中药南鹤虱(Fructus carotae), 又名鹤虱、野胡萝卜子、窃衣子、虱子草, 是伞形科植物野胡萝卜(Daucus carota L.)的干燥成熟果实, 其主要分布于江苏、湖北、四川、浙江、安徽、贵州等地; 研究表明, 中药南鹤虱有多种药理作用, 如杀虫、抗菌、抗腹泻、抗炎、镇痛、扩张冠状动脉和肝保护等[1], 可用于治疗蛔虫、痔瘘、病毒性角膜炎、钩虫病、肠道滴虫病和水肿等多种疾病[2-5]。文献报道南鹤虱中主要含黄酮[6]、香豆素和倍半萜类化合物[7]。为了进一步阐明中药南鹤虱的化学成分, 指导民间科学用药, 本研究对其乙醇提取物进行了分离纯化, 从中分离得到了9个愈创木烷型倍半萜类化合物(图 1), 通过波谱分析鉴定了它们的结构, 其中化合物1为新化合物, 化合物5为新的天然产物, 化合物2 ~4为首次从该属植物中分离得到。
化合物1为淡黄色油状物, HR-ESI-MS给出其准分子离子峰m/z 335.221 44 [M+H]+ (计算值C20H31O5+: 335.221 69), 确定其分子式为C20H30O4, 有6个不饱和度。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) (表 1)显示有6个甲基氢信号: δH 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz)、1.24 (3H, s)、1.27 (3H, s)、1.72 (3H, s)、1.89 (3H, s)和2.00 (3H, br. d, J = 7.0 Hz); 1个烯氢δH 6.12 (1H, m); 1个联氧氢δH 5.44 (1H, m)。13C NMR (CDCl3, 100 MHz)结合HSQC谱显示有20个碳信号, 包括1个羰基δC 208.6; 5个sp2杂化碳δC 175.2、167.0、139.6、135.0、127.4; 2个联氧碳δC 73.5、72.7; 6个甲基碳δC 28.8、28.1、8.1、16.1、20.8、22.7; 3个仲碳δC 41.5、26.0、40.1; 3个叔碳δC 51.6、48.9、34.0;通过分析核磁数据发现其可能为愈创木烷型倍半萜类化合物。HMBC谱中(图 2), 甲基氢δH 1.89 (3H, s)和甲基氢δH 2.00 (3H, br. d, J= 7.0 Hz)同时和δC 167.0、139.6、127.4的碳信号有相关, 烯氢δH 6.12 (1H, m)和这2个甲基[δC 20.8, δH 1.89 (3H, s)]、[δH 2.00 (3H, br. d, J = 7.0 Hz), δC 16.1]都有相关, 说明结构中存在当归酰氧基片段; HMBC谱中H-8和C-6、C-9、C-1' (δC 167.0) 相关, 说明当归酰氧基连在C-8位上; 12-CH3、13-CH3和C-11 (δC 72.7) 相关, 说明有羟基连在C-11位上; 15-CH3和C-3 (δC 208.6)、C-5 (δC 175.2) 有相关, H-1及H-2也和C-3、C-5有相关, 说明分子中有α, β不饱和羰基存在于C-3、C-4、C-5位上。进一步分析核磁数据发现其和已知化合物7非常相似, 区别在于化合物1中C-11位上的羟基取代了化合物7中的乙酰氧基。综上, 化合物1的结构确定为11-羟基-8β-当归酰氧基-4-愈创木烯-3-酮。
Agilent DD2 400-MR型核磁共振仪, TMS为内标(美国Agilent公司); Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL型高分辨质谱仪(美国Thermo公司); LC3000型高效液相色谱仪(中国北京创新通恒公司), C18 5 μm 10 mm × 250 mm半制备HPLC柱(日本YMC公司); UV3600紫外可见近红外分光光度计(日本岛津公司); 薄层色谱硅胶GF 254和柱色谱硅胶(200~300目) (中国青岛海洋化工); Sephadex LH-20凝胶(德国Merck公司)。
南鹤虱于2016年7月购自药材市场, 由遵义医学院生药学教研室聂绪强副教授鉴定为野胡萝卜(Daucus carotaL.)的干燥成熟果实, 即中药南鹤虱(Fructus carotae), 样品标本(No.20151108) 保存在遵义医学院药学院。
1 提取分离南鹤虱干重5.0 kg, 粉碎后用乙醇回流提取4次, 每次2 h, 合并提取液减压浓缩得乙醇总浸膏420 g, 将之分散于水中, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取, 减压浓缩得各部分提取物。石油醚提取物再用甲醇萃取, 得到甲醇萃取物73 g, 该部位浸膏经硅胶柱色谱(80 mm × 600 mm, 石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱, 10:1, 1:10, V/V)分为8个部分: Fr.1~8。Fr.1经半制备HPLC分离(乙腈-水, 95:5, V/V, 4.5 mL·min-1)得到化合物2 (15 mg, tR = 6.1 min)。Fr.2经硅胶柱反复分离得到化合物7 (100 mg)。Fr.5经ODS柱色谱(甲醇-水, 90:10, V/V)分离后, 再经Sephadex LH-20柱色谱分离, 纯甲醇洗脱分为3部分Fr.5.1~3。Fr.5.2经半制备HPLC分离(甲醇-水, 90:10, V/V, 3 mL·min-1)得到5个亚组分: Fr.5.2A~E; 其中亚组分Fr.5.2E经半制备HPLC分离(甲醇-水, 90:10, V/V, 3 mL·min-1)得到化合物3 (11 mg, tR = 23.2 min); 亚组分Fr.5.2A进一步经半制备HPLC分离(甲醇-水, 90:10, V/V, 3.5 mL·min-1)得到化合物4 (9 mg, tR = 13.2 min); Fr.8经ODS柱色谱(甲醇-水, 90:10, V/V)洗脱分为4部分Fr.8.1~4; Fr.8.2经Sephadex LH-20 (纯甲醇洗脱)分为8部分Fr.8.2.1~8; Fr.8.2.2经半制备HPLC分离(甲醇-水, 75:25, V/V, 4 mL·min-1)得到6个亚组分Fr.8.2.2A~F; 亚组分Fr.8.2.2A进一步经半制备HPLC分离(甲醇-水, 35:65, V/V, 3.5 mL·min-1)得到化合物9 (8 mg, tR = 4.0 min); 亚组分Fr.8.2.2B进一步经半制备HPLC分离(甲醇-水, 45:55, V/V, 4 mL·min-1)得到化合物8 (10 mg, tR = 13.7 min); 亚组分Fr.8.2.2F进一步经半制备HPLC分离(甲醇-水, 55:45, V/V, 3.5 mL·min-1)得到化合物1 (13 mg, tR = 28.4 min); Fr.8.2.3经半制备HPLC分离(甲醇-水, 95:5, V/V, 5 mL·min-1)得到5个亚组分Fr.8.2.3A~E; 亚组分Fr.8.2.3A进一步经半制备HPLC分离(甲醇-水, 70:30, V/V, 5 mL·min-1)得到化合物5 (9 mg, tR = 19.4 min)和化合物6 (12 mg, tR = 28.4 min)。
2 结构鉴定化合物1 淡黄色油状物; C20H30O4; [α]D20-21.0 (c 0.06, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 236 (2.78) nm; HR-ESI-MS m/z 335.221 44 [M+H]+ (计算值C20H31O5+: 335.221 69); 1H NMR (400 MHz, CDCl3)和13C NMR (100 MHz, CDCl3)见表 1。
化合物2 白色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 2.27 (1H, m, H-1), 1.98 (3H, s, H-2'), 1.45 (3H, s, H-13), 1.44 (3H, s, H-12), 1.00 (3H, m, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)见表 1。经波谱数据和文献[8]对照鉴定化合物2为11-乙酰氧基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物3 淡黄色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.27 (1H, m, H-8), 1.93 (3H, s, H-2''), 1.67 (3H, s, H-15), 1.51 (3H, s, H-13), 1.47 (3H, s, H-12), 1.14 (6H, br. s, H-3', 4'), 0.97 (3H, br. s, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)见表 1。经波谱数据和文献[9]对照鉴定化合物3为11-乙酰氧基-8β-异丁酰氧基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物4 淡黄色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.28 (1H, m, H-8), 1.92 (3H, s, H-2''), 1.67 (3H, s, H-15), 1.49 (3H, s, H-13), 1.45 (3H, s, H-12), 1.11 (3H, t, J = 7.2 Hz, H-3'), 0.97 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)见表 1。经波谱数据和文献[9]对照鉴定化合物4为11-乙酰氧基-8β-丙酰氧基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物5 淡黄色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.69 (3H, s, H-15), 1.23 (3H, s, H-13), 1.22 (3H, s, H-12), 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)见表 1。和文献[10]对照经HSQC和HMBC鉴定化合物5为11-羟基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物6 淡黄色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.07 (1H, m, H-3'), 5.41 (1H, m, H-8), 1.98 (3H, m, H-4'), 1.96 (3H, s, H-2''), 1.89 (3H, m, H-5'), 1.70 (3H, s, H-15), 1.51 (3H, s, H-13), 1.50 (3H, s, H-12), 1.07 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)见表 1。经波谱数据和文献[11]对照鉴定化合物6为11-乙酰氧基-8β-当归酰氧基-1β-羟基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物7 白色晶体; [α]D20 -57.3 (c 0.06, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 6.05 (1H, m, H-3'), 5.41 (1H, m, H-8), 1.97 (3H, dq, J = 7.3, 1.5 Hz, H-4'), 1.94 (3H, s, H-2''), 1.87 (3H, m, H-5'), 1.68 (3H, br. s, H-15), 1.50 (3H, s, H-13), 1.48 (3H, s, H-12), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-14); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz)见表 1。经波谱数据和文献[12]对照鉴定化合物7为11-乙酰氧基-8β-当归酰氧基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物8 淡黄色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.33 (1H, td, J= 8.2, 4.6 Hz, H-8), 2.10 (3H, s, H-2'), 1.73 (3H, br. s, H-15), 1.28 (3H, s, H-13), 1.26 (3H, s, H-12), 1.02 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 208.5 (C-3), 175.1 (C-5), 170.1 (C-1'), 135.1 (C-4), 74.1 (C-8), 72.8 (C-11), 51.6 (C-1), 49.0 (C-7), 41.5 (C-2), 39.8 (C-9), 33.9 (C-10), 29.0 (C-12), 28.1 (C-13), 25.7 (C-6), 23.0 (C-14), 21.8 (C-2'), 8.1 (C-15)。经波谱数据和文献[13]对照鉴定化合物8为8β-羟基-11-乙酰氧基-4-愈创木烯-3-酮。
化合物9 淡黄色油状物; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.42 (1H, m, H-8), 1.73 (3H, br. s, H-15), 1.42 (3H, s, H-13), 1.33 (3H, s, H-12), 1.03 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-14); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 208.7 (C-3), 176.4 (C-5), 134.6 (C-4), 73.6 (C-8), 70.8 (C-11), 52.0 (C-1), 48.9 (C-7), 44.0 (C-9), 41.5 (C-2), 33.7 (C-10), 29.4 (C-12), 28.9 (C-13), 24.4 (C-6), 23.2 (C-14), 8.1 (C-15)。经波谱数据和文献[13]对照鉴定化合物9为8β, 11-二羟基-4-愈创木烯-3-酮。
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