2017, Vol. 52
2. 重庆桑禾动物药业有限公司, 重庆 401519
2. Chongqing Honoroad Animal Health Co. Ltd, Chongqing 401519, China
玛咖为十字花科独行菜属一年生或两年生草本植物Lepidium meyenii Walp.的根茎, 原产于秘鲁的安第斯山区, 被当地土著人用作蔬菜和保健药物。现代药理学研究证明, 玛咖具有改善性功能、提高生育能力、增强免疫力、抗疲劳、预防骨质疏松、改善更年期综合征等多种功效[1-5], 很快被国际主流社会广泛接受, 其消费量大增。因原产地的玛咖产量远远不能满足市场需求, 世界粮农组织建议推广种植玛咖, 美国、日本、欧洲等国都有引种[6]。我国也在云南、吉林、新疆、西藏等地引种了玛咖[7-10]。但目前对我国产玛咖的药理作用尚缺乏深入的研究, 其能否替代秘鲁产玛咖尚未可知, 故急需对国产玛咖进行质量评价。但玛咖的有效成分至今尚未阐明, 成为玛咖质量评价的障碍。本课题组采用活性导向的成分分离法, 研究玛咖的化学成分, 意在阐明玛咖的药效成分。
彭璐等[11]发现, 云南产玛咖的乙醇提取物对维甲酸致大鼠骨质疏松有较好的预防作用。本课题组则发现, 给维甲酸所致骨质疏松小鼠灌胃云南鹤庆产黄玛咖正丁醇提取物39.52 mg·kg-1一个月, 可明显改善模型小鼠的骨质疏松症状, 包括增加模型动物的股骨长度和股骨干重至正常对照水平, 骨磷含量也恢复至正常对照水平, 且逆转模型动物的骨显微结构破坏, 使骨小梁数量增加至接近正常水平。本文对该玛咖正丁醇萃取物进行了化学成分研究, 拟为确定玛咖的抗骨质疏松有效成分提供筛选试样, 也为评价玛咖质量提供含量测定的对照品。最终, 从鹤庆产黄玛咖的正丁醇提取物中分离得到7个化合物, 分别鉴定为macaolidine (1)、色氨酸(2)、胡萝卜苷(3)、(3S)-1, 2, 3, 4-四氢-β-卡波林-3-羧酸(4)、绿原酸(5)、木犀草素(6)和金丝桃苷(7) (图 1)。化合物1为一个新的酰胺类生物碱, 化合物4~7均为首次从该植物中分离。
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Figure 1 Structures of compounds 1-7 |
化合物1 白色无定形结晶粉末。UV λmaxMeOH(nm): 250、282。IR νKBr (cm-1): 3 329、3 327、3 076、3 047、2 918、2 845、1 647、1 587、1 527、1 411.89、1 367、1 242、1 010、694; HR-ESI-MS: m/z 409.226 1 [M+H]+ (计算值409.219 5), 分子式为C23H28N4O3, 有11个不饱和度。IR光谱显示, 分子结构中存在-CONH-(3 329、3 327、1 647、1 527、1 242 cm-1), 结合1H NMR谱中的氨基氢信号δH 8.57 (1H, brs)及13C NMR谱中的羰基碳信号δC 172.4和169.8, 推测1含有两种酰胺基。1H NMR谱中的5个芳香质子信号δH 7.33~7.21 (5H, m, H-Ph), 结合13C NMR谱中的4个芳香碳信号δC 140.0、128.7、127.6、127.1, 提示该化合物含单取代苯环。根据其1H NMR谱、13C NMR谱信号数目和分子量、不饱和度, 推断该化合物为对称结构。HMBC谱(图 2)中, 亚甲基质子信号δH 4.26 (2H, d, J = 6.0 Hz)与芳碳信号δC 127.6 (C-3', 7')、140.0 (C-2')及羰基碳信号δC 172.4 (C-1) 有远程相关, 表明分子结构中有N-苄基酰胺片段。HSQC谱中, δH 1.98~1.89 (1H, m)和δH 1.89~1.81 (1H, m)均与δC 27.7相关, 表明有一个与手性C相连的-CH2-; 由HMBC谱中的相关峰δH 2.32 (2H, t, J = 7.5 Hz)/δC 27.7、δH 3.16 (1H, t, J = 6.5 Hz)/δC 27.7、δH 1.98~1.89/δC 32.5、δH 1.89~1.81/δC 32.5、δH 1.98~1.89/δC 54.2、δH 1.89~1.81/ δC 54.2, 结合HSQC相关峰δH 2.32/ δC 32.5、δH 3.16/ δC 54.2, 推断1含有-CH2-CH2-CH-片段。HMBC相关峰δH 2.32/δC 172.4提示, -CH2-CH2-CH-片段的亚甲基侧与N-苄基酰胺片段的羰基相连; δH 3.16和δC 169.8的远程相关表明, -CH2-CH2-CH-片段的次甲基侧与另一-NH-CO-的胺基相连。根据13C NMR谱中δC 172.4和δC 169.8的信号强度差异推测, 172.4 ppm处的酰胺基有2个, 而169.8 ppm处的酰胺基只有1个。分子还剩1个不饱和度, 故1还应含有1个环, 应为两个对称的-CH2-CH2-CH-片段通过次甲基相连, 构成2-咪唑烷酮。综上所述, 确定化合物1为一个新的酰胺类生物碱化合物(图 1), 命名为macaolidine。
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Figure 2 Key HMBC of compound 1 |
Bruker AVANCE Ⅲ-400 MHz核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司); Xevo G2-S Qtof型质谱仪(美国Waters公司); 岛津LC-20AD型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); 岛津Prestige-21型红外光谱仪(日本Shimadzu公司); UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。
柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)、薄层色谱硅胶GF254 (青岛海洋化工厂); C18键合硅胶(50 µm, 加拿大SiliCycle公司); MCI大孔吸附树脂(日本三菱化学株式会社); Sephadex LH-20 (上海玉博生物科技有限公司)。高效液相色谱及质谱仪分析使用试剂为色谱纯, 其他均为分析纯。
鹤庆产黄玛咖于2014年10月购自云南, 经西南大学药学院中药教研室邓君博士鉴定为十字花科独行菜属植物玛咖Lepidium meyenii Walp.的根及根茎。标本(标本号: No.141023) 保存于西南大学药学院中药教研室。
1 提取与分离干燥玛咖根茎5.0 kg粉粹后, 用95%乙醇室温浸泡提取3次, 每次24 h, 其间不时搅拌。合并提取液, 减压浓缩得浸膏612 g, 加适量水混悬, 依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取3次, 合并各部分萃取液, 减压回收溶剂, 得到石油醚部位97 g、乙酸乙酯部位35 g、正丁醇部位43 g。
正丁醇萃取物经MCI大孔树脂柱色谱, 依次用水、30% EtOH、50% EtOH、70% EtOH、95% EtOH梯度洗脱, 各洗脱部分蒸干, 得到5个流份(Fr.A~Fr.E)。Fr.B用少量甲醇溶解, 硅胶拌匀, 水浴蒸干后研细, 上硅胶(含20%水)柱色谱, 氯仿-甲醇(10:1~1:1) 梯度洗脱, 得到7个流分(Fr.B1~7), Fr.B2用反相半制备HPLC纯化, 甲醇-水(30:70) 洗脱, 重结晶得化合物1 (12 mg); Fr.B3经硅胶柱色谱, 氯仿-甲醇(9:1~1:1) 梯度洗脱得化合物2 (12 mg)、3 (15 mg); Fr.B4经C18键合硅胶柱色谱(甲醇-水20:80洗脱)得化合物4 (6 mg); Fr.D依次经Sephadex LH-20柱色谱(甲醇洗脱)、C18键合硅胶柱色谱(甲醇-水, 20:80~50:50梯度洗脱), 得到化合物5 (18 mg)、6 (14 mg)和7 (21 mg)。
2 结构鉴定化合物1 白色无定形结晶粉末。HR-ESI-MS: m/z 409.226 1 [M+H]+(计算值409.219 5), 分子式为C23H28N4O3。UV λmaxMeOH(nm): 250、282。IR νKBr (cm-1): 3 329、3 327、3 076、3 047、2 918、2 845、1 647、1 587、1 527、1 411.89、1 367、1 242、1 010、694。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)和13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)见表 1。
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Table 1 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) and 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) of compound 1 (δ, J in Hz) |
化合物2 白色粉末, 分子式为C11H12N2O2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.99 (1H, brs, -NH), 7.57 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.35 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7), 7.23 (1H, s, H-2), 7.06 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 6.97 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-5), 3.46 (1H, dd, J = 8.0, 4.0 Hz, -CH), 3.31 (1H, dd, J = 15.0, 4.0 Hz, -CH2), 2.98 (1H, dd, J = 16.0, 9.0 Hz, -CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 124.5 (C-2), 110.0 (C-3), 127.7 (C-3a), 118.8 (C-4), 118.7 (C-5), 121.3 (C-6), 111.7 (C-7), 136.8 (C-7a), 55.2 (-CH), 27.5 (-CH2), 170.5 (-COOH)。以上数据与文献报道色氨酸的波谱数据[12]基本一致, 故鉴定该化合物为色氨酸。
化合物3 白色粉末。该化合物在TLC上喷洒10%硫酸-乙醇溶液显紫红色, Liebermann-Burchard反应呈阳性, Molish反应呈阳性, 提示该化合物为甾体苷类化合物, 经与胡萝卜苷对照品进行TLC比较, Rf值和显色相同, 故鉴定该化合物为胡萝卜苷。
化合物4 白色粉末。ESI-MS: m/z 217 [M+H]+, 分子式为C12H12N2O2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.91 (1H, brs, 9-NH), 7.45 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8), 7.08 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-7), 6.99 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 4.21 (2H, dd, J = 15.5, 22.5 Hz, H-1), 3.63 (1H, dd, J = 10.5, 5.0 Hz, H-3), 3.16 (1H, dd, J = 16.0, 5.0 Hz, H-4α), 2.82 (1H, dd, J = 16.0, 10.5 Hz, H-4β); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 40.9 (C-1), 128.2 (C-1a), 57.1 (C-3), 23.4 (C-4), 107.1 (C-4a), 118.2 (C-5), 126.7 (C-5a), 119.2 (C-6), 121.7 (C-7), 111.6 (C-8), 136.7 (C-8a), 169.9 (-COOH)。以上数据与文献报道(3S)-1, 2, 3, 4-四氢-β-卡波林-3-羧酸的波谱数据[13]基本一致, 故鉴定该化合物为(3S)-1, 2, 3, 4-四氢-β-卡波林-3-羧酸。δ 3.63 (H-3) 的H信号的耦合常数表明H-3为直立键, 即-COOH位于平伏键。H-4的两组信号(δ 3.16和δ 2.82) 的耦合常数也支持H-3为直立氢。
化合物5 白色粉末, 分子式为C16H18O9。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.46 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7'), 6.95 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.85 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6'), 6.68 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 6.16 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8'), 5.23 (1H, td, J = 9.0, 4.5 Hz, H-5), 4.07 (1H, m, H-3), 3.63 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz, H-4), 1.92~2.15 (4H, m, H-2, 6); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ:74.7 (C-1), 37.4 (C-2), 72.1 (C-3), 70.5 (C-4), 69.9 (C-5), 36.8 (C-6), 175.6 (C-7), 126.4 (C-1'), 113.9 (C-2'), 145.3 (C-3'), 148.1 (C-4'), 115.0 (C-5'), 121.5 (C-6'), 145.6 (C-7'), 113.8 (C-8'), 167.2 (C-9')。以上波谱数据与文献报道绿原酸的波谱数据[14]基本一致, 故鉴定该化合物为绿原酸。
化合物6 黄色粉末, 分子式为C15H10O6。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.98 (1H, s, 5-OH), 10.66 (1H, s, 7-OH), 9.73 (1H, s, 4'-OH), 7.95 (1H, s, 3'-OH), 7.43 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6'), 7.41 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.90 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 6.67 (1H, s, H-3), 6.45 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 164.3 (C-2), 103.4 (C-3), 182.0 (C-4), 161.8 (C-5), 99.4 (C-6), 164.5 (C-7), 94.2 (C-8), 157.6 (C-9), 104.2 (C-10), 121.9 (C-1'), 113.7 (C-2'), 146.2 (C-3'), 150.1 (C-4'), 116.4 (C-5'), 119.4 (C-6')。以上波谱数据与文献报道的木犀草素的波谱数据[15]基本一致, 故鉴定该化合物为3', 4', 5, 7-四羟黄酮, 即木犀草素。
化合物7 黄色粉末, 分子式为C21H20O12。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.63 (1H, s, 5-OH), 10.85 (1H, s, 7-OH), 9.72 (1H, s, 4'-OH), 9.14 (1H, s, 3'-OH), 7.68 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6'), 7.53 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 6.83 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 6.41 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.20 (1H, s, J = 2.0 Hz, H-6), 5.39 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1"), 5.13 (1H, d, J = 4.5 Hz, 2"-OH), 4.85 (1H, d, J = 5.5 Hz, 3"-OH), 4.44 (1H, s, 4"-OH), 3.28~3.65 (4H, m, H-2", H-3", H-4", H-5"); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ:156.2 (C-2), 133.9 (C-3), 177.9 (C-4), 161.2 (C-5), 99.1 (C-6), 164.5 (C-7), 93.9 (C-8), 156.2 (C-9), 104.3 (C-10), 121.5 (C-1'), 115.6 (C-2'), 145.2 (C-3'), 148.9 (C-4'), 116.4 (C-5'), 122.4 (C-6'), 102.3 (C-1"), 68.3 (C-2"), 73.6 (C-3"), 71.6 (C-4"), 76.2 (C-5"), 60.6 (C-6")。以上波谱数据与文献报道槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷的波谱数据[16]基本一致, 故鉴定该化合物为槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷, 即金丝桃苷。
3 讨论细胞水平实验显示, 绿原酸可降低骨髓间充质干细胞来源的软骨样细胞在缺氧环境下的凋亡[17]; 且绿原酸表现出调控成骨细胞增殖和分化的能力, 通过促进骨基质的形成和钙化来促进新骨成熟, 具有一定的成骨活性[18]。Lin等[19]发现金丝桃苷通过BMP和Wnt/β-catenin信号通路共同促进成骨细胞MC3T3-E1的碱性磷酸酶的活性和细胞矿化结节的表达, 并且具有剂量依耐性。因为绿原酸(化合物5)和金丝桃苷(化合物7)在鹤庆产黄玛咖的正丁醇部位含量较高, 故依据文献推测, 绿原酸和金丝桃苷可能是鹤庆产黄玛咖的抗骨质疏松活性成分。至于黄玛咖是否还含有别的抗骨质疏松活性成分, 本实验室正拟测试本文报道的其他几个化合物对破骨细胞和成骨细胞的作用, 以期阐明玛咖抗骨质疏松的物质基础和作用机制。
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