药学学报  2017, Vol. 52 Issue (7): 1133-1139   PDF    
3,6-二酰氨基吨酮衍生物的设计、合成及生物活性研究
李子谦, 冯腾垒, 曹婷婷, 赵泷, 周增辉, 申蕊, 马正月     
河北大学药学院, 河北省药物质量分析控制重点实验室, 河北 保定 071002
摘要: 本文报道了一类以G-四联体为靶点的新型3,6-二酰氨基吨酮衍生物的设计、合成及活性研究。分子对接显示该系列化合物均以π-π堆积和沟槽插入相结合的方式作用于人端粒G-四联体,且这一结合方式经荧光光谱与紫外光谱证实,并在荧光滴定中发现化合物10c10d对于四联体DNA具有较强的亲和力和选择性。随后经MTT法测试了筛选的化合物对三种人癌细胞株的体外抗增殖活性,其半数抑制率达到了微摩尔级。另外,PCR stop实验表明化合物10c10d能够有效抑制端粒酶的扩增能力。
关键词: 吨酮     G-四联体     分子对接     荧光光谱     细胞毒性    
Design, synthesis and biological activities of novel 3, 6-diamide xanthones
LI Zi-qian, FENG Teng-lei, CAO Ting-ting, ZHAO Long, ZHOU Zeng-hui, SHEN Rui, MA Zheng-yue     
Key Laboratory of Drug Quality Control of Hebei Province, College of Pharmaceutical Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China
Abstract: A series of novel xanthones with terminal amine substituents at xanthone's C3 and C6 positions were designed and synthesized as potential ligands for telomeric G-quadruplex DNA. All the compounds in this series were bound to telomeric G-quadruplex in a "thread intercalation" manner that illustrated both in molecular docking and spectrometric studies. Among them, 10c and 10d showed better binding abilities and specific affinity toward G-quadruplex DNA HTG21 over ctDNA in the fluorescence assay. The antiproliferative activities of four screened compounds were examined in three cancer cells by MTT in vitro, and their inhibitory effects were observed at low micromolar ranges. In addition, the PCR stop assay demonstrated that 10c and 10d effectively inhibited the amplification ability of telomerase.
Key words: xanthone     G-quadruplex DNA     molecular docking     fluorescence spectroscopy     cytotoxicity    

端粒长度的维持是肿瘤细胞得以永生的一个至关重要的原因[1]。在大多数人类癌细胞株中, 因细胞分裂而损失的碱基数量可以通过高活性的端粒酶或其他替代途径得到补充[2], 因而肿瘤细胞得以无限增殖, 而其他正常体细胞则不能[3]。在人端粒末端存在着大量串联重复的DNA序列: (TTAGGG)n。这一序列很容易在一价或二价阳离子的诱导下以Hoogsteen氢键形成一种叫做G-四联体的特殊DNA二级结构[4]。越来越多的研究指出, 促进G-四联体的形成能够抑制端粒酶的活性, 从而阻止端粒DNA的复制和延长, 能够达到诱导肿瘤细胞衰老和凋亡的目的[5]。作为潜在的抗癌药物治疗靶点, G-四联体在近十几年内吸引了大量研究者的关注[6]。构效关系研究表明, 适宜的芳香平面对于在小分子和四分体之间形成π-π堆积是很有用的[7]。对于含有芳杂环的新型药效团的研究一直是新型G-四联体配体开发中的一个重要领域[8]

天然吨酮衍生物主要存在于植物与真菌类中, 其优异的抗癌活性激励了很多研究者以不同的取代基对母核进行合成修饰[9]。本实验室之前的研究表明二取代吨酮具有很好的G-四联体结合能力[10]。在本课题的研究中, 继续选用吨酮母核作为具有芳香性的近平面结构的药效团, 并在其3, 6位以可质子化的末端氨基侧链修饰以增强与靶点的亲和力。运用分子对接来辅助该系列化合物的合理化设计[11]。对接结果显示该系列化合物的母核部分能够与四分体表面产生π-π堆积作用, 而末端氨基能够与HTG21的磷酸骨架产生静电作用。这一假设与荧光发射和紫外吸收实验相一致, 并且结合常数与猝灭常数的大小次序间存在着一定关联。化合物10c10d被确定为该系列最强效的G-四联体结合剂, 并具有高选择性。随后的MTT、AO/EB染色和PCR stop实验表明这些化合物具有良好的生物效应, 特别是10c10d的MTT IC50值低于对照品顺铂, 具有作为强效的抗癌先导物进一步开发的潜力。目标化合物的合成如合成路线1所示。

结果与讨论 1 化合物的合成

目标化合物的1H NMR、13C NMR、MS和元素分析等表征数据列于表 1

Table 1 The characterization data of 9a -9e, 10a -10e
2 分子对接

分子对接研究中的结合能数据列于表 2, 其中代表性化合物10c的结合构象列于图 1a (受体表面红色表明电负性区域)。研究中发现, 每个化合物的母核部分都可以对接到四分体表面上类似于10c的位置, 并且侧链都伸向1KF1的负电区。在图 1c中可以看到10a ~10e的母核对接位置相同, 只是侧链上末端氨基位置略有不同。这一结合方式与文献中所报道的“线型插入”方式相一致[12]。数据显示, 10a ~10e9a ~9e有更低的静电能与总结合能。在图 1b中可以看到, 10c9c的末端氨基更深入于1KF1沟槽中的负电区, 因此导致了更强的静电作用。

Table 2 The binding energy data and Ksv values of the ten compounds in the series. a: Binding energy = Vdw-hb-desolv energy + Electrostatic energy + Torsional energy

Figure 1 a: The putative binding conformation of 10c, the acceptor surface was colored by coulombic electrostatic potential (the surface with red color indicated electronegative region). b: The superimposed poses of 9c (orange) and10c (yellow). c: The superimposed poses of 10a (red), 10b (blue), 10c (yellow), 10d (cyan) and 10e (wheat)
3 光谱实验

荧光滴定的第一个阶段是用HTG21滴定该系列10个化合物。滴定过程中, 大多数化合物的荧光发射光谱表现出了明显的下降趋势, 只有9e呈现出轻微的上升趋势(图 2)。显然是由于化合物的末端氨基与HTG21的磷酸骨架间产生的静电作用导致了发射光谱的下降[13]。吗啉的碱性相对于其他胺较弱, 因此9e不能与受体间形成有效的静电作用。对于10e来说, 由于碳链加长使吗啉基处于易于形成静电的位置, 所以其光谱又呈现出了下降的趋势。这也反映出了对接计算上的一些缺陷, 因为所计算的结合能是基于化合物的最佳结合状态, 但某些情况下不具有代表性。

Figure 2 Fluorescent emission spectra of the ten compounds that titrated with HTG21. The arrow indicates the fluorescence changes upon increasing [Q] concentration. The inset is plot of F/F0 versus [Q]
(1)

以谱图中的最大发射波长λmax根据方程(1) 来绘制Stern-Volmer动态猝灭曲线。Kq是生物分子的猝灭常数, τ0是不存在猝灭剂时荧光体的荧光寿命, 约为10 ns, [Q]是猝灭剂浓度, Ksv是动态猝灭常数。Ksv值列于表 2。由于Ksv值反映了静电力大小, 可见丙酰氨基化合物形成静电的能力优于乙酰氨基化合物, 吡咯基或哌啶基化合物形成静电能力优于其他氨基化合物。

Scheme1 Synthesis of target compounds. Reagents and conditions: (i) Acetic anhydride/H2O, 80 ℃; (ii) Cu, K2CO3, DMF, 130 ℃; (iii) Concd. H2SO4, 70 ℃; (iv) Na2S·9H2O, 70 ℃; (v) Cl(CH2)nCOCl, CH2Cl2, rt; (vi) Corresponding secondary amine, NaI, C2H5OH, reflux

随后用ctDNA对化合物(9c9d10c10d)进行荧光滴定, 以考察这几个化合物对G-四联体和双螺旋DNA之间的选择性。如图 3所示, 这些化合物的荧光发射谱图只是随着滴定剂的加入出现了轻微减弱的趋势, 可能只是发生了较弱的表面结合。由于在两种滴定中, 所有的Kq值均远大于2.0×1010 mol-1·s-1, 因此所有的荧光猝灭类型均被认为是静态猝灭。再将这些谱图数据根据方程(2) 进行线性拟合以得到结合常数Ka和结合位点数(n)[14]。这4个化合物的拟合曲线数据在图 4图 5中, Ka值列于表 3。通过对比, 这些化合物对G-四联体的亲和力大大高于对双螺旋DNA的亲和力。根据曲线斜率来判断, 大多数配体与受体之间的结合比约为1:1, 只有9d与ctDNA的结合比可能为2:1。

Figure 3 Fluorescent emission spectra of 9c, 9d, 10c, 10d that titrated with ctDNA. The arrow indicates the fluorescence changes upon increasing [Q] concentration. The inset is plot of F/F0 versus [Q]

Figure 4 The linear fitting plots of log[(F0-F)/F] versus log[Q] of 9c, 9d, 10c, 10d that titrated with HTG21

Figure 5 The linear fitting plots of log[(F0-F)/F] versus log[Q] of 9c, 9d, 10c, 10d that titrated with ctDNA

Table 3 The binding constants Ka values of the compounds 9c, 9d, 10c, 10d
(2)

运用紫外滴定进一步研究化合物与受体之间的作用。用HTG21对化合物10c ~10d进行紫外滴定, 化合物的紫外吸收峰在208 nm处表现出了明显的减色效应(图 6)。这通常是由于芳香发色团与DNA碱基之间的堆积作用引起的。说明吨酮母核可以和四分体表面形成较强的π-π堆积作用[15-18]

Figure 6 Electronic absorption spectra of 10c (a) and 10d (b) that titrated with HTG21
4 MTT实验

将化合物(9c9d10c10d)进行MTT实验。短期细胞毒性的IC50值列于表 4。相比较而言, 10c10d的细胞毒性优于9c9d, 并且优于对照品顺铂。

Table 4 The IC50values of compounds 9c, 9d, 10c, 10d against several human human cancer cell lines
5 AO/EB染色实验

采用AO/EB双染法对化合物(9c9d10c10d)进行测试。如图 7所示, 随化合物浓度增大, 逐渐发生了核固缩、核破裂、过度膨胀和细胞变形等明显的细胞形态变化。这些现象说明这些化合物可以有效抑制细胞增殖。当10c10d的浓度达到40 μmol·L-1时, 几乎已观察不到活细胞。

Figure 7 The fluorescent microscopic observation of MGC803 cells treated with 9c, 9d, 10c, 10d (0-40 μmol·L-1)
6 PCR stop实验

采用PCR stop实验以研究化合物10c10d对端粒酶的抑制作用。银染的照片显示于图 8中。随化合物浓度增加, 条带颜色明显变淡, 这说明化合物在稳定了G-四联体结构后, 能有效抑制端粒酶的扩增能力。

Figure 8 The amplification inhibition effects of 10c, 10d (0-40 μmol·L-1) on HTG21 in PCR stop assays
7 小结

本课题合成了一系列新型吨酮衍生物, 运用分子对接和荧光滴定相结合的方法对该系列化合物进行了活性筛选。这一方法具有操作的简便性以及预测结果的可靠性。化合物10c10d表现出较强的G-四联体稳定作用以及抗癌活性, 具备进一步研究的价值。

实验部分

实验中所用化学品均为AR以上纯度, 购自天津市科密欧化学试剂有限公司和西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。Taq DNA聚合酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。所用寡核苷酸、引物和脱氧核苷三磷酸(dNTP)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。荧光光谱由F97 Pro型光谱仪测定。紫外光谱由UV-8500型光谱仪测定。1H NMR和13C NMR由Bruker AVANCE 600核磁共振仪(TMS为内标)测定。质谱由Bruker apex ultra (7.0T)傅立叶变换质谱仪测定。元素分析由Vario EL元素分析仪测定。MTT吸光度由Bio-Tek酶标仪测定。细胞形态观察通过Olympus荧光显微镜。聚合酶链反应(PCR)通过L96G/Y热循环仪进行。

1 化合物合成 1.1 化合物5的合成

按照文献[19]方法, 以原料23合成。产物粗品经硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯:三乙胺)分离。干燥后得橙黄色固体, 两步总收率45%。

1.2 化合物6的合成

取6.7 mmol化合物5、8.04 mmol Na2S·9H2O和纯化水50 mL加入到100 mL圆底烧瓶中。70 ℃反应5 h。冷却至室温, 减压抽滤, 用纯化水将滤饼冲洗至中性, 以TLC检测无杂点, 干燥后得到淡黄色固体, 收率89%。

1.3 化合物7 、8的合成[20]

取6.4 mmol化合物6于50 mL圆底烧瓶中, 分别加入氯乙酰氯或氯丙酰氯128 mmol, 二氯甲烷12 mL。室温反应3天。反应液倒入冰的5 mol·L-1碳酸氢钠溶液中, 调节pH至8。抽滤, TLC检测无杂点, 干燥后得淡黄色固体, 收率95%。

1.4 化合物9 、10的合成

取0.4 mmol化合物78、无水碘化钠0.15 g和无水乙醇10 mL。加热搅拌至回流, 缓慢滴加含1 mL相应二级胺的10 mL乙醇溶液。回流2 h。过滤后, 减压蒸干溶剂。剩余物经硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯:三乙胺, 体积比25:75:1) 分离。1H NMR、13C NMR、MS和元素分析等化合物表征数据列于表 1

2 分子对接

分子建模中使用了从人端粒DNA中得到的平行型G-四联体晶体结构(PDB NO. 1KF1)。受体和配体文件均通过AutoDock Tools 1.5.6来准备。对接计算是通过AutoDock 4.2.6来进行的, 所采用遗传算法的参数为:结合能评估最大次数25 000 000; GA运行最大次数100。选择对接结果中的最低结合能构象作为结合方式[21]。使用PyMOL和Chimera软件对结果作图。

3 光谱实验

荧光滴定实验是在25 ℃下操作的。光程1 cm, 狭缝宽度10 nm。待测溶液为含有5 μmol·L-1配体和100 μmol·L-1 KCl的Tris-HCl缓冲液(10 mmol·L-1, pH 7.4), 将预成型的G-四联体储液HTG21或ctDNA储液分别滴加入比色皿中, 使两种DNA的终浓度从0上升至10 μmol·L-1[22]。荧光实验的激发波长为320 nm, 发射波长为350~600 nm。

紫外滴定的波长范围是200~450 nm。样品池中的待测溶液含有0.5 μmol·L-1配体, 参比池中不含有配体, 缓冲体系与荧光滴定相同。分别滴加两种DNA, 使终浓度从0上升至1.2 μmol·L-1。测定值为样品值减去参比值。通过Origin 9.0来分析谱图数据。

4 MTT实验

按照文献方法使用标准MTT测试法[23]。将3种人癌细胞株MGC803、HeLa和A549以每孔5×103个的密度接种到96孔板中。过夜培养后, 将待测化合物与阳性对照顺铂加入到培养基中, 使终浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1。培养44 h后, 加入MTT再培养4 h。在490 nm下测定吸光度。每个实验以3个副孔重复3次。抑制率(%) = (1-A样品/ A对照)×100%。

5 AO/EB染色实验

将MGC803细胞以每毫升5×104个的密度接种到24孔板中。过夜培养后, 将待测化合物分别以1.25~40 μmol·L-1的终浓度加入到培养基中。培养24 h后, 加入AO/EB双染液(100 μg·mL-1 AO和100 μg·mL-1 EB)。通过荧光显微镜观察并照相。

6 PCR stop实验

用于扩增的引物为: HTG21 (5'-GGGTTAGGGT TAGGGTTAGGG-3')和RevHTG21 (5'-ATCGCTTCT CGTCCCTAACC-3')。反应体系中含有待测化合物(0~40 μmol·L-1)、HTG21 (0.4 μmol·L-1)、RevHTG21 (0.4 μmol·L-1)、Taq酶(1.25 U)、dNTPs (200 μmol·L-1)和1×Thermopol缓冲液。扩增条件为: 94 ℃ 3 min, 然后以94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s进行30个循环。对扩增产物进行银染后照相[24]

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