2017, Vol. 52
2. 华侨大学分子药物学研究院, 福建 泉州 362021
2. Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China
组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂, 与其他的丝氨酸蛋白酶抑制剂一样, kallistatin不仅仅只在肝脏中表达, 它在肾脏、心脏和血管中都有表达[1-4]。Kallistatin是一种负调控的蛋白, 目前研究发现kallistatin具有抗炎和抗氧化等多种功能[1-3], 在肝病患者血液中kallistatin的表达量急剧减少, 而在脓血症和肺炎患者中, kallistatin的表达量与疾病的严重程度密切相关[5-7]; 在脂多糖诱导肝脏炎症中, 肝脏中kallistatin的表达量急剧下降, 而在转基因小鼠中过表达kallistatin可以降低脂多糖诱导的死亡率[8], 说明kallistatin在体内与炎症有着密切的关系。在肝损伤和肝纤维化的整个过程中都有炎症和氧化应激伴随, 而kallistatin的抗氧化作用在内皮细胞上已得到证实[9, 10], 但在肝星状细胞中kallistatin的抗氧化作用及其机制还未见相关报道。因此, 本文以肝星状细胞为模型研究kallistatin的抗氧化作用及其分子机制, 为kallistatin开发为抗纤维化药物打下理论基础。
肝脏中的氧化应激反应机制比较复杂, 其氧化环境可能由不同氧化物组成[11, 12]。氧化应激是促使肝星状细胞由静息态转向活化态的一个重要因素, 而肝星状细胞由静息态向活化态的转变是肝纤维化的中心环节, 因此在肝纤维化的治疗中抗氧化也成为了一种重要的策略[13-16]。鉴于肝脏中的氧化应激比较复杂, 体外研究多用过氧化氢和铁过载模型模拟肝脏中的氧化应激。过氧化氢主要模拟在肝脏中广泛存在的H2O2活性氧中间体; 铁过载模型模拟肝脏内的脂质过氧化反应。
因此, 本研究采用过氧化氢和铁过载两种作用机制不同的氧化反应模型来模拟肝脏内的氧化环境。选取了两种不同活化状态的肝星状细胞——完全活化的人肝星状细胞系(LX-2) 和未活化的原代大鼠肝星状细胞(rat hepatic stellate cells, rHSC)为研究对象, 较全面揭示kallistatin抗氧化作用及其分子机制, 并探讨将其应用于肝纤维化治疗中的可能性。
材料与方法材料 Nycodenz、胶原酶、花生四烯酸(AA)、肝素钠、硝酸铁[Fe(NO3)3]、次氮基三乙酸(NTA)、MTT试剂和NADPH定量检测试剂盒均购自Sigma-Aldrich公司; 链霉蛋白酶购自Roche公司; 超氧化物阴离子荧光探针(dihydroethidium)购自Invitrogen公司; DMEM、DNaseⅠ及胎牛血清均购自Hyclone公司; Desmin、Akt、phospho-Akt、eNOS、phospho-eNOS、α-SMA、GAPDH等抗体购自Cell Signaling公司; kallistatin抗体购自Abcam公司; Wistar大鼠(SYXK (闽) 2016-0001) 购自福建吴氏实验动物中心; 人肝星状细胞系LX-2为本实验室保存。
星状细胞的分离与培养 rHSC分离参考文献[1]中的方法。台盼蓝检测分离纯化后的细胞活力, 利用Desmin及α-SMA抗体进行免疫细胞化学染色鉴定纯度, 当细胞纯度高于95%, 才可满足实验需求。rHSC培养48 h后换液, 然后每2~3天换液1次, 本文中应用分离后体外培养5天的rHSC进行实验。人肝星状细胞系LX-2培养于含20%胎牛血清的DMEM培养液。
Kallistatin制备 参照本实验室[17, 18]已经建立的方法。
H2O2损伤模型 细胞均以每孔5.0×103个接种于96孔板。培养过夜后, 加入终浓度为300 μmol·L−1 H2O2于37 ℃作用12 h, 在加入H2O2之前或之后30 min, 向培养液中加kallistatin (0.3和0.9 μmol·L−1)或谷胱甘肽(GSH, 0.9 μmol·L−1)进行保护或修复, 最后利用细胞毒性实验(MTT)检验细胞活力。
Fe-NTA/AA损伤模型 Fe-NTA溶液配制:取50 mmol·L−1 Fe(NO3)3溶液10 mL与150 mmol·L−1 NTA溶液10 mL混合, 用2 mol·L−1碳酸氢钠溶液调节pH值至7.4, 定容至40 mL, 配成25 mmol·L−1 Fe-NTA母液。肝星状细胞均以每孔5.0×103个接种于96孔板。培养12 h后, 用DMEM培养液或含有终浓度20 μmol·L−1 AA的DMEM培养液换液, 继续培养12 h后, 吸出培养液并用PBS清洗细胞以去除残留的AA, 然后分别加入含终浓度为500 μmol·L−1 Fe-NTA的DMEM培养液, 制备Fe-NTA/AA氧化损伤模型。在加入Fe-NTA之前或之后30 min, 向培养液中加入kallistatin (0.3和0.9 μmol·L−1), 培养一定时间后进行MTT检测, 计算细胞活力。
MTT 细胞造模完成并加入药物处理完成后, 向每孔细胞中加入5 mg·mL−1 MTT试剂10 μL, 继续培养2 h, 终止培养, 将培养基吸出, 每孔加入200 μL DMSO, 振荡充分溶解结晶, 酶标仪检测溶解物在492 nm处吸光度(OD)值, 以630 nm作参比波长, 以未经处理的细胞作为对照, 计算细胞活力。
细胞内超氧化物检测 细胞相应处理后, 去除培养液, 用PBS缓冲液冲洗2遍, 然后加入10 μmol·L−1超氧化物阴离子荧光探针(dihydroethidium)工作液, 37 ℃孵育60 min, 用PBS缓冲液清洗2遍, 荧光显微镜观察拍照, 利用Image-Pro Plus软件进行荧光强度分析。
Western blotting 细胞处理后, 去除培养基, 用PBS缓冲液冲洗2遍, 然后加入RAPI裂解液500 μL裂解细胞, 12 000 r·min−1离心5 min, 取上清, BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液, 取20 μg样品进行SDS-PAGE电泳, 电转移法将蛋白转印至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭1 h。用相应的兔抗eNOS和Akt等抗体4 ℃孵育过夜, TBST清洗3次, 每次10 min。室温孵育羊抗兔二抗1 h。TBST漂洗3次, 每次10 min。加ECL进行显色, 利用化学发光成像系统进行成像, Image J软件分析图片灰度值。
数据统计 所有数据用均值±标准偏差(x±s)表示, 结果采用SPSS19进行统计学分析, *P < 0.05为有显著性差异, **P < 0.01为有极显著性差异。
结果 1 重组kallistatin对氧化反应引起的肝星状细胞损伤的保护性作用 1.1 H2O2损伤模型利用kallistatin预处理细胞再加入300 μmol·L−1 H2O2作用, H2O2对rHSC和LX-2具有明显的细胞毒性; 而加入GSH (0.9 μmol·L−1)、kallistatin (0.3和0.9 μmol·L−1)预处理组, 细胞活力明显比模型组要高, 说明kallistatin能在一定程度保护细胞免受H2O2氧化损伤, 其中0.9 μmol·L−1 kallistatin起到的保护作用最明显(P < 0.01), 能完全抵消300 μmol·L−1 H2O2对rHSC和LX-2细胞的损伤作用(图 1A, B)。
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Figure 1 Protection effects of kallistatin (Kal) towards the injury induced by H2O2. A: rHSC; B: LX-2. H2O2: 300 μmol·L−1; GSH: 0.9 μmol·L−1; Kal-L: 0.3 μmol·L−1; Kal-H: 0.9 μmol·L−1. n = 6, x±s. **P < 0.01 |
有文献报道, 氧化应激能激活HSC并引起HSC过度增殖[19, 20]。本实验研究发现, 加入0.9 μmol·L−1 kallistatin预处理能够抑制50 μmol·L−1 Fe-NTA引起的rHSC增殖, 但3天后kallistatin对rHSC的增殖抑制作用消失, 这可能由于体外培养3天, rHSC已经完成了活化(图 2A)。当500 μmol·L−1 Fe-NTA与20 μmol·L−1 AA合用时, kallistatin预处理同样能够减小由Fe-NTA与AA引起的氧化损伤(图 2B)。对于LX-2细胞, 500 μmol·L−1 Fe-NTA与20 μmol·L−1 AA合用, 细胞活力明显比单用500 μmol·L−1 Fe-NTA细胞活力要小, 二者相比具有显著性差异, 说明Fe-NTA与AA具有协同增效的作用; 加入0.9 μmol·L−1 kallistatin预处理能显著地提高细胞活力, 与模型组相比具有显著性差异(图 2C)。
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Figure 2 Protection effects of kallistatin protein towards the injury induced by Fe-NTA/AA. Kallistatin was added into medium before the oxidation model built. A: rHSC cell, Kal: 0.9 μmol·L−1, Fe-NAT: 50 μmol·L−1. B: rHSC cell, Kal: 0.9 μmol·L−1, Fe-NAT: 500 μmol·L−1; AA: 20 μmol·L−1. C: LX-2 cell, Kal: 0.9 μmol·L−1, Fe-NAT: 500 μmol·L−1, AA: 20 μmol·L−1. n = 6, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 |
H2O2 (300 μmol·L−1)作用30 min, 再加入kallistatin处理, 48 h后进行MTT检测, 结果如图 3所示。H2O2对LX-2细胞表现出明显的毒性, 细胞活力约50%, 加入0.9 μmol·L−1 GSH组细胞活力与H2O2模型组相比没有显著性差异(图 3A, P > 0.05); 0.3 μmol·L−1 kallistatin组细胞活力与H2O2模型组相比具有显著性差异(P < 0.05), 而0.9 μmol·L−1 kallistatin组与H2O2模型组相比具有极显著性差异(P < 0.01) (图 3A)。说明GSH抗氧化剂对H2O2造成的细胞损伤没有治疗作用, 但kallistatin对H2O2造成的细胞损伤有一定的治疗作用, 这可能与抗氧化机制有关。Fe-NTA作用30 min后加入0.9 μmol·L−1 kallistatin处理的LX-2细胞活力与单用500 μmol·L−1 Fe-NTA处理组的细胞活力相比具有显著性差异(图 3B, P < 0.05), 且能显著降低500 μmol·L−1 Fe-NTA与20 μmol·L−1 AA合用对LX-2造成的毒性作用(图 3B, P < 0.01)。
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Figure 3 Therapeutic effects of kallistatin on LX-2 cells towards the injury induced by oxidation. Kallistatin was added into medium after the oxidation model built. A: H2O2 treated. H2O2: 300 μmol·L−1, GSH: 0.9 μmol·L−1, Kal-L: 0.3 μmol·L−1, Kal-H: 0.9 μmol·L−1. B: Fe-NTA/AA treated. Fe-NTA: 500 μmol·L−1, AA: 20 μmol·L−1, Kal: 0.9 μmol·L−1. n = 6, x±s. *P < 0.05, **P < 0.01 |
加入300 μmol·L−1 H2O2作用会引起rHSC及LX-2细胞内超氧化物显著增多(图 4A, B), 加入kallistatin预处理则细胞内超氧化物含量明显降低, 0.9 μmol·L−1 kallistatin组荧光强度与对照组相近, 二者没有显著性差异(图 4C, D), 而0.3 μmol·L−1 kallistatin组荧光强度明显要比0.9 μmol·L−1 kallistatin组要强(图 4C, D), 说明kallistatin预处理可显著减少由H2O2引起的肝星状细胞内超氧化物增多, 且呈现剂量关系。
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Figure 4 Effect of kallistatin on intracellular superoxide levels after H2O2 exposure in rHSC (A) and LX-2 (B). Kallistatin was added into medium before the oxidation model built. The red fluorescence represented the reactive oxygen species (ROS) in the cells. 1−4: Control, 300 μmol·L−1 H2O2 group, 0.3 and 0.9 μmol·L−1 Kal group, respectively. Intensity arbitrary units (A.U.) reflecting the relative value of intracellular ROS levels in rHSC (C) and LX-2 (D). n = 3, x±s. **P < 0.01 |
加入500 μmol·L−1 Fe-NTA作用后也会引起rHSC及LX-2细胞内超氧化物显著增多(图 5A, B), 而加入kallistatin预处理, 两种细胞内超氧化物含量都明显降低(图 5C, D), 说明kallistatin预处理可显著减少由Fe-NTA引起的细胞内超氧化物的增加。
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Figure 5 Effect of kallistatin on intracellular superoxide levels after Fe-NTA exposure in rHSC (A) and LX-2 (B). Kallistatin was added into medium before the oxidation model built. The red fluorescence represented the ROS in the cells. 1−4: Control, 500 μmol·L−1 Fe-NTA group, 0.3 and 0.9 μmol·L−1 Kal group, respectively. Intensity arbitrary units (A.U.) reflecting the relative value of intracellular ROS levels in rHSC (C) and LX-2 (D). n = 3, x±s. **P < 0.01 |
利用PI3K抑制剂LY294002和eNOS抑制剂L-NAME, 研究kallistatin避免细胞受氧化损伤的相关分子机制。实验结果显示, 抑制剂LY294002阻断PI3K-Akt信号通路后, LX-2细胞活力与kallistatin组相比具有显著性差异(图 6A); Western blotting结果显示, 当kallistatin作用1 h时后, 磷酸化Akt (P-Akt)表达量上调; 当LY294002阻断Akt信号通路, 则kallistatin诱导Akt和eNOS的磷酸化作用也被抑制(图 6B, C), 且kallistatin清除ROS和抑制NADPH酶活能力也明显受阻(图 6D~F)。eNOS在细胞中可以合成NO发挥抗氧化作用, 当加入eNOS抑制剂L-NAME后, 细胞中的ROS、NADPH含量显著增加, 同时kallistatin诱导eNOS磷酸化, 清除ROS和NADPH的能力明显下降(图 6D~F)。以上结果说明, Akt-eNOS信号通路介导了kallistatin抗氧化作用。
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Figure 6 Kallistatin protects against oxidation by stimulating Akt and eNOS phosphorylation. Cells were treated with kallistatin (0.9 μmol·L−1) in the presence or absence of LY294002 (1 μmol·L−1) and L-NAME (500 μmol·L−1) for 30 min. Then the cells were exposed to hydrogen peroxide for 12 h. A: Kallistatin protects cells from oxidative damage by MTT analysis. B: Kallistatin stimulates Akt phosphorylation in LX-2 cells as determined by Western blotting analysis. C: Kallistatin stimulates eNOS phosphorylation in LX-2 cells as determined by Western blotting analysis. D: Kallistatin inhibits H2O2-induced ROS formation in LX-2 cells, as indicated by representative images of ROS-induced dichlorofluorescin (DCF) fluorescence. E: Intensity arbitrary units (A.U.) reflecting the relative value of intracellular ROS levels. F: Kallistatin inhibits H2O2-induced NADPH oxidase activity. n = 3, x±s. **P < 0.01 |
本文选取H2O2和铁过载这两种肝脏中典型的氧化应激模型, 研究kallistatin在肝纤维化氧化应激中发挥的作用。结果表明, kallistatin对肝星状细胞系LX-2和原代鼠肝星状细胞HSC都能发挥很好的保护作用, 对这两种氧化损伤模型都具有良好的治疗作用。预示kallistatin能从抗氧化的方面减慢甚至抑制肝纤维化发展。
活性氧和超氧阴离子等在体内产生的自由基通过脂质氧化作用而损伤、破坏肝细胞, 产生脂质过氧化物MDA等, 可直接激活HSC, 介导HSC的分化、增殖和胶原的合成。在损伤修复模型中, kallistatin都能显著提高细胞活力, 清除HSC细胞内形成的ROS, 而GSH却不能起到损伤修复的作用, 这可能由于kallistatin是一种细胞内的分泌蛋白, 细胞膜表面有kallistatin的受体, 受体可以介导其抗氧化作用, 而GSH只有γ-谷氨酰基转肽酶水解成半胱氨酸才能进入细胞。Shen等[10]研究发现, kallistatin可以通过内皮细胞膜表面的kruppel-like-factor 4, 上调内皮细胞内eNOS表达, 清除由TNF-α诱导氧化反应。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3k/Akt)通路是细胞内重要的抗氧化通路。Shen等[9]的研究也发现, kallistatin能够激活内皮细胞的Akt, 增加NO的生成, 削弱TNF-α等氧化因子对血管产生病变等途径维持内皮细胞正常的功能。本文研究发现, 在LX-2细胞中kallistatin激活Akt和eNOS等分子, 降低细胞内的NADPH和ROS等含量发挥抗氧化作用。这些结果都提示, kallistatin的抗氧化作用可以运用到治疗肝纤维化过程中。
本文研究证实, kallistatin既可以保护肝星状细胞避免H2O2的损伤, 还可修复由于氧化造成的细胞损伤。其主要机制, kallistatin能抑制细胞内ROS的形成, 降低细胞内NADPH的含量; 另外, kallistatin还能激活Akt-eNOS信号通路发挥抗氧化作用。本文为全面阐释kallistatin的抗氧化作用与机制, 以及筛选抗肝纤维化新药物的靶点开发提供一些理论依据。
| [1] | Huang X, Wang X, Lv Y, et al. Protection effect of kallistatin on carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats via antioxidative stress[J]. PLoS One, 2014, 9: 88498. DOI:10.1371/journal.pone.0088498 |
| [2] | Shen B, Hagiwara M, Yao YY, et al. Salutary effect of kallistatin in salt-induced renal injury, inflammation, and fibrosis via antioxidative stress[J]. Hypertension, 2008, 51: 1358–1365. DOI:10.1161/HYPERTENSIONAHA.107.108514 |
| [3] | Wang GQ, Wang X, Huang XP, et al. Inhibition of integrin β3, a binding partner of kallistatin, leads to reduced viability, invasion and proliferation in NCI-H446 cells[J]. Cancer Cell Int, 2016, 16: 90. DOI:10.1186/s12935-016-0365-7 |
| [4] | Zhang JJ, Bledsoe G, Kato K, et al. Tissue kallikrein attenuates salt-induced renal fibrosis by inhibition of oxidative stress[J]. Kidney Int, 2004, 66: 722–732. DOI:10.1111/j.1523-1755.2004.00794.x |
| [5] | Chao J, Schmaier A, Chen LM, et al. Kallistatin, a novel human tissue kallikrein inhibitor:levels in body fluids, blood cells, and tissues in health and disease[J]. J Lab Clin Med, 1996, 127: 612–620. DOI:10.1016/S0022-2143(96)90152-3 |
| [6] | Lin WC, Lu SL, Lin CF, et al. Plasma kallistatin levels in patients with severe community-acquired pneumonia[J]. Crit Care, 2013, 17: R27. DOI:10.1186/cc12507 |
| [7] | Cheng Z, Lv Y, Pang S, et al. Kallistatin, a new and reliable biomarker for the diagnosis of liver cirrhosis[J]. Acta Pharm Sin B, 2015, 5: 194–200. DOI:10.1016/j.apsb.2015.02.003 |
| [8] | Lin WC, Chen CW, Huang YW, et al. Kallistatin protects against sepsis-related acute lung injury via inhibiting inflammation and apoptosis[J]. Sci Rep, 2015, 5: 12463. DOI:10.1038/srep12463 |
| [9] | Shen B, Gao L, Hsu YT, et al. Kallistatin attenuates endothelial apoptosis through inhibition of oxidative stress and activation of Akt-eNOS signaling[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 299: H1419–H1427. DOI:10.1152/ajpheart.00591.2010 |
| [10] | Shen B, Smith Jr RS, Hsu YT, et al. Kruppel-like factor 4 is a novel mediator of Kallistatin in inhibiting endothelial inflammation via increased endothelial nitric-oxide synthase expression[J]. J Biol Chem, 2009, 284: 35471–35478. DOI:10.1074/jbc.M109.046813 |
| [11] | Parola M, Robino G. Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis[J]. J Hepatol, 2001, 35: 297–306. DOI:10.1016/S0168-8278(01)00142-8 |
| [12] | Poli G. Pathogenesis of liver fibrosis:role of oxidative stress[J]. Mol Aspects Med, 2000, 21: 49–98. DOI:10.1016/S0098-2997(00)00004-2 |
| [13] | Aravinthan A, Pietrosi G, Hoare M, et al. Hepatocyte expression of the senescence marker p21 is linked to fibrosis and an adverse liver-related outcome in alcohol-related liver disease[J]. PLoS One, 2013, 8: e72904. DOI:10.1371/journal.pone.0072904 |
| [14] | Hsu YC, Chiu YT, Cheng CC, et al. Antifibrotic effects of tetrandrine on hepatic stellate cells and rats with liver fibrosis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2007, 22: 99–111. DOI:10.1111/jgh.2007.22.issue-1 |
| [15] | Panebianco C, Oben JA, Vinciguerra M, et al. Senescence in hepatic stellate cells as a mechanism of liver fibrosis reversal:a putative synergy between retinoic acid and PPAR-gamma signalings[J]. Clin Exp Med, 2016. DOI:10.1007/s10238-016-0438-x |
| [16] | Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Hepatic stellate cells and liver fibrosis[J]. Compr Physiol, 2013, 3: 1473–1492. |
| [17] | Huang X, Wang X, Dong H, et al. High level expression of recombinant human kallistatin in Pichia pastoris and its bioactivity[J]. Chin J Biotechnol (生物工程学报), 2010, 26: 249–255. |
| [18] | Zhang Q, Xing YM, Liu J, et al. Expression of recombinant human kallistatin in Pichia pastoris by high density cell culture, and its purification and characterization[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48: 1107–1112. |
| [19] | Galli A, Svegliati-Baroni G, Ceni E, et al. Oxidative stress stimulates proliferation and invasiveness of hepatic stellate cells via a MMP2-mediated mechanism[J]. Hepatology, 2005, 41: 1074–1084. DOI:10.1002/(ISSN)1527-3350 |
| [20] | Svegliati-Baroni G, Saccomanno S, van Goor H, et al. Involvement of reactive oxygen species and nitric oxide radicals in activation and proliferation of rat hepatic stellate cells[J]. Liver, 2001, 21: 1–12. DOI:10.1034/j.1600-0676.2001.210101.x |