2. 南京中医药大学, 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心, 江苏 南京 210023;
3. 南京中医药大学, 江苏省植物药深加工工程研究中心, 江苏 南京 210029
2. Jiangsu Collaboration Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China;
3. Jiangsu Botanical Medicine Refinement Engineering Research Center, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China
“整体观”和“辨证论治”是中医药两大特色理论体系, 在治疗一些复杂及慢性疾病方面显示出独特的优势[1]。随着系统生物学、多向药理学和生物信息学等学科的快速发展, 网络药理学作为一种药物研究的新模式应运而生, 其整体性和系统性的特点与中医药“整体观”、“辨证论治”的理论体系相一致[2], 可在一定程度上诠释中药复方的多成分、多靶点和多途径的作用特点, 为中药复方的作用机制揭示和创新药物研究提供了有力的研究手段。
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一种严重威胁老年人生命健康的中枢神经系统退行性疾病[3]。现代药理研究表明, AD的常见病理特征有β-淀粉样蛋白斑块(β-amyloid plaques, Aβ斑块)、过度磷酸化Tau蛋白形成神经纤维缠结、乙酰胆碱递质减少、炎症反应、神经元丢失及淀粉样血管病等[4]。中医理论认为, “毒损脑络”在该病的发生过程中起着重要作用[5]; 清热解毒可作为老年痴呆新的治疗原则[6]。而黄连解毒汤作为清热解毒方中的经典方剂, 近年来在AD治疗方面展现出良好的应用前景[7]。本文以黄连解毒汤中具有抗AD作用的药效成分为研究对象, 应用网络药理学的研究方法, 建立“药效成分-靶标-通路”之间的关系, 探究该方治疗AD的多成分、多靶点和多途径作用机制, 为创新药物研究奠定基础。
材料与方法 实验材料ChemDraw Ultra 7.0, ChemBio3D Ultra 12.0, PharmMapper数据库(http://59.78.95.61/pharmmapper/); UniProt数据库(http://www.Uniprot.org/); 生物分子功能注释系统(Molecule Annotation System, MAS 3.0) 数据库(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/); Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路数据库(http://www.Genome.jp/kegg/); Cytoscape 3.4.0软件。
黄连解毒汤中抗AD作用的药效成分筛选黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏和栀子(3:2:2:3) 组成。参照乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)抑制剂筛选模型, 应用Ellman比色法[8]从黄连解毒汤中筛选具有抑制AChE的活性成分, 同时查阅文献, 统计黄连解毒汤中具有抗AD的药效成分。
黄连解毒汤中抗AD作用的药效成分潜在靶点预测首先, 利用ChemDraw Ultra 7.0软件绘制黄连解毒汤中具有抗AD作用的药效成分的分子结构式(图 1), 保存为MOL2 (.mol2) 文件。再将文件导入ChemBio3D中转换为SDF (.sdf)格式保存, 然后将*.sdf格式的各个活性成分文件分别导入PharmMapper数据库中的Submit Job进行靶点预测, 依次选择参数: Generate Conformers-Yes; Maximum Generated Conformations-100; Select Targets Set-Human Protein Targets Only (2 241); Number of Reserved Matched Targets (Max 1 000)-100。得到与该化合物相关的蛋白质数据库编码(PDB ID)、靶点名称(target name)、频数(number of feature)和匹配值(fit score)等结果。根据匹配值, 筛选前10个靶点作为与该化合物相关的重要靶点蛋白。由于得到的靶点蛋白存在命名不规范的情况。因此, 运用UniProt数据库中的UniProtKB统一靶点编码为“P08473、Q08499和O15530”格式, 方便统计和分析。
将获得的活性成分相关靶点导入MAS 3.0数据库中进行通路分析, 得到“pathwayIndexByPathway_kegg”结果, 挑选P < 0.01的通路作为可靠通路, 并进一步采用KEGG数据库对这些通路进行注释。
构建黄连解毒汤中抗AD作用的“药效成分-靶标-通路”网络关系图将17个药效成分的预测靶点结果和通路分析, 在Excel表中分别构建“药效成分-靶点”、“靶点-通路”之间的相互关系, 然后将其导入Cytoscape软件中建立“药效成分-靶标-通路”网络关系图[9]。图中以药效成分、靶点蛋白和通路为3类节点(node), 它们之间有相互关系的分别用边(edge)相连, 通过构建药效成分-蛋白-通路、药效成分-蛋白-药效成分、蛋白-药效成分-蛋白、通路-蛋白-通路和蛋白-通路-蛋白等5种连接, 建立完整的网络图。
结果 1 黄连解毒汤中抗AD作用的药效成分筛选黄连解毒汤中小檗碱、药根碱、巴马汀、表小檗碱、非洲防己碱和黄连碱具有明显抑制AChE作用(图 2), 半数抑制率分别是11.88、30.34、9.168、30.25、4.784和21.03 μmol·L-1, 这些结果与文献报道相一致[10, 11]。查阅文献发现, 格兰地新具有抑制β-分泌酶(BACE)的作用[11]; 黄芩素、黄芩苷、去甲基汉黄芩素和汉黄芩素具有较强的抗氧化活性和清除自由基的活性[12, 13]; 京尼平苷、10-O-乙酰基京尼平苷、红景天苷、(1R, 7R, 10S)-7-羟基-11-O-β-D-吡喃葡萄糖基愈创木烷-4-烯-3-酮、10-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇和11-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇表现出不同程度地提高老年痴呆转基因果蝇短期学习记忆能力[14]。
黄连解毒汤中筛选出的具有抗AD作用的17个活性成分共涉及59个靶点蛋白, 详细结果见表 1。从得到的靶点信息可知, BACE1 (P56817) 出现的频数最高(18次), 其次是雌二醇17-β-脱氢酶1 (P14061) 和GTP酶HRas (P01112) 等。
将黄连解毒汤中抗AD作用成分预测出的59个靶点蛋白信息导入MAS 3.0中进行KEGG通路注释和分析, 共得到47条代谢通路, 涉及13种类别, 其中与疾病(human diseases)相关的通路共15条; 与免疫系统(immune system)相关的通路共5条; 与信号传导(signal transduction)相关的通路共4条; 与神经系统(nervous system)相关的通路仅1条; 与碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)相关通路共4条; 与脂质代谢(lipid metabolism)相关通路仅1条等(表 2)。
采用Cytoscape 3.4.0软件建立黄连解毒汤中抗AD活性成分-靶点蛋白-通路网络模型图, 17个活性成分、59个靶点和47条通路之间的相互关系见图 3。
通过“药效成分-靶标-通路”网路分析发现: ① 黄连解毒汤中生物碱、黄酮和环烯醚萜3大类成分既可通过不同的靶点与同一作用通路相连接, 也可以通过同一靶点与不同的作用通路相连接, 说明不同成分的作用靶点具有协同作用; ② 黄连解毒汤具有多成分、多靶点和多途径的整体调节特点, 其作用靶点包括BACE1、雌二醇17-β-脱氢酶1和GTP蛋白酶等, 作用通路涉及疾病-内分泌-细胞-神经-免疫-信号传导等多条代谢通路。
反向药效团匹配结果表明, 药效成分作用靶点中与AD相关的靶点蛋白共4个, 分别是BACE1、糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、脑啡肽酶(neprilysin, NEP)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS), 其中BACE1为AD的一个病理特征, 在生成Aβ的过程
中发挥了关键性作用。因此, BACE1抑制剂是治疗AD的一个靶点[15]; GSK-3β可促进Tau蛋白过度磷酸化、Aβ异常聚集和神经细胞凋亡, 在AD病变过程中发挥关键作用[16]; NEP是脑内最主要的Aβ降解酶[17], 在AD的病理和治疗过程中起到关键作用[18]; iNOS参与了AD的发病进程[19]。反向对接实验结果表明: ① 黄芩苷和11-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇与BACE1相接, 预测该2种成分通过抑制BACE1活性, 减少Aβ产生, 发挥对抗AD的作用[20]; ② 11-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇与GSK-3β相接, 预测其可通过抑制Tau蛋白过度磷酸化和Aβ异常聚集、减弱神经细胞凋亡发挥抗AD作用; ③ 巴马汀、表小檗碱、非洲防己碱、格兰地新、黄连碱、小檗碱、药根碱和10-O-乙酰基京尼平苷均与NEP相接, 预测这些成分可通过增强NEP活性, 清除脑内Aβ, 发挥抗AD作用; ④ 11-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇与iNOS相接, 预测其通过抗炎作用发挥抗AD作用。
通过分子对接发现, 与AD相关的靶点蛋白中GSK-3β与胰岛素信号通路(insulin signaling pathway)相接。研究发现[21, 22], 胰岛素可以透过血脑屏障进入中枢神经系统, 发挥调节作用。当胰岛素信号通路受损时, 导致脑中葡萄糖代谢衰退, 与AD疾病发展密切相关, 因此AD的另一种假说“AD可能是3型糖尿病”[23]。研究[24, 25]表明, 胰岛素信号传导通过作用于生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor bound protein-2, Grb2)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路和GSK-3β等, 影响细胞生长、调控β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, βAPP)的表达、Aβ斑块清除和Tau磷酸化水平等。Li等[26]研究表明, 黄连解毒汤可有效改善2型糖尿病(T2DM)大鼠学习记忆能力, 对T2DM大鼠海马Tau蛋白Alzheimer病样过度磷酸化修饰具有较好的抑制作用。因此, 黄连解毒汤可能通过胰岛素信号通路发挥清除/减少脑内Aβ、抑制Tau蛋白过度磷酸化而发挥抗AD作用。
据文献[27]报道, AD主要的病理产物—Aβ斑块和神经元纤维缠结(NFTs)可以引起神经炎症, 对脑组织产生毒性, 而这些神经炎症细胞因子的产生受活化的小胶质细胞和星形胶质细胞调控, 其中小胶质细胞内与神经炎症相关的信号通路包括MAPK信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPAR-γ)、Notch信号通路及JAK-STAT信号通路[28]。从网络分析结果中发现, 黄连解毒汤中抗AD作用的药效成分与神经炎症相关的信号通路分别是MAPK信号通路和Toll样受体信号通路; 而MAPK信号通路中的ERK信号通路、JNK/SAPK9通路和p38MAPK通路均在AD所造成神经细胞损伤机制中发挥重要作用[29]; Toll样受体-4 (TLR-4) 信号通路在AD的发病过程中发挥重要作用[30]。
与MAPK信号通路具有相关性的化合物:黄连碱、药根碱、黄芩苷、京尼平苷、去甲基汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩素、11-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇、10-O-乙酰基京尼平苷、10-(6-O-反-芥子酰基吡喃葡萄糖基)栀子二醇、(1R, 7R, 10S)-7-羟基-11-O-β-D-吡喃葡萄糖基愈创木烷-4-烯-3-酮和红景天苷。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR), 可特异性识别病原相关分子模式(PAMPs), 参与激活先天性免疫和获得性免疫应答的启动。与Toll样受体信号通路具有相关性的化合物为药根碱。以上预测结果表明, 黄连解毒汤中生物碱、黄酮和环烯醚萜3大类化合物均具有不同程度的抗炎作用, 与本实验室前期研究结果相一致[31], 该方可能通过抗炎作用而发挥其AD治疗作用。
结论本文应用网络药理学的研究方法对该方中17个已知的的药效成分进行靶标预测和通路分析, 通过建立“药效成分-靶点-通路”网络图, 发现黄连解毒汤中药效成分可能通过抑制Aβ产生、抑制Tau蛋白过度磷酸化和Aβ异常聚集、减弱神经细胞凋亡、清除脑内Aβ、抗炎和免疫活性发挥抗AD作用, 提示这些可能是该方治疗AD的潜在机制。
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