药集团化学试剂公司。去离子水由法国Millipore纯水仪制得。
代谢产物鉴定
仪器 美国Waters公司的Acquity UPLC®液相色谱系统, 配备TUV紫外检测器; 美国AB SCIEX公司的Triple TOF 5600+型四极杆-飞行时间串联质谱仪(Q-TOF/MS), 配有电喷雾电离源(ESI源)和CDS自动校正系统; 控制软件为美国AB Sciex公司的Analyst ®TFV1.6和Waters公司的Masslynx V4.1软件; 数据分析软件为美国AB Sciex公司的MetabolitePilotV1.5软件。
色谱条件 色谱柱: Acquity UPLC® HSS T3色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 1.8 µm, 美国Waters公司); 流动相: A相为含0.1%甲酸水溶液, B相为甲醇; 梯度洗脱: 0~1.0 min, 10% B; 1.0~7.0 min, 10%~35% B; 7.0~10.0 min, 35%~65% B; 10.0~16.0 min, 65%~99% B; 16.0~17.0 min, 99%~10% B; 17.0~20.0 min, 10% B。柱温: 40 ℃; 流速为0.4 mL·min-1; 进样量7.0 µL。
质谱条件 离子源为电喷雾电离源(ESI源); 负离子扫描方式检测; 离子源气体1 (N2)压力为55 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 离子源气体2 (N2)压力为50 psi; 气帘气体(N2)压力为40 psi; 源温度为500 ℃; 离子喷雾电压(ISVF)为-4.5 kV; 去簇电压为-80 V; 一级全扫描时碰撞能量为-10 eV; 产物离子扫描时碰撞能量为-50 ± 20 eV; 扫描范围为m/z 100~800, 采用自动校正系统(CDS)外标法校正质量数。
血浆浓度测定
仪器 美国Waters公司的Acquity UPLC®I-Class液相色谱系统, 配备ACQUITYFTN自动进样器; 美国AB Sciex公司的Triple Quad 5500型三重四极杆串联质谱仪, 配备电喷雾电离源(ESI源)和Analyst 1.6.2定量处理软件。
色谱条件 分析柱: XDB C18色谱柱(50 mm × 4.6 mm, 1.8 μm, 美国Agilent公司); 预柱: C18保护柱(4.0 mm × 3.0 mm, 美国Phenomenex公司); 流动相: A相为含0.25%甲酸的0.2 mmol·L-1碳酸锂水溶液, B相为甲醇; 梯度洗脱: 0~0.2 min, 50% B; 0.2~1.2 min, 50%~90% B; 1.2~2.5 min, 90% B; 2.5~2.6 min, 90%~50% B; 2.6~5 min, 50% B。柱温: 40 ℃; 流速为0.7 mL·min-1; 进样量2.0 µL。
质谱条件 离子源为电喷雾电离源(ESI源); 正离子多反应监测模式; 源喷射电压为5 kV; 离子源温度为550 ℃; 离子源气体1 (N2)压力为50 psi; 离子源气体2 (N2)压力为50 psi; 气帘气体(N2)压力为15 psi; 去簇电压均为60 V; 罗汉果醇碰撞能量(CE)为55 eV; 紫杉醇碰撞能量(CE)为32 eV。用于定量分析离子反应对分别为m/z 483.4→447.4 (罗汉果醇)和m/z 860.3→292.2 (紫杉醇)。
标准系列样品、质控样品的制备 精密称取罗汉果醇两份, 一份用于标准系列样品的制备, 一份用于质控样品的制备。分别以甲醇溶解并定容, 获得浓度约为1.00 mg·mL-1左右的储备液。以大鼠空白血浆稀释储备液, 获得标准系列样品和质量控制(QC)样品。罗汉果醇标准系列样品血浆浓度分别为5.00、10.0、25.0、50.0、100、250、500和1 000 ng·mL-1。罗汉果醇QC样品的血浆浓度分别为5.00 ng·mL-1 (定量下限)、15.0 ng·mL-1 (低浓度)、200 ng·mL-1 (中浓度)和800 ng·mL-1 (高浓度)。精密称取紫杉醇一份, 以甲醇溶解并定容, 获得浓度约为1.00 mg·mL-1左右的内标储备液。用甲醇-水(50:50) 稀释, 得到内标工作液(100 ng·mL-1)。
血浆样品预处理 取血浆样品50.0 μL, 置1.5 mL离心管中。分别加入25.0 μL内标工作溶液和150 μL乙腈, 涡流混合1 min, 离心5 min (14 000 r·min-1)。取上清液进行LC-MS/MS分析。
方法学考察
标准曲线和定量下限 罗汉果醇标准系列样品按“血浆样品预处理”项下操作, 以每个待测物浓度为横坐标, 待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标, 用加权(W = 1/x2)最小二乘法进行回归运算, 求得标准曲线。取LLOQ样品(罗汉果醇血浆浓度为5.00 ng·mL-1), 每一天进行6样本分析, 连续测定3天, 并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度, 求得罗汉果醇的定量下限。
精密度与准确度 取低、中、高3个浓度(罗汉果醇血浆浓度分别为15.0、200和800 ng·mL-1)的质控样品, 按“血浆样品预处理”项下操作, 每一浓度进行6样本分析, 连续测定3天。根据当日的标准曲线, 计算QC样品的测得浓度, 根据QC样品结果计算本方法的准确度与精密度。
回收率 取低、中、高3个浓度质控样品按“血浆样品预处理”项下操作, 每一浓度进行6样本分析。同时另取大鼠空白血浆50.0 μL, 除不加内标溶液外, 按“血浆样品预处理”项下操作, 取全部上清液, 加入相应浓度对照质控溶液和内标溶液, 涡流混匀后进样分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比计算处理回收率。
基质效应 取6个大鼠空白血浆及1份溶血空白血浆各50.0 μL, 除不加内标溶液外, 按“血浆样品预处理”项下操作, 取全部上清液, 加入相应浓度对照质控溶液和内标溶液, 涡流混匀后进样分析。同时另取50.0 μL水代替空白血浆, 按上述处理, 每一浓度进行三样本分析, 获得相应的平均峰面积。以两种处理方法的峰面积比值计算基质效应。
稀释实验 取罗汉果醇的稀释质控样品(血浆浓度为8 000 ng·mL-1), 用大鼠空白血浆稀释10倍后, 按“血浆样品预处理”项下操作, 进行6样本分析, 根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。
实验动物及给药方案 6只健康的雄性SD大鼠随机分为两组, 每组3只。静脉组给药剂量为5.00 mg·kg-1, 分别于给药前和给药后0.033、0.083、0.167、0.418、1、2、4、6和10 h采集静脉血150 μL于EDTA抗凝管中。灌胃组给药剂量为100 mg·kg-1, 分别于给药前和给药后0.167、0.418、1、2、4、6、10、12和24 h采集静脉血150 μL于EDTA抗凝管中。全血样品采集后立即于10 000 r·min-1下离心5 min, 分离血浆, -20 ℃保存。采用Phoenix WinNonlin®6.3 (美国Pharsight公司)软件以非房室模型对测得的药代动力学数据进行处理和统计分析。
结果 1 大鼠血浆中代谢产物鉴定 1.1 罗汉果醇对照品质谱分析罗汉果醇主要生成[M+HCOO]-离子(m/z 521.386 2) (图 2A)。高碰撞能量质谱图中(图 2B), 主要碎片离子为m/z 112.982 1、180.972 5、248.959 9和475.269 8 ([M-H]-)等。
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Figure 2 Q-TOF full scan MS spectrum of mogrol (A) and product ion MS spectrum of [M+HCOO]- (B) |
与空白血浆样品相比, 在给药后大鼠血浆中除原形药(M0) [M+HCOO]-离子m/z 521.386 2外, 还检测到m/z分别为519.370 3、535.365 1、537.381 0、551.360 4和553.377 6的代谢产物(图 3)。其中峰面积相对较高的为m/z 537.381 0和m/z 551.360 4, 分别命名为代谢物产物M3和M4, 并以此为例, 介绍代谢产物鉴定过程。
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Figure 3 The metabolite (listed in Table 1) profiles of mogrol in plasma sample collected at 4.0 h after an oral administration of 100 mg·kg-1 mogrol to rats |
在m/z 537.381 0 ([M+HCOO]-)的提取离子流色谱图中, 可以检测到3个色谱峰, 保留时间分别为11.42、12.94和13.05 min, 命名为M3-1~M3-3。根据准确分子质量, 推测它们的分子式组成为C30H52O5, 比原形多了1个O。在高碰撞能量下, M3-1~M3-3均可产生m/z 491.339 1 ([M-H]-)、343.992 6、265.950 1、129.979 2的碎片离子, 其中m/z 491.251 6、265.950 1的碎片离子比原形药物的碎片离子m/z 475.269 8、249.964 5多了15.98 Da。因此, 推测M3为罗汉果醇的羟基化代谢产物, 但仅根据质谱碎片, 尚不能确定代谢位点。
1.3 M4的鉴定在m/z 551.360 4 ([M+HCOO]-)的提取离子流色谱图中, 可以检测到2个色谱峰, 保留时间为10.76和11.44 min, 命名为M4-1和M4-2。根据准确分子质量, 推测它们的分子式组成为C30H50O6, 比原形多了2个O, 少了2个H。在高碰撞能量下, M4-1和M4-2均可产生m/z 505.325 9 ([M-H]-)、462.031 8、347.982 3、343.996 8的碎片离子。其中m/z 505.325 9、347.982 3的碎片离子比M0的碎片离子m/z 475.269 8、317.946 3多了30.05 Da。推测M4为罗汉果醇的脱氢并二羟基化代谢产物。
比较各时间点代谢产物和原形药物的[M+HCOO]-的提取离子色谱图峰面积, 确定大鼠灌胃给药后, 血浆中以原形药物为主。因此, 本文建立LC-MS/MS法测定血浆中罗汉果醇, 并进行药代动力学研究。罗汉果醇代谢产物的准确分子质量、可能元素组成和代谢途经等列于表 1。
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Table 1 Identification of metabolites in rat plasma after a single oral administration of 100 mg·kg-1 mogrol using UHPLC-Q-TOF/MS |
6个不同来源的大鼠空白血浆样品以及相应空白血浆配制的LLOQ样品进行LC-MS/MS分析。与空白对照对比, 空白血浆中的内源性物质不干扰罗汉果醇及内标紫杉醇的测定。典型色谱图见图 4。
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Figure 4 Typical MRM chromatograms of mogrol (Ⅰ), paclitaxel (Ⅱ) in rat plasma. A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with 100 ng·mL-1 paclitaxel; C: Blank plasma spiked with 5.00 ng·mL-1 mogrol and 100 ng·mL-1 paclitaxel; D: A plasma sample collected at 1.0 h after an intravenous administration of 5.00 mg·kg-1 mogrol to rats |
测定大鼠血浆中罗汉果醇线性范围为5.00~1 000 ng·mL-1, 典型标准曲线回归方程为: y = 0.020 4 x -0.006 1 (r = 0.998 7)。
罗汉果醇LLOQ血浆样品的日内精密度为6.5%, 日间精密度为3.4%, 准确度在-5.7%~0.1%之间。结果表明LC-MS/MS法测定大鼠血浆样品中罗汉果醇的定量下限可达5.00 ng·mL-1。
2.3 精密度与准确度准确度和精密度数据见表 2。罗汉果醇每一浓度水平QC样品的日内精密度(RSD)均小于9.3%, 日间精密度(RSD)均小于3.9%, 准确度(RE)在-4.5%~2.9%之间, 符合生物样品测定相关要求[1,12]。
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Table 2 The intra-and inter-day precision and accuracy data of the LLOQ and QC samples of mogrol |
罗汉果醇在低、中、高三种浓度下样品的提取回收率分别为97.1%、92.8%、91.2%。内标紫杉醇同样经提取处理, 其提取回收率为89.6%。
2.5 基质效应罗汉果醇低、高两浓度经内标校正的基质效应分别为90.4%和104%, 相对标准差均小于2.9%。因此, 在本实验选择的色谱和质谱条件下, 可忽略基质效应对罗汉果醇测定的影响。
2.6 稳定性本实验考察了罗汉果醇低、高两浓度分别为15.0和800 ng·mL-1的血浆样品在不同储存条件下的稳定性。结果表明, 大鼠血浆样品室温放置4 h, 准确度在-8.4%~-7.8%之间; 预处理后的血浆样品室温放置24 h, 准确度在-5.0%~-4.9%之间; 血浆样品经历3次冷冻解冻循环, 准确度在-1.3%~-1.2%之间; 血浆样品-20 ℃放置59天, 准确度在-4.5%~-0.9%之间。在上述条件下, 罗汉果醇血浆样品均稳定。
2.7 稀释实验测得罗汉果醇稀释质控样品的精密度和准确度分别为6.5%和4.3%。表明, 血浆样品经空白血浆稀释10倍后测定不影响结果的准确度。
2.2.8 残留考察方法验证期间在标准曲线定量上限浓度测定后, 立即分析空白样品以评价残留。空白样品中待测物罗汉果醇残留率小于定量下限峰面积的0.1%, 内标残留率在2.0%以内, 可忽略残留对待测物测定的影响。
3 大鼠药代动力学和生物利用度研究将经过完整方法学验证的方法应用于罗汉果醇的大鼠药代动力学研究。灌胃组和静脉组给予罗汉果醇后的平均药时曲线见图 5, 相关的药代动力学参数见表 3。
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Figure 5 Plasma concentration-time profiles of mogrol after an oral administration of 100 mg·kg-1 mogrol (A) and intravenous administration of 5.00 mg·kg-1 mogrol (B) to rats (n = 3, x±s) |
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Table 3 Non-compartmental pharmacokinetics parameters of mogrol after a single oral or intravenous administration of mogrol in rat plasma (n = 3, x±s) |
大鼠静脉给予5.00 mg·kg-1罗汉果醇时, 其表观分布容积约为0.93 L·kg-1, 高于总体液体积, 提示其具有中等程度组织分布。大鼠灌胃给予100 mg·kg-1罗汉果醇, 达峰迅速, tmax约1.67 h时, 达峰浓度为363 ng·mL-1, 消除半衰期为2.34 h。以剂量归一化后的罗汉果醇在大鼠体内的绝对生物利用度仅为3.5%。
讨论罗汉果醇分子结构中仅含有醇羟基基团, 在ESI电离源下, 易形成加合离子。在正离子检测模式下, 可形成[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+Li]+等加合离子。原形药物和检测到的代谢物间各加合离子的生成比例不一致, 不易判断原形药物和各代谢物间血浆浓度的相对比例关系。在(-)ESI电离模式下, 罗汉果醇和代谢产物都主要生成[M+HCOO]-前体离子, 有利于判断体内的相对含量。
在(-)ESI电离模式下, 以罗汉果醇的[M+HCOO]-作为前体离子, 进行产物离子扫描分析时, 获得较多的碎片离子, 采用MRM方式进行定量分析, 响应明显降低。在(+)ESI电离模式下, 对前体离子[M+Li]+进行产物离子扫描分析时, 可形成稳定的脱水碎片离子, 以MRM扫描方式进行定量分析, 不影响检测灵敏度。
因此, 本研究采用(-)ESI电离模式鉴定罗汉果醇的代谢产物; 而(+)ESI正离子模式用于血浆样品中罗汉果醇的定量分析。
本文利用UHPLC/(-)ESI Q-TOF MS, 在大鼠血浆中共鉴定出13种代谢产物。初步判断代谢产物类型主要为脱氢和羟基化。罗汉果醇及体内代谢产物在高能量碰撞下主要发生碳-碳键断裂, 碎片离子信息有限, 目前还不确定代谢位点。
LC-MS/MS法定量测定大鼠血浆中罗汉果醇时, 为提高检测灵敏度, 在流动相中添加了少量的Li2CO3, 以形成稳定的[M+Li]+ (m/z483.4) 前体离子, 对其进行产物离子全扫描分析, 主要形成脱两分子水的碎片离子m/z 447.4。选择m/z 483.4→447.4作为MRM监测的离子对, 获得质谱响应高且稳定。
结论本文采用UHPLC/Q-TOF MS鉴定大鼠灌胃罗汉果醇后血浆中代谢产物。结果表明, 罗汉果醇在大鼠血浆中以脱氢和羟基化代谢途径为主, 共鉴定出13种代谢产物。建立了以碳酸锂为流动相添加剂的LC-MS/MS法测定大鼠血浆中罗汉果醇。锂加合离子在质谱分析中稳定性好, 灵敏度高, 最低定量下限可达5.00 ng·mL-1, 满足于罗汉果醇药代动力学研究。
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