2016, Vol. 52
表1(Table 1)
靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药研究进展
引用本文
WANG Hong, FANG Yan-fen, ZHANG Xiong-wen. Progress in research of novel anticancer drugs targeting Hedgehog signaling pathway[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2016, 52(6): 848-858. 
王鸿, 方艳芬, 章雄文. 靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药研究进展[J]. 药学学报, 2016, 52(6): 848-858.
靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药研究进展
上海分子治疗与新药创制工程技术研究中心, 华东师范大学化学与分子工程学院, 上海 200062
摘要:
Hedgehog信号通路在哺乳动物的胚胎发育过程中发挥关键作用，但在成年组织中处于抑制状态。异常激活的Hedgehog信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，近年来Hedgehog信号通路成为治疗肿瘤的热门靶标。目前已有两种Hedgehog抑制剂（维莫德吉和索尼吉步）上市用于治疗肿瘤，但上市的药物很快出现严重的毒副作用和耐药问题。研究者研发出taladegib、NVP-LEQ506和MRT-92等新型Smo抑制剂以克服维莫德吉的耐药问题，并针对Smo上游Shh配体和下游蛋白Gli蛋白设计相应抑制剂以解决毒副作用问题。同时，目前上市的Hedgehog抑制剂仅用于治疗基底细胞癌，而对其他肿瘤的治疗也在进一步的研究中。现就靶向Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药的研发及其治疗不同肿瘤的研究进展进行综述。
关键词:
Hedgehog
耐药
不良反应
抗肿瘤
Progress in research of novel anticancer drugs targeting Hedgehog signaling pathway
Shanghai Engineering Research Center of Molecular Therapeutics and New Drug Development, College of Chemistry and Molecular Engineering, East China Normal University, Shanghai 200062, China
Abstract:
The Hedgehog signaling pathway plays a key role in mammalian embryogenesis, while it is quiescent in adult tissues. The aberrant activation of Hedgehog signaling pathway has been linked to multiple types of malignant tumors, which makes it an attractive target for cancer therapy in recent years. Up to now, two Hedgehog inhibitors (vismodegib and sonidegib) have been proved by FDA for the treatment of tumors. However, drug resistance and severe adverse reactions represent the problems in their clinical application. Novel inhibitors targeting Smo, such as taladegib, NVP-LEQ506, MRT-92, and downstream or upstream of Smo receptor such as Shh ligand and Gli have been developed to overcome the drug resistance and adverse reactions. The current Hedgehog inhibitors are used for treatment of basal cell carcinoma only, while many ongoing clinical trials are conducted to investigate the antitumor effect of Hedgehog inhibitors in other malignancies. Here we reviewed the research progress of the new anticancer drugs targeting the Hedgehog signaling pathway and their prospect in variety of cancers therapy.
Key words:
Hedgehog
drug resistance
adverse reaction
antitumor
Hedgehog基因最早在1980年由Nusslein Volhard和Wieschaus从果蝇中发现, 该基因突变会导致果蝇胚胎表面出现许多刺突, 形似刺猬而得名[1]。Hedgehog信号通路各成分在进化中高度保守, 哺乳动物中也有该信号通路对应的蛋白。Hedgehog信号通路在哺乳动物的发育过程中起至关重要的作用, 它参与调控细胞的增殖、生存和分化[2], 负责神经管、中轴骨、头发及牙齿的形成[3-5]。Hedgehog信号通路异常会引起胚胎神经管无法闭合, 造成胚胎死亡。Hedgehog基因在大多数成年组织中都处于抑制状态, 仅参与部分组织的维持和修复, 但在基底细胞癌、髓母细胞瘤及乳腺癌等多种恶性肿瘤中异常活跃。异常激活的Hedgehog信号通路与肿瘤的发生发展有着密切联系, 会通过Hedgehog配体依赖性机制或非配体依赖性机制调控肿瘤的发生发展, 因此也成为热门的抗肿瘤药物研发靶标。目前对Hedgehog信号通路的研究已取得巨大进展, 出现了许多靶向该信号通路的抗肿瘤药物。其中研发最成功的两个Hedgehog信号通路抑制剂(维莫德吉和索尼吉步)已经上市用于治疗晚期基底细胞癌。而随着研究的深入, 上市的Hedgehog抑制剂出现了单一靶点抗肿瘤药物常见的耐药性和毒副作用问题。为此, 研究者研发出如MRT-92、taladegib和NVP-LEQ506等许多新型的Hedgehog信号通路抑制剂以克服上述问题。而相对于Hedgehog信号通路相关肿瘤的多样性, 现已上市的Hedgehog抑制剂治疗的肿瘤却非常单一, 仅用于治疗基底细胞癌。因此Hedgehog信号通路抑制剂对其他相关肿瘤的治疗具有广阔发展前景, 现在用其治疗其他肿瘤的研究也在如火如荼地进行中。本文将简单介绍Hedgehog信号通路, 并围绕近年来针对Hedgehog信号通路的抗肿瘤新药的研发以及其对不同肿瘤的研究作一综述, 为靶向Hedgehog抗肿瘤新药的研发提供参考。
1 Hedgehog信号通路 1.1 经典Hedgehog信号通路哺乳动物经典Hedgehog信号通路的核心组成部分有Hedgehog的3种配体Sonic Hedgehog (Shh)、Indian Hedgehog (Ihh)和Desert Hedgehog (Dhh)[6], 12次跨膜受体蛋白Patched 1和Patched 2 (Ptch1、Ptch2), G蛋白偶联受体样蛋白Smoothened (Smo), 还有核转录因子蛋白Gli (Gli1、Gli2和Gli3)。当缺少Hedgehog配体时, Ptch阻止Smo进入纤毛并抑制其活性, 使Gli被多种激酶作用而失去转录活性, Hedgehog信号通路被抑制。当Hedgehog配体与Ptch结合后, 会解除Ptch对Smo的抑制作用, 使Smo移位到纤毛上, 发生构象转变并被磷酸化, 调控Gli进入细胞核并启动下游Gli1、Ptch1以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等基因的表达, 从而激活Hedgehog信号通路(图 1)。
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Figure 1 Schematic of the canonical Hedgehog signaling pathway. A: When the Hedgehog ligand (Hh) is absent, Patched (Ptch) inhibits the activation of Smoothened (Smo) and Glioma-associated oncogene homolog (Gli) is suppressed by a protein complex mainly composed of suppressor of fused (SuFu). Gli is phosphorylated and is unable to enter the nucleus; B: In the presence of Hh, it binds to Ptch and relieves PTCH-mediated Smo inhibition. The activated Smo promotes the dissociation of complex of Sufu and Gli, thereby Gli is able to enter the nucleus and triggers the downstream target genes, resulting in activation of the canonical Hedgehog signaling pathway |
激活的Hedgehog信号通路介导下游多种生长因子的表达, 促进细胞增殖和生存。Hedgehog信号通路可以上调细胞周期蛋白D (cyclin D)和血小板源性生长因子受体α (platelet derived growth factor receptor-α, PDGFR-α)多肽的表达, 促进细胞的增殖; 通过上调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2) 来介导细胞存活; 另外还可以产生VEGF促进血管的生成[7]。由此也可以看出Hedgehog信号通路的失调与多种肿瘤的发生发展相关。
1.2 非经典Hedgehog信号通路非经典的Hedgehog信号通路包括: ① 不依赖于Gli转录因子而由Ptch或Smo直接激活信号通路; ② 不依赖于Hedgehog配体以及Ptch和Smo而直接由Gli转录因子激活信号通路。目前后者的研究较多, 已经确定了多种可以直接调控Gli转录因子的信号通路, 且绝大多数都是与肿瘤相关的通路。Ras基因家族成员之一K-Ras可以直接激活Gli1的转录活性, 可以不依赖于Hedgehog配体调控Hedgehog信号通路[8]。同时转化生长因子-β (transforming growth factor-β)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases)也可以直接激活Gli转录因子[9, 10]。另有研究表明, 过表达p53肿瘤抑制蛋白可以抑制Gli的转录活性, 而敲除p53基因后Gli转录活性增强[11]。
2 Hedgehog信号通路与肿瘤的发生发展Hedgehog信号通路在人类胚胎形成期参与细胞的增殖和分化, 在成年期调控组织修复, 而异常激活的通路会诱导癌症的发生。Hedgehog信号通路与肿瘤的联系最初是在痣样基底细胞癌综合征患者身上发现的[12]。痣样基底细胞癌综合征, 又称格林氏综合征(Gorlin syndrome), 是一种罕见的常染色体显性遗传疾病, 患者很可能产生特定的肿瘤如基底细胞癌、成神经管细胞瘤和横纹肌肉瘤。研究发现患者体内存在Ptch1的失活突变, 因此失去对Smo的抑制, 从而诱导Hedgehog信号异常激活[13]。异常激活的Hedgehog信号通路直接调控多种生长因子, 促进肿瘤细胞的增殖和生存。Hedgehog信号通路在基底细胞癌中调控PDGFR-α的表达, 促进细胞的增殖; 在B细胞恶性肿瘤中上调Bcl-2维持细胞的生长[14-16]。进一步对多种肿瘤的研究发现, Hedgehog信号通路通过两种机制, Hedgehog配体依赖性机制和非配体依赖性机制来调控肿瘤的发生发展。
2.1 Hedgehog配体依赖性机制在大多数肿瘤中, 失调的Hedgehog信号通路通过Hedgehog配体依赖性机制发挥作用(表 1)。过量的Hedgehog配体可以通过自分泌(肿瘤细胞同时分泌和接收Hedgehog配体)和旁分泌(肿瘤细胞分泌Hedgehog配体刺激间质细胞生长或间质细胞分泌配体刺激周围肿瘤的生长)的途径直接激活靶细胞的Hedgehog信号通路, 诱导肿瘤的发生。目前的研究主要集中在旁分泌机制, 基质细胞通过旁分泌Hedgehog配体为肿瘤细胞的增殖与存活提供有利条件, 并与其形成正反馈循环[17]。有研究表明部分白血病和多发性骨髓瘤的肿瘤细胞是由肿瘤微环境分泌的Hedgehog配体激活[18]。
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Table 1 Mechanisms of Hedgehog pathway signaling in cancer |
非配体依赖性的Hedgehog失调主要发生在基底细胞癌、髓母细胞瘤及多发性骨髓瘤中。在基底细胞癌中, 绝大部分的Hedgehog异常是由Ptch1和Smo突变造成的[19]。类似的, 在15%~30%髓母细胞瘤中存在Ptch1突变, 以及少部分SuFu的突变[20]。而Ptch1和SuFu的突变同样在横纹肌肉瘤中有发现[21]。以上结果表明, 失调的Hedgehog信号通路有助于肿瘤的发生发展。
3 Hedgehog信号通路抑制剂的研究进展最早发现的Hedgehog信号通路抑制剂, 是上世纪70年代从藜芦属植物提取出的一种异甾体类生物碱环巴胺(cyclopamine)。环巴胺直接结合于Smo蛋白的跨膜结构域上, 阻止Smo的构象改变及激活。环巴胺可以诱导结肠癌细胞的凋亡, 而在结肠癌小鼠异种移植模型中可以显著下调白介素-6 (interleukin-6)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α)及环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2) 的表达[22]。但有研究发现, 环巴胺抑制细胞生长的浓度是其抑制细胞Hedgehog信号通路所需浓度的10倍, 说明环巴胺可能对细胞有额外的脱靶效应, 并不仅是通过Hedgehog信号通路来调控细胞的增殖生长[23]。同时环巴胺较差的理化性质和其在小鼠模型上产生的严重不良反应如体重减少、脱水甚至死亡[24], 使得它的临床研究被搁浅。因此研究者将精力投放到其他Hedgehog信号通路抑制剂的研发中。迄今为止, 研究最成功的靶向Hedgehog信号通路药物是两个Smo抑制剂维莫德吉和索尼吉步, 这两个药物被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准上市用于治疗基底细胞癌。同时有许多其他Smo抑制剂如glasdegib、taladegib和saridegib等也处于临床研究阶段, 对多种肿瘤具有治疗效果。除此之外, 还有Gli抑制剂和Shh配体抑制剂处于初步研究阶段, 下文将药物分已上市、处于临床研究和处于临床前研究3类进行逐一介绍。
3.1 已上市的Hedgehog信号通路抑制剂 3.1.1 维莫德吉(vismodegib, GDC-0449)作为第一个上市的Hedgehog信号通路抑制剂, 由瑞士Roche公司研发的维莫德吉, 在2012年由FDA批准用于治疗成人转移性基底细胞癌和无法用手术治疗的局部晚期基底细胞癌。维莫德吉是环巴胺的第二代衍生物, 同环巴胺一样是通过结合Smo来抑制Hedgehog信号通路[25]。相比环巴胺, 维莫德吉选择性更高、体内药代动力学属性更好。最初是在髓母细胞瘤小鼠异种移植模型上发现维莫德吉具有明显的抑瘤效果, 灌胃12.5 mg·kg-1低剂量的维莫德吉可以完全抑制肿瘤的增长[26]; 随后在临床上用其治疗基底细胞癌, 取得显著疗效并最终上市。有研究还发现, 在肺腺癌细胞中用维莫德吉抑制Hedgehog信号通路, 能干扰细胞的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT), 从而抑制细胞的侵袭和转移[27]。
在维莫德吉还未上市治疗基底细胞癌前, 就在临床试验的髓母细胞瘤患者肿瘤组织中发现第一种Smo突变体(D473H), 令患者对维莫德吉产生耐药性[26]。随后在另一个髓母细胞瘤患者身上发现了新的Smo突变(E518K) [28], 在Ptch+/-p53-/-小鼠髓母细胞瘤模型上也发现了鼠源的Smo突变体(D477G)[29], 降低了肿瘤对维莫德吉的敏感度。除了耐药问题外, 维莫德吉也存在多种不良反应。超过半数的患者在用药后会出现体重下降、疲劳恶心、肌肉痉挛、脱发、味觉丧失和关节疼痛等不良反应[30], 而严重的更是引起死亡[31]。值得一提的是, 脱发作为维莫德吉常见的不良反应, 有临床研究认为患者脱发后的头发再生可以成为对维莫德吉产生耐药的标记[32]。但总体来看, 作为一种成熟的Hedgehog抑制剂, 维莫德吉仍具有相当的疗效, 目前也是研究的热点, 在临床研究上用于治疗一系列广泛的肿瘤如髓母细胞瘤、小细胞肺癌和转移性胰腺癌等(表 2)。
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Table 2 Launched Hedgehog inhibitors. Data sourced from ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrials.gov) |
索尼吉步是瑞士Novartis公司研发的具有二苯基羰酰胺结构的口服Hedgehog抑制剂, 在2015年被FDA批准用于治疗成人局部晚期基底细胞癌, 紧随维莫德吉成为第二个上市的Hedgehog抑制剂。索尼吉步在髓母细胞瘤小鼠异种移植模型上有显著抑瘤效果, 临床研究证明没有剂量限制性毒性后发现它对基底细胞癌的局部使用有较好疗效[33]。在多种肿瘤如恶性胶质瘤、前列腺癌和肾细胞癌上, 索尼吉步可以有效减弱细胞的EMT及侵袭的能力[34-36]。在CD34+慢性粒细胞白血病细胞中, 用索尼吉步调节Hedgehog信号通路可以在体外抑制肿瘤细胞的自我更新能力, 并在小鼠白血病移植模型上抑制肿瘤的发展[37]。
与维莫德吉相同的是, 索尼吉步也存在耐药问题。目前已经在小鼠髓母细胞瘤模型上发现多种鼠源的Smo突变(L225、N223、S391、D388和G457), 均对索尼吉步产生耐药作用[38]。在维莫德吉耐药的基底细胞癌上, 索尼吉步的治疗均未取得期望疗效, 预示着这两个上市的Hedgehog抑制剂在Smo蛋白上的结合袋是相同的[39]。同时作为传统的Smo抑制剂, 索尼吉步也具有与维莫德吉类似的不良反应。在一项用索尼吉步治疗基底细胞癌的Ⅰ期临床试验中, 70%患者产生味觉障碍, 63%出现脱发现象, 还有近半具有体重减轻、疲劳等不良反应[40]。目前, 在索尼吉步以单一疗法和结合疗法在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中用于治疗多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤(表 2)。
3.2 处于临床研究阶段的Hedgehog信号通路抑制剂 3.2.1 Smo抑制剂Smo是Hedgehog信号通路抑制剂研究的主要靶点。在抑制Smo的活性后可以直接阻止下游Gli转录因子的激活, 从而抑制Hedgehog信号通路下游肿瘤发生发展相关基因的表达。而Smo位于Ptch的下游, 因此Smo抑制剂对Hedgehog配体依赖性(Hedgehog配体过表达)和非配体依赖性(Ptch1或Smo突变)的肿瘤同样有效。然而Smo抑制剂单一的作用靶点易产生耐药性, 目前两个上市的Smo抑制剂在治疗中都出现了耐药现象, 而且其普遍存在的毒副作用限制了它的发展, 亟需新型Smo抑制剂以克服这些问题。
3.2.1.1 TAK-441TAK-441是日本Takeda公司在2012年研发的一种口服Smo抑制剂。在转染了Gli-荧光素酶报告基因的小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3) 中, TAK-441表现出显著的Hedgehog信号通路抑制作用[41]。TAK-441可以抑制Ptch+/-p53-/-转基因小鼠自发髓母细胞瘤模型的肿瘤发展, 并能下调胰腺癌异种移植模型中肿瘤Gli1的mRNA水平[42]。在细胞水平上, TAK-441对LNCaP前列腺癌细胞没有明显Hedgehog信号通路抑制作用, 而在LNCaP前列腺癌小鼠异种移植模型上明显下调肿瘤细胞Gli1、Gli2和Ptch1的表达水平, 提示TAK-441可能是通过旁分泌途径来抑制肿瘤Hedgehog信号通路的[43]。值得关注的是, TAK-441能同时抑制分别转染了野生型Smo和突变型Smo (D473H)质粒细胞的Hedgehog信号通路, 预示着在临床上TAK-441也可以治疗维莫德吉耐药的肿瘤[44]。在一项治疗基底细胞癌的Ⅰ期临床研究中, TAK-441治疗后的不良反应主要有轻至中度的味觉障碍、疲劳和恶心, 且无剂量依赖性, 表现出良好的耐受性[45]。因此TAK-441有望克服已上市药物维莫德吉耐药和毒副作用的问题。
3.2.1.2 Glasdegib (PF-04449913)Glasdegib是美国Pfizer公司研制的靶向Smo的Hedgehog抑制剂。在Shh配体激活Daoy细胞Hedgehog信号通路的模型中, glasdegib可以在纳摩尔水平上抑制Daoy细胞Gli1的mRNA水平[46]。当前对glasdegib的研究主要集中在血液系统恶性肿瘤上, 在慢性骨髓白血病和急性髓性白血病细胞上有诱导白血病干细胞休眠的能力[47]。另外glasdegib可以阻滞急性髓性白血病细胞的细胞周期, 在体内glasdegib通过作用于基质细胞的Hedgehog信号通路来抑制急性髓性白血病的发生发展[48]。进一步研究发现glasdegib治疗白血病的机制主要是抑制了Gli2的活性[49]。在一项Ⅰ期临床研究中, 患者在每天接受80、160和320 mg剂量glasdegib的治疗后都未出现剂量限制性毒性, 而在每天640 mg的高剂量下患者才出现恶心呕吐以及脱水等较严重的不良反应, 表现出良好的安全性[50]。Glasdegib在其他临床研究上也用于治疗肺癌和胃癌(表 3)。
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Table 3 Hedgehog inhibitors in clinical trials. Data sourced from ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrials.gov) |
Taladegib是Ignyta公司研发的Smo抑制剂, 在Daoy和小鼠间充质干细胞(C3H10T1/2) 中, taladegib直接结合于Smo并有效抑制细胞Hedgehog信号通路。在脱毛小鼠局部治疗模型中, taladegib处理后能显著降低小鼠皮肤组织中Gli1和Ptch1的mRNA水平[46]。在Ptch+/-p53-/-转基因小鼠自发的髓母细胞瘤模型上, taladegib抑制肿瘤的增长并促进caspase-3蛋白诱导的凋亡。Taladegib对维莫德吉耐药的Smo突变体(D473H)也有很强的抑制作用, 突显了它在临床治疗维莫德吉耐药肿瘤中的潜力[51]。而在一项治疗基底细胞癌的Ⅰ期临床研究中, taladegib治疗后的患者出现恶心呕吐、肌肉痉挛的不良反应[52]。目前taladegib正在临床Ⅰ/Ⅱ期试验用于治疗晚期实体瘤和肠道肿瘤(表 3)。
3.2.1.4 NVP-LEQ506NVP-LEQ506也是Novartis公司新研发的水溶性Smo抑制剂。在小鼠睾丸间质细胞(TM3) 建立的Gli-荧光素酶报告基因检测系统中, NVP-LEQ506显示了有效的Hedgehog信号通路抑制作用。NVP-LEQ506能下调人类胚胎腭间充质细胞(HEPM)中Gli1的mRNA水平, 显示了其抑制人类细胞Hedgehog信号通路的能力。与taladegib类似, NVP-LEQ506在转染了Smo突变体(D473H)的C3H10T1/2细胞上同样能发挥有效的通路抑制能力, 表明NVP-LEQ506也是克服维莫德吉耐药性问题的候选药物[53]。而在进一步的体内实验中, NVP-LEQ506在Ptch+/-p53-/-转基因小鼠自发的髓母细胞瘤模型中也表现出很好的疗效[54]。当前NVP-LEQ506的临床研究还较少, 仅用于治疗基底细胞癌和髓母细胞瘤(表 3), 缺乏相关的安全性研究。
3.2.1.5 其他Smo抑制剂BMS-833923 (XL139)、CUR61414和saridegib都是Gli-荧光素酶报告基因检测系统或荧光环巴胺竞争Smo实验中筛选得的Hedgehog抑制剂, 在细胞水平和小鼠移植瘤模型上都能抑制Hedgehog信号通路的活性。目前BMS-833923在Ⅰ/Ⅱ期临床上用于治疗白血病等肿瘤(表 3); CUR61414在一项治疗基底细胞癌的Ⅰ期临床研究中因无法穿透人体皮肤而被终止实验[46]; saridegib在治疗胰腺癌的Ⅱ期临床研究中未产生抑瘤效果而退出临床研究[55]。
3.2.2 Gli抑制剂Gli转录因子是Hedgehog信号通路的终端部分, 并且也受其他重要信号通路的调节。Gli1和Gli2的激活可以促进肿瘤的增长、生存、血管生成及耐药[56], 因此Gli也成为有效的抗肿瘤靶标。Gli作为Smo的下游蛋白, 直接抑制Gli可以从根本上解决目前Smo突变引起的耐药问题。
三氧化二砷(ATO)是FDA批准用于治疗急性早幼粒细胞白血病的药物, 后来研究发现它也是一种Gli转录因子抑制剂[57]。研究表明ATO通过直接与Gli1和Gli2结合来抑制Hedgehog信号通路[58]。在恶性横纹肌肉瘤、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤的体内外模型中, ATO都能抑制肿瘤Hedgehog信号通路的活性并促进细胞的凋亡[59-61]。上市的ATO已被确定为较安全的药物, 用其治疗Hedgehog信号通路相关的肿瘤有巨大的发展前景。目前, ATO在临床上已有多个研究用于治疗实体瘤和血液系统恶性肿瘤(表 3)。
3.3 处于临床前研究阶段的Hedgehog信号通路抑制剂 3.3.1 Smo抑制剂 3.3.1.1 MRT-92MRT-92是法国国家科学研究院研制的一种酰基胍类化合物, 通过与Smo蛋白上多个位点的结合来抑制Smo活性。在C3H10T1/2细胞上, MRT-92可以在纳摩尔水平抑制由Smo激动剂SAG激活的Hedgehog信号通路。在Gli-荧光素酶报告基因检测实验中, MRT-92抑制Shh-Light2细胞Hedgehog信号通路的能力[半数抑制量(IC50)值为2.8 nmol·L-1], 明显比维莫德吉(IC50值为7 nmol·L-1)和索尼吉步(IC50值为12 nmol·L-1)强。同时, MRT-92和维莫德吉一样可以抑制Ptch+/-小鼠髓母细胞瘤细胞的增殖。作为一种跨膜蛋白, Smo蛋白分为胞外区域和跨膜区域两个部分, 而目前的Smo抑制剂多结合于Smo蛋白的胞外区域(如环巴胺、维莫德吉和索尼吉步等)。进一步对MRT-92进行分子对接的研究显示, MRT-92不仅在Smo蛋白的胞外区域上有结合位点, 在其跨膜区域上也存在结合位点。MRT-92与Smo蛋白多位点结合, 提示MRT-92可以治疗维莫德吉耐药的肿瘤。随后研究也证实MRT-92对维莫德吉耐药的Smo突变体D473H有抑制作用。另外MRT-92与Smo多个位点的结合也意味着更强的结合性及更高的选择性, 显示了它强有力的研发潜力[62]。而目前尚未有MRT-92的临床研究, 缺乏对其安全性的评价。
3.3.1.2 PF-5274857PF-5274857是Pfizer公司研发的具有穿透血脑屏障能力的选择性Smo抑制剂。体外实验显示, PF-5274857在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中可以特异性地结合于Smo蛋白, 并在纳摩尔水平下调Gli1基因的表达。PF-5274857抑制Ptch+/-p53-/-小鼠髓母细胞瘤细胞增殖的IC50值是8.9 nmol·L-1; 在髓母细胞瘤移植模型上, 灌胃10 mg·kg-1剂量的PF-5274857就可完全抑制肿瘤的增长, 药效略强于维莫德吉(灌胃12.5 mg·kg-1完全抑制肿瘤的增长)。同时PF-5274857可以下调肿瘤组织中Gli1、Gli2、Ptch1和Ptch2的表达水平, 显著提高荷瘤小鼠存活率, 而且没有明显的毒副作用[63]。药物动力学研究表明, 给药4 h后大鼠血浆中接近40%的PF-5274857可以透过血脑屏障进入脑部, 使得其有望成为治疗脑部恶性肿瘤的理想药物。然而目前还未见PF-5274857临床试验的报道。
3.3.1.3 AT-101AT-101是一种从棉籽中提取的天然产物, 目前作为Bcl-2抑制剂在临床Ⅱ期治疗多种肿瘤如非小细胞肺癌和晚期喉癌[64]。有研究发现AT-101对Hedgehog信号通路也有明显抑制作用, 在NIH3T3细胞上可以下调Gli1的mRNA水平; 荧光环巴胺竞争Smo蛋白的研究表明, AT-101也是靶向Smo蛋白的抑制剂[65]。AT-101可以抑制Ptch+/-p53-/-小鼠髓母细胞瘤细胞的增殖, 而台盼蓝实验的结果显示髓母细胞瘤细胞并无明显死亡, 表明AT-101不引起细胞死亡。在髓母细胞瘤的移植瘤模型中AT-101表现出显著的抑瘤效果, 在40 mg·kg-1剂量下肿瘤抑制率达到70%, 表明其是治疗Hedgehog信号通路依赖肿瘤的候选药物。AT-101作为Bcl-2抑制剂在临床研究中未出现明显不良反应, 有望在临床上研究其对Hedgehog信号通路相关肿瘤的治疗效果。
3.3.1.4 其他Smo抑制剂Novartis公司研发的酞嗪衍生物Anta XV也是一种Smo抑制剂, 灌胃40 mg·kg-1剂量可以抑制Ptch+/-p53-/-小鼠髓母细胞瘤生长。但Anta XV治疗的小鼠体重与对照组相比减少了近20%, 表现出明显毒副作用[66]。相比之下, 上海复旦大学药学院根据Anta XV的结构改造获得的化合物10e (图 2)表现出更好的药效。化合物10e在Gli-荧光素酶报告基因模型中抑制Hedgehog信号通路的IC50值比Anta XV低10倍, 且对小鼠髓母细胞瘤细胞的增殖抑制作用也略强于Anta XV。40 mg·kg-1剂量的化合物10e可以显著抑制小鼠体内髓母细胞瘤的生长, 而对小鼠体重无明显影响, 相比Anta XV有着更好的耐受性[55]。目前对化合物10e的药效及安全性的研究正在进行中。
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Figure 2 Chemical structures of the compound 10e and 65 |
化合物65 (图 2)是中国科学院上海药物研究所根据青蒿素二聚体的结构研发出的Smo抑制剂。在Ptch+/-p53-/-小鼠髓母细胞瘤的体内外模型中, 化合物65表现出与维莫德吉相似的抑瘤效果, 而对小鼠体重无影响。但化合物65在转染突变型Smo蛋白W539L或D473H的细胞上缺乏Hedgehog抑制效果, 提示其无法治疗维莫德吉耐药的肿瘤[67]。尽管如此, 化合物65提供了有别于传统苯甲酰胺类Smo抑制剂(如维莫德吉)的成药机制, 为新型Smo抑制剂的研发提供基础。
3.3.2 Gli抑制剂 3.3.2.1 GANT-61GANT-61是由美国国家癌症研究所研发的Gli转录因子抑制剂, 能显著抑制Gli1和Gli2的DNA结合能力[68]。GANT-61可以诱导急性髓性白血病细胞的凋亡, 明显抑制细胞的增殖, 并且能增强阿糖胞苷对癌细胞的细胞毒作用[69]。在T细胞淋巴瘤中GANT-61可以通过下调Gli1、信号传导与转录激活因子-3 (signal transducer and activator of transcription 3) 及细胞因子信号传导抑制蛋白-3 (suppressor of cytokine signaling 3) 的蛋白水平发挥抑瘤效果[70]。在Daoy细胞中GANT-61能上调caspase-3和caspase-9的蛋白表达水平, 并能降低线粒体膜电位, 促进细胞线粒体介导的凋亡[71]。但目前GANT-61还未达到临床研究阶段, 缺乏进一步的安全性评价。
3.3.2.2 FN1-8FN1-8是由美国加利福尼亚大学研发的Gli抑制剂。Gli蛋白的羧基端包含一个转录活化域, 化合物FN1-8模仿了该活化域的结构, 从而能特异性地抑制Gli1和Gli2的转录活性。在恶性胸膜间皮瘤细胞上, FN1-8对肿瘤细胞的生长抑制效果明显强于维莫德吉, 还可以促进肿瘤细胞的凋亡。在人间皮瘤小鼠异种移植模型上, 50 mg·kg-1 FN1-8的肿瘤抑制率达到51%, 且未出现不良反应[72]。另外FN1-8在体外可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖, 并下调肿瘤细胞中Gli1和PTCH1的表达, 对正常细胞无影响; 同时50 mg·kg-1 FN1-8可以在人肺癌细胞H460和A549的小鼠异种移植瘤模型中抑制肿瘤的生长, 而对小鼠的体重无影响[73]。在细胞和动物水平上, FN1-8都表现出良好的安全性, 有望克服目前Hedgehog信号通路抑制剂毒副作用大的问题。
3.3.3 Shh配体抑制剂在3种Hedgehog配体中, Shh配体是成体组织中表达最广泛、效应最强的配体。而作为经典Hedgehog信号通路的起始部分, Shh配体也成为抑制肿瘤Hedgehog通路的靶标。Shh配体作为Smo的上游蛋白, 抑制Shh也可以从根本上解决Smo突变引起的耐药问题。
3.3.3.1 RU-SKI 43在翻译和合成Shh蛋白的过程中, Shh信号多肽最初被切割成一个19 kDa的Shh配体前体。该前体在膜表面Hedgehog酰基转移酶(Hh acyltransferase, Hhat)的作用下棕榈酰化得到成熟配体, 随后用于激活Hedgehog信号通路[74]。Hhat基因敲除小鼠和Shh基因敲除小鼠表现出相同的发育性缺陷, 提示Hhat可以成为抑制Shh配体活性的靶标[75]。RU-SKI 43是通过高通量筛选获得的在细胞水平上有Hedgehog信号通路抑制能力的Hhat抑制剂。在乳腺癌细胞上, 用RU-SKI 43处理细胞或敲除细胞Hhat基因都能抑制细胞的增殖, 同时过表达Hhat可以减弱RU-SKI 43的抑瘤效果[76]。另外RU-SKI 43可以抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖, 而敲除Hhat基因抑制胰腺癌小鼠异种移植模型中肿瘤的生长[77]。因此RU-SKI 43有望用于治疗Hedgehog信号通路相关的肿瘤, 而目前还缺乏进一步的临床研究。
3.3.3.2 Shh单克隆抗体5E15E1是靶向Shh的单克隆抗体, 能直接结合并抑制Shh配体的活性。在胰腺癌小鼠异种原位移植模型上, 20 mg·kg-1 5E1可以明显抑制肿瘤的生长, 同时对小鼠的体重完全无影响, 具有不良反应小的特点[78]。在治疗原位宫颈癌异种移植瘤的研究中, 5E1可以抑制肿瘤生长和转移, 同时表现出良好的耐受性[79]。由此可见, 5E1有望成为Hedgehog信号通路相关肿瘤的治疗手段, 但仍需要进一步的临床研究。
4 总结与展望Hedgehog信号通路在哺乳动物的发育过程中起到重要的作用, 而失调的Hedgehog信号通路在多种肿瘤的发生发展中也扮演关键角色。因此, 近年来Hedgehog信号通路上的几个主要组成部分(Shh、Smo和Gli)都成了治疗肿瘤的热门靶标。其中研究最成功的是靶向Smo的抑制剂, 已经有维莫德吉和索尼吉步两个药物被FDA批准上市用于治疗转移性和晚期的基底细胞癌。然而, 作为单靶点治疗药物, 上市的Smo抑制剂存在常见的耐药性问题。现已上市的Smo抑制剂维莫德吉在其临床研究阶段就出现了耐药性问题, 髓母细胞瘤患者肿瘤组织中产生的Smo突变令维莫德吉失去疗效。而另一个上市的Smo抑制剂索尼吉步在小鼠肿瘤模型上也发现了多种产生耐药的Smo突变体, 同样预示着索尼吉步治疗肿瘤的局限性。此外, 已上市的Smo抑制剂存在普遍的毒副作用, 比如体重下降、疲劳恶心、肌肉痉挛、脱发、味觉丧失及关节疼痛等, 而严重的甚至会引起死亡。为了克服传统Smo抑制剂毒副作用和耐药性的问题, 急切需要研发新型的Hedgehog信号通路抑制剂。新型的Smo抑制剂taladegib、NVP-LEQ506、MRT-92和TAK-441在临床前研究中已经被证实可以治疗对维莫德吉耐药的肿瘤。其中法国国家科学研究院研制的MRT-92可以结合于Smo蛋白上多个位点, 增强对Smo的靶向性和结合力, 减少药物的毒副作用和产生耐药的几率。同时针对Smo上游靶点Shh配体的抑制剂RU-SKI 43和5E1, 以及靶向Smo下游蛋白Gli的抑制剂GANT-61、FN1-8和三氧化二砷, 可以避开Smo基因突变的影响, 理论上也能克服维莫德吉的耐药及毒副作用问题。另外现已上市的药物维莫德吉和索尼吉步仅是用于治疗晚期基底细胞癌, Hedgehog信号通路抑制剂对其他相关肿瘤的治疗仍有极大发展空间。临床上已经用多种Smo抑制剂和Gli抑制剂治疗髓母细胞瘤、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、小细胞肺癌及急性髓性白血病等数十种恶性肿瘤, 并取得了良好的疗效。总而言之, 新型的靶向Hedgehog信号通路抗肿瘤药物具有广阔的开发前景, 但仍需临床上更深入的研究, 以克服已有药物毒副作用和耐药性问题, 并进一步拓宽肿瘤治疗的类型。
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