药学学报  2017, Vol. 52 Issue (7): 1196-1202   PDF    

编者按

新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

药物与靶标分子的相互作用是药效的原动力, 基于靶标的三维结构“量体裁衣”式的设计新药, 应是最理性的方法。靶标分子的柔性构象与不同化合物结合的多样性是基于结构的药物设计(SBDD)的难点之一。分子量较小的HIV蛋白酶是对称的二聚体, 容易获得复合物单晶, 所以在由香豆素演化成最终的替拉那韦的历程中, 在多个节点处解析了复合物结构, 辅助了设计。即使这样, 还有许多需要探索的未知内容, 因而, 应用药物化学的原理和策略, 不断驱动着SBDD的进程。替拉那韦的研制特点在于由苗头过渡到先导物乃至先导物优化, SBDD+药物化学方法贯穿于全过程。

基于靶标结构理性设计的替拉那韦
郭宗儒     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
1 研发背景和苗头物的发现

20世纪90年代初, 以HIV蛋白酶为靶标研制抗艾滋病药物已经不满足于肽类模拟物, 虽然在拟肽的结构中“镶入”模拟肽键水解的过渡态结构, 可以提高活性强度, 但仍因口服生物利用度低和代谢不稳定而限制了治疗效果, 因而更多关注研发HIV蛋白酶的非肽类抑制剂。

Upjohn公司基于荧光显示的高通量筛选方法, 评价了5 000个结构多样的化合物对HIV蛋白酶的抑制活性, 发现抗凝血药物华法林(1, warfarin)有弱抑制活性, IC50 = 30 μmol·L-1。在此之前有报道称华法林可抑制HIV-1病毒复制和传播(Bourinbaiar AS, Tan X, Nagorny R. Effect of the oral anticoagulant, warfarin, on HIV-1 replication and spread. AIDS, 1993, 7: 129-130)。根据这些苗头信息, 进一步对化合物作相似性搜寻, 发现另一个抗凝药苯丙香豆素(2, phenprocoumon)有更强的抑制活性, Ki = 1 μmol·L-1, 这两个生物利用度高的口服药物作为苗头化合物是一个良好的开端。

2 苗头化合物与蛋白酶的结合方式 2.1 HIV蛋白酶活性中心的结构特征

HIV蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族, 催化肽键裂解, 天冬氨酸是活性催化部位的重要组成部分。该蛋白酶是由相同的二聚体组成, 对称组合具有二重旋转对称轴(C2), 每个单体的活性部位底部有Asp25、Thr26和Gly27, 顶部有Ile50封盖。每个单体含有4个结合腔穴S1~S4 (另一单体表示为S1'~S4'), 被水解的底物肽的结构部位P1~P4和P1'~P4'分别结合到相对应的腔内。HIV蛋白酶有两种亚型: HIV1和HIV2, 二者序列的等同性为50%, 差异主要在活性部位的外围。底物的Asp25和Asp25'的两个羧基结合并活化结构水分子(structural water), 是催化反应之关键, 顶部的Ile50和Ile50'形成氢键有助于水解过程。图 1是病毒蛋白与蛋白酶结合的示意图。

图 1 病毒蛋白与蛋白酶结合的示意图
2.2 化合物2与蛋白酶的结合特征

根据酶与抑制剂形成的复合物结构, 可以指导化合物的结构优化, 为此制备了2与HIV1蛋白酶复合物的单晶, 经X-射线衍射分析表明, 有以下的结合特征: ① 化合物2的C4相连的羟基与Asp25和Asp25'形成氢键; ② 内酯环的两个氧原子与顶部Ile50和Ile50'的酰胺-NH-形成氢键。提示4-羟基香豆素是重要的药效团特征, 图 2a是化合物2与蛋白酶形成的氢键网络示意图; ③ C3相连的α-乙基进入S1腔内, α-苯基进入S2腔; ④ 香豆素环处于S1'腔内, 但由于刚性的并合苯环, 2不能结合到S2'腔内。图 2b是化合物2与蛋白酶结合的位置及范德华表面。应当指出, 空闲的S2'腔未发生结合是不利因素, 需要有基团填充。化合物2抑制蛋白酶的活性Ki值为1 μmol·L-1, 抑制HIV感染细胞的能力ED50 = 100~300μmol·L-1

图 2 化合物2与HIV1蛋白酶形成氢键的示意图(a)、2与蛋白酶结合的位置及范德华表面(b)
2.3 结构优化—简化母核并引入基团以与S2 '腔结合

化合物2的4-羟基香豆素的苯并结构对与酶的结合不仅没有贡献, 反而使分子无法接近S2'腔。若去除该并合的苯环, 并不影响羟基δ-不饱和内酯形成氢键的结构因素, 同时在6位连接苯乙基, 得到化合物3, 柔性的苯乙基容易接近S2'腔。化合物3提高了抑酶活性, Ki值为0.5μmol·L-1图 3a表示了化合物3形成的氢键结合, 图 3b3在HIV活性中心的结合模式, 可以看出, C6连接的乙苯基接近于S2'腔。

图 3 化合物3与HIV1蛋白酶形成氢键的示意图(a)、3与蛋白酶结合的位置及范德华表面
2.4 与S1 '腔的结合作用

化合物3虽然能够接近S2', 但S1'也未被结合, 为此, 在C6的α位连接乙基, 可伸入到S1'腔, 同时将苯基挤得更接近于S2'腔。这样, 化合物4的C3和C6分别连接了乙基/苯基和乙基/苄基, 犹似假对称性分子, 分别处于4个腔穴中, 也因此提高了化合物4对蛋白酶的抑制活性, Ki值为38 nmol·L-1。化合物4含有2个手性碳原子, 2对差向异构体经拆分成4个单体, 对HIV-1蛋白酶抑制的作用(Ki值)分别为14、42、80和109 nmol·L-1

化合物4对HIV1和HIV2的抑制活性都很强, 而对人的蛋白酶没有或弱作用, 例如在10 μmol·L-1浓度下, 4对肾素、胃蛋白酶和组织蛋白酶的抑制率分别为0、52%和53%。对HIV1感染的细胞EC50 = 3 μmol·L-1, 在10μmol·L-1浓度下没有细胞毒作用。化合物4也有较好的药代动力学性质, 例如对大鼠和犬的口服生物利用度分别为76%和45%, 半衰期t1/2为6.0和4.0 h, 4可以视作里程碑式的化合物(Thaisrivongs S, Tomich PK, Watenpaugh KD, et al. Structure-based design of HIV protease inhibitors: 4-hydroxycoumarins and 4-hydroxy-2-pyrones as non-peptidic inhibitors. J Med Chem, 1994, 37: 3200-3204)。

3 骨架的再变换 3.1 6, 6-二取代吡喃酮骨架

分析化合物2与酶的晶体结构, 显示出C6侧链上的苯环没有进入S2'腔内, 因而化合物的结构改造有较大的空间。由于S1'和S2'很接近, 设想将C6由sp2杂化碳换成sp3碳原子, 以便从C6引出两个疏水性基团, 分别进入S1'和S2'腔内, 从而设计合成了化合物5 ~11, 连接于C6的两个基团一个是苯基(5 ~8)或苄基(9 ~11), 另一为烷基、环烷基或苄基, 表 1列出了化合物结构和对HIV蛋白酶的活性。5 ~8的构效关系表明, 连接C6的基团一个是苯基, 另一个基团较小时活性较强, 若是环己基或苯基等较大基团, 则活性显著减弱。化合物6与蛋白酶的复合物单晶衍射图(图 4)表明, 4-羟基经水分子搭桥(氢键)与一个丝氨酸残基形成氢键; C3连接的苯基和乙基分别结合于S1和S2腔内; 连接于C6的苯基结合于S1'中, 另一基团进入S2'内。化合物78的低活性提示S2'不能容纳较大的基团。显然, 9 ~11的C6为苄基取代的化合物活性都很弱。

表 1 化合物5 ~11的结构和抑制HIV蛋白酶活性

图 4 化合物6与HIV1蛋白酶晶体结构的活性中心结合图
3.2 集高活性基团于吡喃酮的6

化合物3的吡喃酮的6位是苯乙基, 活性为Ki = 500 nmol·L-1; 化合物6Ki值为95 nmol·L-1, 它的6位是正丙基, 将这两个基团同时连接在6位, 化合物12Ki = 35 nmol·L-1, 活性显著提高, 进而变换C3侧链α位的乙基, 合成了化合物13 ~17, 结构与活性列于表 2中。当R为较小的乙基或乙烯基时, 活性很强, 换成较大环状取代基团也有较强的活性(33~64 nmol·L-1), 提示C3侧链的α烷基尺寸对活性的影响不大。

表 2 化合物12 ~17的结构与活性
3.3 化合物12与蛋白酶的结合特征

化合物12与蛋白酶复合物晶体结构表明, 二氢吡喃酮环在骨架上的折叠方向与化合物6相反, 使得C3侧链的α苯基结合到S2腔, 乙基进入S1腔(图 5), 这与化合物6的结合模式相反, 因此4-羟基结合的天冬氨酸也与化合物6的结合模式不同(即另一亚基的天冬氨酸)。

图 5 化合物12与HIV1蛋白酶晶体结构的活性中心结合图
3.4 含有相同基团取代的C6—去除一个手性中心

在羟基吡喃酮的C6位若连接相同取代基, 则减少一个手性中心, 可避免生成差向异构体的复杂性。为此合成了6, 6-二正丙基、C3α变换的化合物18 ~21。结果表明, C3α连接较小的基团如乙基或环丙基时有强抑制活性, 环戊基活性仍较强, 而叔丁基失去活性, 提示体积过大不适于结合。然而, 若C6连接二异丁基(22), 活性显著减弱, 二苄基化合物(23)则完全失去活性。表 3列出了化合物18 ~23的结构与活性。

表 3 化合物18 ~23的结构与活性
3.5 C 6的螺环化合物

C6连接两个正丙基的化合物1819显示强效抑酶活性, 若将烷基链连接成环, 形成螺环化合物, 希望对烷基链经构象限制而有利于结合, 因而合成了螺5、螺6、螺7和螺8元环化合物24 ~27。然而结构表明, 除螺6化合物25活性略强外, 其余3个活性都很弱。

由于25呈现尚可的活性(Ki = 780 nmol·L-1), 而且C8的位置接近酶的Arg8, 若在C8处引入氧原子, 有可能形成氢键而增强结合力。令人意外的是, 合成的含氧螺6环化合物28 ~30活性极弱。后来经解析化合物25与HIV2蛋白酶(Ki = 370 nmol·L-1)的复合物晶体结构, 发现C8距离Arg8甚远, 不能形成氢键。表 4列出了螺环化合物24 ~30的结构与活性。

表 4 螺环化合物24 ~30的结构与活性

上述评价的是对HIV1 (或2) 的蛋白酶抑制作用, 继而测定了细胞培养的抗病毒生长的活性, 结果显示, 即使酶活性最强的化合物19 (Ki = 15 nmol·L-1), 其抗病毒活性并不高EC50 = 5 μmol·L-1。因而仍需继续优化结构与活性(Thaisrivongs S, Pomero DL, Tommasi RA, et al. Structure-based design of HIV protease inhibitors: 5, 6-dehydro-4-hydroxy-2-pyrones as effective, nonpeptidic inhibitors. J Med Chem, 1996, 39: 4630-4642)。

4 S3结合腔的利用 4.1 模拟肽类抑制剂的部分结构

以上述及的是与酶活性部位的S1、S1'、S2和S2'结合的优化过程, 其实HIV蛋白酶与底物的作用涉及6个结合腔, 上述的研究没有利用S3和S3'。为了研究对S3结合的结构特征, 借鉴了肽类蛋白酶抑制剂的结构因素。

Upjohn研究者通过分子模拟比较了拟肽蛋白酶抑制剂U-75875 (31)和香豆素类小分子32与蛋白酶的结合特征, 发现有许多相似之处:骨架可以叠合; 都分别占据了S1'、S1和S2结合腔, 咪唑环和溴原子进入S2腔, 而且咪唑的α亚甲基与苯环的间位碳原子重合在一起(用星号表示); 31的含萘环片段进入S3腔, 对结合有重要贡献, 而32太短未触及该腔。因而推论若化合物32自间位苯环处引出适宜的片段结合于S3, 可能提高化合物活性。

分析31的复合物结构, 星号右边的胺甲酰基分别与酶的Gly48和Asp29形成两个氢键, 萘环发生疏水-疏水相互作用, 这些都会提升化合物对蛋白酶的的亲和力。

4.2 构效关系

基于上述的分析, 设计合成了一系列化合物, 表 5列出了有代表性的化合物33 ~38的结构和活性。33是在化合物2的C3α-苯基的间位经胺甲酰连接基引出叔丁氧羰基疏水末端, 活性Ki = 160 nmol·L-1, 比化合物2的活性增加了5倍(2Ki = 1 000 nmol·L-1), 提示新链的引入有利于同蛋白酶的结合。33与酶的复合物晶体结构表明, 叔丁氧羰基占据了S3腔, NH与Gly48、酰基氧与Asp29和Asp30形成氢键, 另一NH则与Arg8形成氢键, 母核香豆素仍然保持与Asp25、Ile50的氢键网络结合。图 6是化合物33与HIV2蛋白酶晶体结构的活性中心结合图。

表 5 有代表性的化合物33 ~38的结构和活性

图 6 化合物33与HIV2蛋白酶晶体结构的活性中心结合图(黄色虚线表示氢键结合)

化合物33的C3苯环引出的侧链其实是用Boc保护的甘氨酸酰化的C3α-苯胺, 3436分别是Boc保护的β-氨基丙酸和L-丙氨酸, 活性与33相近, 但γ-氨基丁酸(35)和脯氨酸(37)的活性很弱, 推测是链过长或过短之故。化合物38的活性增强, 提示末端基团可作广泛的变换。

鉴于C3α-乙基变换成环丙基可提高活性, 如化合物19活性强于18, 合成的有代表性化合物如3940的活性Ki分别高达为86 nmol·L-1和28 nmol·L-1, 确证了侧链进入S3腔促进了结合。

4.3 羟基吡喃酮母核上引入侧链以结合S3

研究至此, 已揭示并积累了多个可提高活性的

结构因素: ① 母核香豆素简化为羟基吡喃酮; ② 吡喃酮6位连接α-乙基和苯乙基, 如化合物4 (Ki = 38 nmol·L-1); ③ C3的α位连接环丙基或乙基; ④ C3的α位苯基的间位连接有胺甲酰引出的末端疏水片段, 如化合物40 (Ki = 28 nmol·L-1), 这些因素也分别反映在晶体结构的结合特征中。拼合这些有利的因素为一体设计合成了41 ~45化合物, 结构与活性列于表 6

表 6 化合物41 ~45的结构与活性

这5个有代表性的化合物都有较高的抑酶活性, 除42不是氨基酸的类似物外, 其余4个是尺寸不同的氨基酸片段, 活性差异不大, 即使组氨酸的咪唑环被对甲苯磺酰基保护, 仍不影响与酶的结合, 提示该侧链的基团安排和定位取向是相近的。化合物42的末端为吡啶, 虽不是氨基酸的结构, 仍呈现高活性, 表明该侧链的变换的自由度大, 有较大的变换空间。

活性最强的化合物45 (Ki = 4 nmol·L-1)含有两个手性中心, 两对差向异构体经分离和拆分得到的4个光活单体都有高抑制活性, 分别为1.4、4.2、6.3和8.5 nmol·L-1, 提示这两个手性中心的立体构型对酶分子的结合没有显著影响。

化合物41与HIV1蛋白酶复合物的晶体结构表明, 母核4-羟基吡喃酮与活性中心形成如前述的氢键网络, C3α-苯基的间位取代的氨甲酰基也发生氢键结合, 分子中的各个片段“对号入座”地分别结合于S2'、S1'、S1、S2和S3腔中, 提示依据前面所述的化合物结合特征设计的新分子确实适配于HIV蛋白酶的活性中心。

化合物41 ~45对感染HIV1IIIB病毒的WT4细胞实验表明, IC50在3~6μmol·L-1范围; 用MTT法测定化合物的细胞毒作用, 在30 μmol·L-1浓度下未呈现细胞毒作用, 提示对正常细胞的毒性TD50>30μmol·L-1 (Thaisrivongs S, Watenpaugh KD, Howe WJ, et al. Structure-based design of novel HIV protease inhibitors: carboxamide-containing 4-hydroxycoumarins and 4-hydroxy-2-pyrones as potent nonpeptidic inhibitors. J Med Chem, 1995, 38: 3624-3637)。

5 含胺磺酰连接基的结构类型 5.1 胺甲酰基的电子等排变换

在优化活性的过程中, 对C3α-苯基的间位取代的胺甲酰连接基进行了变换, 胺磺酰基是胺甲酰基的二价等排体, 在本项目中都能履行氢键给体(NH)和接受体(氧原子)的功能。化合物46是优化过程中的一个有代表性的化合物, 它是化合物33的优化改构物:将香豆素母核变换为环辛并吡喃酮结构; C3α-乙基替换为环丙基; C3α-苯基间位的胺甲酰基换成胺磺酰基, Boc-甘氨酸变成4-氰基苯, 由于这些变换都是采纳了提高活性的结构因素, 因而抑酶活性由化合物33Ki = 160 nmol·L-1提高到43的15 nmol·L-1, 后者抑制病毒生长的IC50 = 1.5 μmol·L-1 (Harvey I, Skulnick HI, Johnson PD, et al. Structure-based design of sulfonamide-substitut ed non-peptidic HIV protease inhibitors. J Med Chem, 1995, 38: 4968-4971)。

化合物45的抑酶活性Ki = 4 nmol·L-1, 但结构中含有手性的组氨酸残基, 为了减少手性中心, 同时将胺甲酰基改换为胺磺酰基, 合成了一系列化合物, 其中47Ki = 1.3 nmol·L-1, 抑制病毒生长的活性IC50 = 1.3 μmol·L-1 (对细胞和酶的活性相差1 000倍!)。进而用不同取代的苯环、吡啶、喹啉等替换化合物47中的甲基咪唑环, 然而这些化合物的抑制酶和病毒感染细胞的活性都低于47。含有两个手性中心的47分离成4个立体异构单体, 分别测定酶活性的Ki值最低为0.52 nmol·L-1, 最高1.9 nmol·L-1; 对感染HIV细胞的IC50为0.9~2.2μmol·L-1

化合物47与HIV2蛋白酶复合物晶体结构显示(图 7), 母核C6连接的α-乙基和苄基分别结合于S1'和S2', C3α-环丙基进入S1腔, C3α-苯基进入S2腔, 甲基咪唑环结合于S3腔内。在氢键结合的特征上, 4-羟基吡喃酮环与Asp25和Asp25'以及Ile50形成氢键网络, 与前述的化合物相同; 磺酰基的氧原子与Asp30'形成氢键, 咪唑氮原子作为氢键接受体与Asp29'结合(Thaisrivongs S, Janakiraman MN, Chong KT, et al. Structure-based design of novel HIV protease inhibitors: sulfonamide-containing 4-hydroxycoumarins and 4-hydroxy-2-pyrones as potent non-peptidic inhibitors. J Med Chem, 1996, 39: 2400-2410)。

图 7 化合物47与HIV2蛋白酶复合物晶体结构
5.2 整合优势片段于一体

先导物多位点的构效关系研究, 得到如下对活性具有优势贡献的片段或基团: ① 母核为4-羟基吡喃酮; ② 6, 6-二取代片段, 其中一个的尺寸不大于正丙基; ③ C3α1-取代基为乙基或环丙基; ④ C3α2-苯基的间位有连接基为胺磺酰基-NHSO2-; ⑤ C3侧链的末端为疏水性基团, 优选为N-甲基咪唑, p-取代苯或吡啶。原则上讲, 将这些优选的结构片段组装成一个分子理应有较高的活性, 但由于每个优选的片段都是在不同的骨架结构中表现的, 经验告诉我们, 优选的片段共同组装在新的骨架上未必成为最佳分子, 因而继续探索和优化仍是必要的。

5.2.1 C6基团的变换

以4-羟基吡喃酮为母核, C3α1固定为乙基, C3α2固定为间位经胺磺酰连接的甲基咪唑的苯基, 变换C6的两个片段, 如二正丙基、二正丁基、二异丁基、二环丙乙基、(取代的)苯乙基正丙基、苄基苯乙基等, 测定了抑酶活性(Ki)、抑制病毒活性IC50和IC90, 其中化合物48的活性最佳, Ki、IC50、IC90分别为1.2 nmol·L-1、0.3 μmol·L-1和0.9μmol·L-1

5.2.2 变换C3α-烷基

固定C6为正丙基和苯乙基或为二正丙基, 变换C3α-烷基为环丙基、叔丁基或氢, 对酶和病毒的活性最高的两个化合物是4849, 49Ki、IC50和IC90分别为1.2 nmol·L-1、0.15 μmol·L-1和0.69μmol·L-1

5.2.3 变换末端基团和确定候选药物

固定C6为正丙基和苯乙基, C3α为乙基或环丙基, 变换C3α侧链的末端基团, 合成了含有p-CN、F取代的苯基、8-喹啉基、2-(5-取代基)吡啶, 后者如5-CN、F、CF3、NH2或NO2等基团, 其中活性最强的是化合物5050 (结构式标出的是3αR, 6R异构体)含有两个手性中心, 经拆分得到4个立体异构体, 列于表 7

表 7 通式50的差向异构体

化合物50的3αR, 6R异构体是4个立体异构体的活性最强的化合物, 也是所有合成化合物活性最强的分子, 对沙奎那韦、茚地那韦和奈非那韦耐药的HIV病毒敏感度提高了47~>125倍, 对利托那韦耐药株敏感度提高2~3倍。对临床AZT耐药的10株病毒的IC90平均值为0.16 μmol·L-1。大鼠灌胃的口服生物利用度F = 30%, 半衰期t1/2 = 5.4 h, 健康受试者单次剂量100~1 000 mg是安全可以耐受的。化合物50命名为替拉那韦(tipranavir), 经临床研究表明对HIV感染患者可有效地控制血液中病毒载量, 遂于2005年FDA批准上市(Turner SR, Strohbach JW, Tommasi RA, et al. Tipranavir (PNU-140690): a potent, orally bioavailable nonpeptidic HIV protease inhibitor of the 5, 6-dihydro-4-hydroxy-2-pyrone sulfonamide class. J Med Chem, 1998, 41: 3467-3476)。

5.3 替拉那韦与HIV1蛋白酶的结合方式

替拉那韦与HIV1蛋白酶复合物晶体结构表明(图 8ab), 4-羟基吡喃酮的羟基和氧原子与Asp25/ Asp25'和Ile50/Ile50'形成两对氢键; 磺酰基氧原子与Asp30和Ile50形成氢键; C6的苯乙基和正丙基分别结合于S1'和S2'腔; C3α-乙基和苯环分别进入S1和S2腔内; 胺磺酰基连接的末端基团结合于S3腔。

图 8 替拉那韦与HIV1蛋白酶的氢键结合(a)、替拉那韦与HIV1蛋白酶的各个腔的结合(b)