1 流感病毒和靶标

人流感主要由A、B两型流感病毒感染发生, A型病毒又可根据包膜上的两种糖蛋白的抗原特性分成亚型, 这两种糖蛋白称作血凝素和神经氨酸酶, 血凝素有16种(H1~H16), 神经氨酸酶有9种(N1~N9), 近年发生的流感大流行是由H5N1和H1N1感染。流感病毒极容易变异。

1.1 血凝素和神经氨酸酶

血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(neuroaminidase, NA, 又称唾液酸酶sialidase)是两种酶, 它们识别并结合的底物是N-乙酰神经氨酸(1, N-acetylneuraminic acid, 又称唾液酸, sialic acid)片段, 后者是人上呼吸道上皮细胞膜上的糖缀合物的末端糖结构, 血凝素结合了唾液酸片段, 将病毒带到细胞膜上, 经病毒包膜与细胞膜融合使病毒进入细胞内(内化)。病毒神经氨酸酶的作用是切掉唾液酸与糖缀合物连接的糖苷键, 将子代的病毒颗粒释放到上皮细胞中, 完成了播散周期。抑制神经氨酸酶以阻止糖苷的裂解, 导致病毒颗粒持续结合于血凝素上, 可阻断病毒的传染。血凝素和神经氨酸酶都是抗流感病毒的靶标, 当今研究较多的是神经氨酸酶。

1.2 神经氨酸酶的结构和催化机制

神经氨酸酶是种糖蛋白, 为4个亚基构成的四聚体, 经疏水性的N-端键合于病毒包膜上。其晶体结构于1983年经X-射线衍射解析(Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuroaminidase. Nature, 1983, 303: 41-44; Varghese JN, McKimm-Breschkin J, Caldwell JB, et al. The structure of the complex between influenza virus neuraminidase and sialic acid, the viral receptor. Proteins, 1992, 14: 327-332)。唾液酸定位于神经氨酸酶的催化中心, 其结合方式是2位羧基与三个精氨酸簇形成静电结合; 5位的乙酰氨基形成两个氢键: NH与水分子结合, C=O与Arg152结合, 甲基结合于Trp178与Ile222构成的疏水腔内; 6位链上的羟基与Glu276的羧基形成二齿氢键, 如图 1所示。

2 计算机辅助解析活性中心的结合特征 2.1 神经氨酸酶的水解机制

Itzstein等基于神经氨酸酶(apo protein)和酶与唾液酸复合物(complex)的晶体结构, 并通过分子模拟研究, 确定了底物与神经氨酸酶结合特征和基团的能量贡献, 提出了如图 2所示的酶水解唾液酸苷的反应历程。认为底物在游离状态下吡喃糖环呈椅式构象存在, 2位羧基处于直立键, 苷键采取平展位置(2a)。在酶活性中心的氨基酸残基作用下, 带正电荷的Arg371 (以及Arg 118和Arg292) 与带负电荷的2位羧基发生盐键结合, Arg151和Arg152通过与水分子氢键结合, 形成了与苷键的结合网络。这样, 使糖环由椅式变形成船式, 羧基呈假平展键取向, 苷键成为直立键, 并在环中O¹原子未偶电子的助力下, 发生成键电荷的重新分布(2b), 形成了苷元即将离去的过渡态, 此时生成的C2正电荷被O¹的未偶电子稳定化(p-π共轭), 吡喃环成为半椅式的氧鎓离子, 鎓离子同时被酶的Glu277的负电荷稳定(2c)。水分子形成的OH^-向sp²杂化的C2进攻, 恢复了C2的sp³杂化态(2d), 吡喃糖环经过渡态(2e)向产物转变, 从酶的活性中心释放唾液酸, 羧基处于直立键位置(2f), 是由于OH^-以SN₁机制进攻C2所致, NMR也证明初产物是α异构体, 并逐渐经变旋作用使羧基处于更稳定的平展构型的β体(2g) (Taylor NR, von Itzstein M. Molecular modeling studies on ligand binding to sialidase from influenza virus and the mechanism of catalysis. J Med Chem, 1994, 37: 616-624)。

该反应机制得到了实验的证明, Burmeister等通过晶体学研究发现流感B病毒的神经氨酸酶催化水解唾液酸苷, 得到了Δ²唾液酸(2, Neu5Ac2en), 2的结构与图 2e的过渡态非常相似, 而且还证明2是神经氨酸酶的抑制剂, 这为设计过渡态类似物提供了有力的根据(Burmeister WP, Henrissat B, Bosso C, et al. Influenza B virus neuraminidase can synthesise its own inhibitor. Structure, 1993, 1: 19-26)。

2.2 确定活性中心的结合腔

前面提出的水解机制和所涉及的功能残基, 以及过渡态的分子构象变化, 为设计过渡态类似物提供了依据, 接下来需要了解活性中心与底物(或抑制剂)分子的结合模式。为此, 应用了分子模拟的研究方法, 用GRID软件计算并定义活性中心的氨基酸残基与底物的相互作用。为此, 以COO^-、NH3⁺、OH和CH₃等4个探针基团扫描活性中心的范德华表面, 分别确定负电荷、正电荷、极性基团和疏水相互作用范围。

2.2.1 羧酸根探针

带有负电荷的羧酸根扫描确定出一个相互作用区域, 相当于唾液酸的羧基在活性中心所处的位置, 映射出Arg118、Arg292和Arg371构成的三角区(尤其是Arg371) 的重要性, 也提示抑制剂的设计应有羧基或提供负电荷的基团。

2.2.2 铵离子特征

由于神经氨酸酶在pH 5.5呈现最适活性, 碱性的胺类在pH 5.5环境下被质子化, 带有正电荷, 因而用NH₃⁺作为探针, 计算分子表面的能量状态。结果表明有3个区域呈现相互作用:在唾液酸的4-OH附近; 糖环C4的下面; 甘油侧链和5位N-乙酰基之间的区域。

2.2.3 羟基探针

羟基探针显示的相互作用与上述的羧酸根的位置重合, 因而未能提供新的相互作用信息。

2.2.4 甲基探针

甲基探针发现的疏水性相互作用区域是乙酰胺基侧链上的甲基位置, 对应于Trp178构成的疏水腔。

这些探针勾画的区域, 映射出酶活性部位发生结合作用的环境, 为抑制剂的设计提供了信息和结构背景。

3 设计抑制剂 3.1 模拟过渡态结构

根据神经氨酸酶与唾液酸复合物的晶体结构、分子模拟预示活性中心的结合特征, 以及推测的水解反应机制, 抑制剂的设计首先合成了化合物2, 它是唾液酸1的Δ^{2, 3}类似物, 环上的其他取代基未做改变。由于C2和C3为sp²杂化态, 与氧原子的未偶电子对形成p-π共轭, 导致吡喃环变形, 类似于过渡态的氧鎓离子态的平面构象。

化合物2对流感A病毒神经氨酸酶有较弱抑制活性, K_i = 4 μmol·L^-1, 分子模拟的结构与实验得到的晶体数据相近。实验还证明将酶活性中心的Arg152突变为Lys, Glu277突变为Asp, 化合物2对发生突变的酶失去抑制活性, 推测是由于Lys和Asp残基链变短, 达不到参与结合位置, 从而佐证了Arg152和Glu277参与同2的结合。

3.2 C4位置的重要性

前已述及, 用NH₃⁺探针研究揭示了在C4附近有与正电荷相互作用的负电区, 推测若将C4的羟基置换成氨基, 可能提高与酶的亲和力, 因而合成了化合物3, 活性评价表明3显著提高了活性, K_i = 40 nmol·L^-1, 是化合物2的100倍。

分子模拟研究了3与神经氨酸酶结合状态(图 3), 表明4位氨基被质子化, 带有正电荷, 可与Asp151和Glu119的羧基发生氢键结合, 距离分别为2.74 Å和2.96 Å (表明结合能很强)。此外, 水分子6X也与氨基发生氢键结合, 距离为2.77 Å。吡喃环上其他取代基的结合模式与1和2相同。

3.3 4-胍基取代—扎那米韦的上市

为了适配于GRID程序计算所揭示的C4有较大范围的正电荷结合区域, 将化合物3的4-氨基换成碱性更强、分布范围更大的胍基, 合成了化合物4, 对神经氨酸酶的活性比化合物3提高了40倍, K_i = 1 nmol·L^-1, 提示基于酶和与底物结合的结构特征, 以及分子模拟获得的信息指导设计的有效性。由于碱性胍基(带有正电荷)结合的范围扩大, 可以同Glu119、Glu227、Asp151和Tyr277等多个氨基酸残基发生氢键和静电结合, 尤其重要的是胍基(正电荷)与Glu227的羧基(负电荷)发生电荷-电荷相互作用。此外, 还与水分子14X发生氢键结合。图 4是化合物4与神经氨酸酶分子对接所形成的氢键示意图。

化合物2~4的结构差异在于C4连接的基团不同, 比较3个化合物的C4基团与活性中心相关的氨基残基的结合的热力学性质, 计算出化合物4由于胍基的结合最强, 焓变最大, 化合物3的氨基结合次之, 焓变居中, 2的焓变最小, 3个化合物的焓变值与抑酶的活性值呈线性相关。表 1列出了化合物2~4的C4连接基与神经氨酸酶相关残基结合的焓变。

化合物4体外对流感A和B病毒感染的细胞有显著抑制活性, 而对哺乳动物的神经氨酸酶不呈现抑制作用, 说明4具有选择性作用。因而确定为候选化合物, 定名扎那米韦(zanamivir)进入临床研究。由于口服生物利用度低, 给药途径是经鼻吸入, 这样气管和肺的吸收可达到15%。由于疗效的不确定性, FDA直到1999年才批准上市。然而, 这个由澳大利亚Monash大学和Biota公司研制、经葛兰素公司开发上市的首创性抗流感药物, 上市后并没有获得广泛的应用和认可, 数月后另一个上市的口服药物—神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦(oseltamivir), 安全与有效性都优胜于扎那米韦。

4 后继的奥塞米韦

在扎那米韦上市数月后, Gilead公司研制、罗氏公司开发的奥塞米韦经FDA批准上市, 后者虽不是首创, 但也是独立研发的。奥塞米韦可口服吸收、生物利用度高、代谢稳定等品质, 完胜于扎那米韦, 后来居上。

4.1 同一个起点

奥塞米韦项目的启动, 也是基于神经氨酸酶的三维结构, 特别是从酶与唾液酸(1)和与Δ²唾液酸(2)的复合物三维结构出发, 实施了基于结构的药物设计(SBDD)。Gilead的研发目标是口服用药, 便于预防和治疗。

研究的切入点是确定母核, 用环己烯替换Δ²唾液酸(2)的二氢吡喃环, 环己烯的构象类似于过渡态的吡喃鎓离子的部分平面结构, 也与Δ²唾液酸的二氢吡喃构象相似。环己烯的优点在于:一是环的稳定性提高, 二是碳环上连接基团或侧链可以多样性和变换灵活性。

4.2 双键在环中的位置

多取代环己烯的双键位置会影响活性强度, 因而具有特定性, 设计的位置对于模拟过渡态(5)是非常重要的。起初设计了双键在两个位置, 即类型6和7。6的双键位置类似于过渡态5, 7的双键位置类似于化合物2、3和4, 所以难于确定哪个双键位置最为适宜。为此合成了化合物8和9。

用流感神经氨酸酶评价8和9的活性, 8的活性IC₅₀ = 6.3 μmol·L^-1, 而9在200 μmol·L^-1浓度下未呈现活性, 确定了环己烯的双键位置为Δ^{1, 2}。

4.3 亲脂性侧链替换极性的甘油侧链

分析化合物2与酶的晶体结构, 发现与C7相连的羟基并没有同酶发生结合作用, 因而可以去除这“限制的”7位羟基, C8和C9的羟基虽然同Glu276形成二齿型氢键结合, 但C8的CH与Arg224的亚烷基还发生疏水相互作用。这些分析促成了设计亲脂链的设计。化合物2或其类似物含有过多的极性基团, 这对于穿越细胞膜的吸收是不利因素, 所以将甘油侧链变为烷基链, 对于平衡分子的亲水-亲脂性应是有利的。此外, 唾液酸形成过渡态的氧鎓离子是缺电子状态, 在环己烯的3位(相当于吡喃环的6位)连接电负性强的氧原子以接近过渡态的缺电子性, 因而设计了C3以氧相连的烷基, 在化学合成上也容易实现。

4.4 环上的其他基团不变

环己烯的其他位置如1位的羧基、4位的乙酰氨基、5位的氨基等基团与化合物3的配置相同, 设计依据与前述的是一样的。

4.5 C3-烷氧基的构效关系

为了考察3-烷氧链的大小(长短)、形状(支化)和方向(构型)对活性的影响, 合成了化合物10~18, 活性评价的指标是对H1N1病毒的神经氨酸酶和病毒感染细胞生长的抑制活性, 分别用IC₅₀和EC₅₀表示。表 2列出了化合物的结构和活性。构效关系分析如下: ① R由H到正丙基(10~13)的抑制酶活性随碳原子增多而递增, 但延长成丁基(14)或异丁基(15)活性未见提高。② 甲基若连接在丙基的α位置(2-甲基丙基), 活性明显增加, 提高大约20倍。α位的支化映射了该部位有个疏水腔, 适配于α甲基的结合。α碳原子虽为手性碳, 但R (16)或S (17)构型的活性没有差异。③ α碳连接为乙基即支化呈对称的戊基(18)活性再提高10倍, 对感染的细胞也有高抑制活性。④ 继续增长碳链为庚氧基(19), 则活性降低, 提示该疏水腔不能容纳更大的亲脂性基团。⑤ 将化合物18的5-氨基变换为5-胍基, 仍保持高活性。比较化合物18与3和4 (扎那米韦)的活性, 提示18的活性显著高于化合物3, 与4 (扎那米韦)的活性相同(Kim CU, Lew W, Williams WA, et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. J Am Chem Soc, 1997, 119: 681-690)。

4.6 候选物的确定和奥塞米韦的上市

化合物18对A和B型流感神经氨酸酶具有高抑制活性, 而对哺乳动物的神经氨酸酶不显示抑制作用, 该选择性作用预示对人体的不良反应较少, 结合其他性质被确定为候选化合物。由于分子中含有羧基和脂肪氨基, 在生理条件下可形成内盐, 不利于细胞摄入和吸收。将18的羧酸乙酯化, 得到前药化合物20, 20本身没有活性(因为游离羧基对酶的结合至关重要), 却有利于吸收, 吸收后经肝脏酯酶水解, 释放出18而起效。化合物20命名为奥塞米韦(oseltamivir), 制成磷酸盐有利于溶解和吸收。

奥塞米韦的口服生物利用度F = 80%以上, 酯的血浆半衰期t_1/2 = 1~3 h, 水解后释出的活性药物(游离酸18)的t_1/2 = 6~10 h, 以18形式自尿中排出。奥塞米韦由罗氏公司开发, 经临床研究而确定了疗效, 与1999年经FDA批准上市, 成为预防和治疗流感的第一个口服药物(Davies BE. Pharmacokinetics of oseltamivir: an oral antiviral for the treatment and prophylaxis of influenza in diverse populations. J Antimicrob Chemother, 2010, 65: Suppl 2: ii5-10)。

4.7 奥塞米韦与神经氨酸酶的结合模式

化合物18与神经氨酸酶复合物的晶体结构表明与预期的结合模式相同。如图 5所示, C1相连的羧基与3个精氨酸(Arg292、Arg371、Arg118) 的胍基形成强力结合。C5的氨基与Glu119和Asp151发生电荷-电荷样的氢键结合。C4上的乙酰氨基的甲基占据了由Trp178和Ile222构成的疏水腔, 酰基的氧原子与Arg152发生氢键结合。这些与前述的Δ²唾液酸(2)结合模式没有显著差别。不同的是C3侧链的结合模式。C3相连的3-戊氧基进入由Glu276、Ala246、Arg224和Ile222组成的疏水腔内, 这与扎那米韦的甘油片段的末端两个羟基与Glu276的羧基形成二齿样氢键结合不同。Glu276为了适配于疏水-疏水相互作用, 羧基的取向是向腔外, 亲脂性骨架参与了疏水结合。构效关系研究揭示的C3位烷基大小和形状对活性的影响, 佐证了3-戊基与疏水腔结合的熵效应达到最大值。