2017, Vol. 52
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室, 北京 100050
2. Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
高尿酸血症是体内嘌呤代谢紊乱造成的代谢性疾病, 主要表现为由于尿酸生成增多或排泄减少所致的血清尿酸浓度过高, 尿酸盐出现结晶化, 沉积在软组织或关节, 引起炎症反应, 继而诱发痛风[1]。持续的高尿酸水平可引起诸多并发症, 如肾炎、心脏病、慢性肾病等, 甚至会引起尿毒症、肾衰竭而导致死亡, 严重威胁人类的健康。因此, 控制血尿酸水平(正常人群维持在6 mg·dL-1以下, 严重痛风患者, 则应维持在5 mg·dL-1以下)是预防痛风及相关并发症的重要手段[2]。
黄嘌呤氧化酶(XO)是一种多功能的黄素蛋白酶, 可催化次黄嘌呤在钼喋呤中心氧化生成黄嘌呤, 进而生成尿酸, 是体内尿酸代谢的关键酶[3, 4]。抑制XO的活性能够有效减少尿酸的产生, 从而达到降低血尿酸水平的目的。
嘌呤类抑制剂别嘌呤醇是FDA于1966年批准上市的第一个XO抑制剂, 广泛用于痛风及高尿酸血症患者的临床治疗。但严重皮肤不良反应(severe cutaneous adverse reactions, SCARs)等药物超敏反应以及较高的使用剂量, 限制了它的临床应用[5, 6]。
非嘌呤类XO抑制剂非布索坦(febuxostat, 1)和托匹司他(topiroxostat, 2)分别于2009年和2013年经美国FDA批准上市, 用于慢性痛风的治疗。与嘌呤类抑制剂相比, 非嘌呤类XO抑制剂临床使用剂量低, 作用更为持久且具有较高的选择性[7]。此类抑制剂通过肝脏代谢, 可避免别嘌呤醇经肾脏排泄而引起的不良反应, 因此可用于对别嘌呤醇不耐受患者及肾病患者的治疗。非嘌呤类XO抑制剂在药效、安全性等方面的独特优势, 使其成为近年来的研究热点。
虽然1和2都作用于XO的黄嘌呤结合位点, 但它们的作用机制和结合模式却不相同[8]。1通过占据酶的疏水空腔来阻止钼蝶呤中心对底物的催化作用[9]; 2则在占据通往钼离子疏水通道的同时, 还与XO的钼离子形成Mo-O-C共价键[10]。为了充分探究非嘌呤类XO抑制剂的构效关系, 进一步扩充此类抑制剂的结构多样性, 本研究基于1和2设计了两个系列酰胺类化合物(图 1)。系列I在1的噻唑环与苯环之间插入酰胺键, 使化合物在有效地占据XO狭长的疏水空腔的同时, 向腔内进一步延伸, 期望噻唑羧酸部分与钼离子形成配位作用, 从而增强对XO的抑制活性。系列I中的化合物3a~3n主要考察了苯环上不同的R2、R3取代基对抑酶活性的影响, 化合物3o则探察了酰胺氮甲基化带来的分子构象变化对活性的影响。系列II参照2的结构, 将系列I中的取代苯环替换为取代吡啶环, 以进一步研究非嘌呤类XO抑制剂的构效关系。
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Figure 1 Molecular design of amide derivatives |
如路线1所示, 目标化合物3a~3n、3p~3r均由羧酸类化合物(4)和2-噻唑胺衍生物(5)在HATU [2-(1H-7-azabenzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate]及DIEA (N, N-diisopropylethylamine)催化下缩合, 并进一步水解得到。化合物4由3种不同途径获得(合成路线1): 4a~4j由4-羟基苯甲醛(7a~7i)或4-巯基苯甲醛(7j)经烷基化、高锰酸钾氧化两步反应得到; 4k、4l直接购得; 4m、4n参考文献方法[11], 分别由4k、4l在DMSO及氢溴酸作用下溴化得到。目标化合物3o由中间体6a经N-烷基化及水解得到。
结果与讨论 1 化合物3a~3r的结构确证采用上述合成路线共合成了18个酰胺类化合物, 全部结构均经1H NMR和HR-ESI-MS确证且未见文献报道, 其理化性质和谱学数据见表 1和表 2。
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Table 1 Physical data of compounds 3a-3r |
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Table 2 Spectral data of compounds 3a-3r |
在10 μmol·L-1浓度下, 测定了化合物3a~3r对XO的抑制活性。如表 3所示, 化合物3a、3f、3g、3i、3q和3r在测试浓度下对XO表现出一定的抑制作用。其中, 化合物3a对XO具有明显的抑制作用, 在10 μmol·L-1浓度下对XO的抑制率达到57.1%。
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Table 3 Inhibitory activity of selected compounds against XO. *The percentage inhibition was measured under the concentration of 10 μmol·L-1 |
化合物3a~3r的抑酶活性结果揭示了初步的构效关系。在系列I化合物中, 苯环上R2取代基对抑酶活性具有明显影响, 化合物的活性顺序为: -Br > -Cl > -F, -NO2 (3a vs 3e、3d、3f); 苯环上R3取代基对抑酶活性亦有一定的影响: R3为取代氨基或吗啉环对活性不利(3a vs 3m、3n), R3为硫醚取代时, 可能使活性降低(3a vs 3j); 酰胺氮甲基化后活性明显下降(3a vs 3o), 可能与氮甲基化带来的分子构象变化及分子形状变化有关。在系列II化合物中, 4-取代吡啶环的抑酶活性优于3-取代吡啶环(3p vs 3q、3r)。
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Scheme1 Synthesis of compounds 3 and 4. Reagents and conditions: a: HATU, DIEA, DMF, r.t.; b: NaOH, EtOH, 55 ℃, then 1 mol·L-1 aq. HCl; c: CH3I, NaH, r.t.; d: R3Br, K2CO3, KI, DMF, 80 ℃; e: KMnO4, DMF, H2O, r.t.; f): Hydrobromic acid, DMSO, ethyl acetate |
通过分子对接, 研究了非布索坦(1)、化合物3a与黄嘌呤氧化酶(PDB ID: 1N5X)作用模式的差异。如图 2a所示, 1的噻唑环可以与Phe914、Phe1009形成π-π相互作用, 噻唑环上的羧基能够与Arg880、Thr1010形成氢键相互作用, 噻唑环上的氮原子可与Glu802形成氢键相互作用, 与文献报道的关键相互作用一致[9]。化合物3a保持了噻唑环与Phe914、Phe1009的π-π相互作用以及羧基与Arg880的氢键相互作用, 并且酰胺键上的氮原子也与Glu802存在氢键相互作用(图 2b)。然而, 化合物3a在结合腔内占据的位置以及构象与非布索坦略有不同(图 2c)。在噻唑环和苯环之间插入酰胺键后, 3a中的噻唑羧酸部分并未如预期向腔内延伸, 进而与钼离子形成配位作用, 而是3a中噻唑环的取向发生了翻转, 导致羧基缺失了与Thr1010的氢键相互作用。因此, 化合物3a虽仍具有较好的XO抑制活性, 但其活性弱于非布索坦。近期, 亦有文献报道式I所示化合物具有显著的XO酶抑制活性[12], 并且高活性化合物与1在XO结合腔内的构象及相互作用模式一致, 羧基与Arg880、Thr1010的氢键相互作用得以保留, 提示R2及R3对此类化合物的活性构象及抑酶作用影响显著。
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Figure 2 The interaction modes of 1 and 3a suggested by docking study (Hydrogen bonding interactions are showed with dotted lines). a: Febuxostat (1); b: Compound 3a; c: Overlap of 1 and compound 3a |
根据非布索坦(1)和托匹司他(2)与黄嘌呤氧化酶的作用模式, 设计合成了18个结构新颖的酰胺类化合物, 并测定了它们对XO的抑制活性。其中, 6个化合物显示出一定的抑酶活性, 初步总结了此类化合物的构效关系, 并通过分子对接揭示了化合物3a与XO可能的作用模式, 为酰胺类XO抑制剂的进一步结构优化提供了参考。
实验部分熔点采用Fisher Scientific显微熔点仪测定, 温度未校正, 核磁氢谱采用Varian Mercury 400型核磁共振仪测定, TMS为内标。质谱采用LC/MDC-MS串联质谱仪(Thermo, USA)测定。柱色谱分离采用硅胶H (200~300目), 薄层色谱硅胶为烟台江友硅胶开发有限公司所产的HSGF 254型硅胶板。实验所用试剂为化学纯或分析纯, 购买后未作进一步处理, 直接使用。所用溶剂均为分析纯, 其中无水溶剂均经美国创新科技(Innovative Technology)所产的无水溶剂纯化系统除水后使用, 其他溶剂未特别指出则未经处理。
1 化合物的合成 1.1 3-溴4-异丁氧基苯甲醛的制备(8a)将3-溴-4-羟基苯甲醛(7a, 9.3 g, 47.5 mmol)溶于50 mL DMF中, 加入溴代异丁烷(13.0 g, 95 mmol)、碳酸钾(13.0 g, 95 mmol)、碘化钾(157.7 mg, 0.1 mmol), 80 ℃加热搅拌10 h。待反应完全后, 蒸除部分DMF, 残余物加入20 mL水, 乙酸乙酯萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥, 蒸除溶剂后柱色谱分离(石油醚-乙酸乙酯30:1) 得到无色液体8a, 收率: 95.2%。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.83 (s, 1H, CHO), 8.07 (d, J = 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.79 (dd, 1H, J = 8.4, 1.8 Hz, 1H, ArH), 6.97 (d, 1H, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 3.88 (d, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2CH), 2.16~2.05 (m, 1H, OCH2CH), 1.09 (d, J = 6.6 Hz, 6H, CH(CH3)2); HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C11H14BrO2 [M+H]+ 257.017 2, Found 257.016 5。
采用类似方法合成了8b~8j。
1.2 3-溴4-异丁基苯甲酸的制备(4a)将8a (9.0 g, 35 mmol)溶于30 mL DMF中, 将KMnO4 (10.0 g, 60 mmol)溶于10 mL水中。冰浴下将高锰酸钾水溶液缓慢滴入到8a的DMF溶液中, 室温反应12 h。反应后用加硅藻土的漏斗过滤掉反应残渣, 滤液浓缩后, 加入1 mol·L-1 NaOH溶液溶解浓缩后的固体, 加入少量乙酸乙酯萃取, 水相加入1 mol·L-1 HCl调节pH至4~5, 有大量白色固体析出, 过滤干燥后得到白色固体4a, 收率: 86.3%。mp: 178~180 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.96 (s, 1H, ArH), 7.74 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 6.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H, ArH), 3.79 (d, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2CH), 2.13~1.94 (m, 1H, OCH2CH), 0.99 (d, J = 6.8 Hz, 6H, CH(CH3)2); HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C11H14BrO3 [M+H]+ 273.012 1, Found 273.011 1。
采用类似方法合成了4b~4j。
1.3 3-溴4-二甲氨基苯甲酸的制备(4m)将4k (666.0 mg, 4 mmol)溶于10 mL乙酸乙酯中, 加入氢溴酸(971.0 mg, 5.8 mmol)、DMSO (937.0 mg, 12 mmol), 60 ℃下加热搅拌24 h。待反应完全后, 蒸除溶剂, 乙酸乙酯萃取, 有机相用无水硫酸钠干燥, 蒸除乙酸乙酯后柱色谱分离(石油醚-乙酸乙酯10:1) 得到白色固体4m, 收率: 51%。mp: 172~174 ℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.28 (d, J = 1.2 Hz, 1H, ArH), 7.97 (dd, J = 8.6, 1.2 Hz, 1H, ArH), 7.08 (d, J = 8.6 Hz, 1H, ArH), 2.94 (s, 6H, N(CH3)2); HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C9H11BrNO2[M+H]+243.996 8, Found 243.996 0。
采用类似方法合成了4n。
1.4 2-(3-溴4-异丁基苯甲酰氨基)-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯的制备(6a)将4a (1.1 g, 4 mmol)、HATU (1.6 g, 4.2 mmol)、DIEA (780 mg, 6 mmol)溶于15 mL DMF中, 室温搅拌反应30 min, 然后加入2-氨基-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯(745.0 mg, 4 mmol), 室温反应12 h。反应结束后, 蒸除大部分DMF, 乙酸乙酯萃取, 有机相分别用1 mol·L-1 HCl、10% NaHCO3、饱和食盐水洗后柱色谱分离(石油醚-乙酸乙酯10:1), 得白色固体6a, 收率: 53.4%。mp: 200~202 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.92 (brs, 1H, CONH), 8.38 (d, J = 2.0 Hz, 1H, ArH), 8.13 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 7.25 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.95 (d, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2CH), 2.59 (s, 3H, CH3), 2.14~2.02 (m, 1H, OCH2CH), 1.30 (t, J = 7.2 Hz, 3H, OCH2CH3), 1.02 (d, J = 6.8 Hz, 6H, CH(CH3)2); HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H22BrN2O4S [M+H]+441.047 8, Found 441.048 2。
采用类似方法合成了6b~6n、6p~6r。
6b:1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.16 (s, 1H, ArH), 7.86 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 7.45 (dd, J = 7.6, 5.6 Hz, 2H, ArH), 7.11 (t, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 7.02 (d, J = 8.8 Hz, 1H, ArH), 5.20 (s, 2H, CH2), 4.34 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.59 (s, 3H, CH3), 1.38 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 235~237 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C21H19BrFN2O4S [M+H]+493.022 7, Found 493.021 5。
6c:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.91 (s, 1H, CONH), 8.36 (s, 1H, ArH), 8.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H, ArH), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H, ArH), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.96 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH2), 2.57 (s, 3H, CH3), 1.87~1.59 (m, 6H, cyclohexyl-H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3), 1.25~0.98 (m, 5H, cyclohexyl-H); mp: 191~193 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C21H26BrN2O4S [M+H]+481.079 1, Found 481.077 5。
6d:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.90 (s, 1H, CONH), 8.04~7.91 (m, 2H, ArH), 7.31 (t, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.92 (d, J = 6.8 Hz, 2H, OCH2CH), 2.58 (s, 3H, CH3), 2.05~2.02 (m, 1H, OCH2CH), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3), 0.98 (d, J = 6.8 Hz, 6H, CH(CH3)2); mp: 179~181 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H22FN2O4S [M+H]+381.127 9, Found 381.127 0。
6e:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.89 (s, 1H, CONH), 8.21 (s, 1H, ArH), 8.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.93 (d, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2CH), 2.57 (s, 3H, CH3), 2.10~2.03 (m, 1H, OCH2CH), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3), 0.99 (d, J = 6.4 Hz, 6H, CH(CH3)2); mp: 193~195 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H22ClN2O4S [M+H]+397.098 3, Found 397.096 9。
6f: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 13.16 (s, 1H, CONH), 8.69 (d, J = 1.5 Hz, 1H, ArH), 8.38 (dd, J = 9.0, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.53 (d, J = 9.0 Hz, 1H, ArH), 4.27 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 4.06 (d, J = 6.0 Hz, 2H, OCH2CH), 2.60 (s, 3H, CH3), 2.14~2.00 (m, 1H, OCH2CH), 1.30 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3), 1.00 (d, J = 6.5 Hz, 6H, CH(CH3)2); mp: 201~203 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H22N3O6S [M+H]+408.122 4, Found 408.121 5。
6g:1H NMR (500 MHz, DMSO): δ 12.98 (s, 1H, CONH), 8.62 (s, 1H, ArH), 8.35 (dd, J = 9.0, 1.0 Hz, 1H, ArH), 7.55 (d, J = 9.0 Hz, 1H, ArH), 4.97 (dt, J = 12.0, 6.0 Hz, 1H, CH(CH3)2), 4.25 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.58 (s, 3H, CH3), 1.34 (d, J = 6.0 Hz, 6H, CH(CH3)2), 1.30 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 183~185 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C17H20N3O6S [M+H]+394.106 7, Found 394.106 4。
6j:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.92 (s, 1H, CONH), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.95 (d, J = 6.8 Hz, 2H, SCH2), 2.58 (s, 3H, CH3), 1.89~1.77 (m, 1H, SCH2CH), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3), 1.00 (d, J = 6.8 Hz, 6H, CH(CH3)2); mp: 178~180 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H23N2O3S2[M+H]+379.114 5, Found 379.113 3。
6k: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.52 (s, 1H, CONH), 7.99 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 4.23 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.00 (s, 6H, N(CH3)2), 2.56 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 241~243 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C16H20N3O3S [M+H]+334.122 0, Found 334.120 9。
6l: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.64 (s, 1H, CONH), 8.01 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 4.23 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.72~3.70 (m, 4H, morpholino-H), 3.29~3.27 (m, 4H, morpholino-H), 2.57 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 202~204 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H22N3O4S [M+H]+376.132 6, Found 376.131 4。
6m:1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.90 (s, 1H, CONH), 8.32 (s, 1H, ArH), 8.05 (d, J = 8.6 Hz, 1H, ArH), 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H, ArH), 4.24 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.83 (s, 6H, N(CH3)2), 2.57 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 225~227 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C16H19BrN3O3S [M+H]+412.032 5, Found 412.031 4。
6n: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.94 (m, 1H, CONH), 8.35 (s, 1H, ArH), 8.09 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 4.23 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.78~3.71 (m, 4H, morpholino-H), 3.08~3.02 (m, 4H, morpholino-H), 2.56 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 220~222 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C18H21BrN3O4S [M+H]+454.043 1, Found 454.042 4。
6p: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.11 (s, 1H, CONH), 9.09 (s, 1H, ArH), 8.29 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH), 4.25 (q, J = 6.8 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.58 (s, 3H, CH3), 2.54 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 6.8 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 210~212 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C14H16N3O3S [M+H]+306.090 7, Found306.089 6。
6q: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.30 (s, 1H, CONH), 8.85 (d, J = 5.6 Hz, 1H, ArH), 8.24 (s, 1H, ArH), 8.15 (d, J = 5.2 Hz, 1H, ArH), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.74 (s, 3H, CH3), 2.58 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 190~192 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C14H16N3O3S [M+H]+306.090 7, Found 306.089 8。
6r: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.34 (s, 1H, CONH), 8.62 (d, J = 4.8 Hz, 1H, ArH), 8.09 (s, 1H, ArH), 7.95 (d, J = 5.2 Hz, 1H, ArH), 4.25 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.58 (s, 3H, CH3), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH2CH3); mp: 220~222 ℃; HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C13H13ClN3O3S [M+H]+326.036 1, Found 326.034 7。
1.5 2-(3-溴4-异丁基-N-甲基苯甲酰氨基)-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯的制备(6o)将6a (100.0 mg, 0.2 mmol)溶于DMF中, 加入氢化钠(28.0 mg, 0.7 mmol), 室温搅拌10 min后加入碘甲烷(0.05 mL, 0.7 mmol), 室温搅拌3 h。待完全反应后, 乙酸乙酯萃取, 依次用饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗, 无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂, 加入乙酸乙酯, 有不溶于乙酸乙酯的固体析出, 过滤, 少量乙酸乙酯洗, 得到白色固体6o, 收率: 30%。mp: 208~210 ℃; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.34 (s, 1H, ArH), 8.16 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H, ArH), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 2H, OCH2CH3), 3.91 (d, J = 6.4 Hz, 2H, OCH2CH), 3.80 (s, 3H, NCH3), 2.67 (s, 3H, CH3), 2.15~2.02 (m, 1H, OCH2CH), 1.28 (t, J = 6.8 Hz, 3H, OCH2CH3), 1.01 (d, J = 6.8 Hz, 6H, OCH2CH(CH3)2); HR-MS (ESI) m/z: Calcd. for C19H24BrN2O4S [M+H]+455.063 5, Found 455.062 5。
1.6 2-(3-溴4-异丁基苯甲酰氨基)-4-甲基噻唑-5-甲酸的制备(3a)将6a (50.0 mg, 0.1 mmol)溶于6 mL乙醇水混合溶剂(EtOH-H2O 2:1) 中, 加入NaOH (80.0 mg, 2 mmol), 55 ℃下反应2 h。TLC监测反应完全后, 蒸除乙醇, 加水稀释, 用少量二氯甲烷萃取, 分离出水相, 用1 mol·L-1 HCl调节pH至4左右, 有大量白色固体析出, 过滤干燥得到白色粉末状固体3a。
采用类似方法合成了3b~3r。化合物3a~3r的理化性质和谱学数据见表 1和2。
2 分子模拟实验分子对接采用Accelrys公司的Discovery Studio 2016程序, 所使用的蛋白质晶体结构的PDB编号为1N5X。采用Small Molecules模块下的Diverse Conformation enumeration产生构象, Conformation Method设置为“BEST”, 其他参数采用缺省值; 利用Receptor-Ligand Interactions模块下的Dock ligands (Libdock)程序进行分子对接, Input Receptor: 1N5X, 其他参数采用缺省值。采用PYMOL 1.5.0.3软件作图。
3 XO体外抑酶活性实验样品溶解于DMSO中, 配制成10 mmol·L-1储备液。在37 ℃、pH 7.4下, 采用96孔板测定各化合物对XOD-催化黄嘌呤(XAN)水解作用的影响。反应体系中含10 μmol·L-1的化合物(终浓度)、3 U·L-1 XOD (对照组不加, 以0.01% DMSO代替), 及缓冲液(3.5 mmol·L-1 KH2PO4、15.2 mmol·L-1 K2HPO4、0.25 mmol·L-1 EDTA及50 μmol·L-1XAN, pH 7.4)。采用分光光度计检测293 nm波长下产物尿酸的吸收, 测定XOD-催化的黄嘌呤(XAN)水解作用, 依据OD值计算抑制率。
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