2. 广西中医药大学药学院, 广西 南宁 530001;
3. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193;
4. 桂林三金药业股份有限公司, 广西 桂林 541004;
5. 哈尔滨商业大学生命科学与环境研究中心, 黑龙江 哈尔滨 150076
2. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, China;
3. Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China;
4. Guilin Sanjin Pharmaceutical Company Limited, Guilin 541004, China;
5. Center of Research and Development on Life Sciences and Environment Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China
中药金樱子为蔷薇科蔷薇属灌木植物 (Rosa laevigata Michx.), 主要分布于我国华东、中南、西南等地。《本草纲目》中记载金樱子“性酸、涩、平、无毒; 主治脾泻下痢、止小便利、涩精气, 久服, 令人耐寒轻身, 补血益精, 有奇效”[1]。现代医学研究发现金樱子可用于皮肤肿瘤、烧烫伤、神经衰弱、高血压、神经性头痛、慢性肾炎等的治疗[2, 3]。在传统中医药中金樱子的果实常作为利尿补肾的药材使用; 叶子入药能够解毒消肿。目前, 国内外学者从金樱子的果实和叶中已经分离纯化得到了甾体及甾体皂苷类、三萜及三萜皂苷类、木脂素、黄酮、可水解鞣质、多糖等多种化学成分。金樱子的根也常入药, 亦称金樱根, 具有拔毒收敛、活血化瘀、祛风驱湿等作用, 是我国南方地区民间习用药材, 也是生产三金片、金鸡胶囊、妇科千金片、王老吉等中成药的关键原料药材, 但是目前对金樱子根的物质基础和作用机制研究尚不够深入。为了进一步阐明该药的有效成分, 本课题组对金樱子根的化学成分进行了深入研究, 从中分离得到5个三萜酸类化合物, 分别鉴定为: 19α-OH-3β-E-feruloyl corosolic acid (1)、23-hydroxy-tormentic acid (2)、2α, 3β, 19α, 23-四羟基-齐墩果-12-烯-28-酸 (3)、2α, 3α, 20β-三羟基乌苏烷-13(18)-烯-28-酸 (4) 和2α, 3β, 20β-三羟基乌苏烷-13(18)-烯-28-酸 (5)。化合物1~5结构见图 1。其中, 化合物1为新化合物, 化合物4、5为首次从蔷薇属分离得到。
化合物1 白色粉末 (乙酸乙酯), 10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。[α]25 D+ 68.8 (c 1, 1 mol·L-1氢氧化钾乙醇溶液); HR-ESI-MS m/z: 687.385 1 [M+Na]+ (计算值: 687.387 3), 确定分子式为C40H56O8, 不饱和度为13。UV末端吸收峰λmax (log ε): 203 (3.84)、324.5 (3.18) nm。红外光谱显示结构中存在羟基 (3 480 cm-1)、甲基 (2 967, 2 876 cm-1)、双键 (1 636 cm-1) 等特征信号峰。
1H NMR谱 (表 1) 中显示, 高场区给出7组甲基氢信号δH: 1.06 (3H, s, H-23)、1.03 (3H, s, H-24)、1.02 (3H, s, H-25)、1.09 (3H, s, H-26)、1.71 (3H, s, H-27)、1.43 (3H, s, H-29)、1.12 (3H, d, J=6.6 Hz, H-30), 根据裂分情况推测该化合物中含有6个甲基连接在季碳上和1个甲基连接在叔碳上, 为乌苏烷型化合物[4], 19位无氢信号, 证明19位还存在取代; 低场区给出2组连有强电负性基团的氢原子信号δH: 4.30 (1H, dt, J=9.6, 4.8 Hz, H-2)、5.25 (1H, d, J=9.6 Hz, H-3), 1个烯氢原子信号δH: 5.57 (1H, br s, H-12), 推测结构中含有2个羟基和1个环内双键; 一组ABX系统质子信号δH 7.27 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2')、7.21 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5')、7.20 (1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6') 和反式双键质子信号8.00 (1H, d, J=15.6 Hz, H-7')、6.74 (1H, d, J=15.6 Hz, H-6'), 一个甲氧基质子信号δH 3.80 (3H, s), 提示三萜骨架上存在反式阿魏酰基取代[5], 在13C-APT (pyridine-d5, 600 MHz) 谱中, 可见有40个碳信号, 包括7个甲基碳信号δC: 17.2、17.2、17.7、18.0、18.7、25.2、27.7; 1个甲氧基信号δC 56.7; 3个连氧碳信号δC 66.9、85.5、73.2;一组sp2杂化烯碳信号δC 128.2和140.5为乌苏烷型双键碳特征信号[4]; 羧基碳δC 183.7为典型的乌苏烷三萜类C-28位信号[4], 另外9个杂化碳信号δC 111.9、116.7、117.2、125.8、127.3、145.6、149.4、151.4、168.3和苯环上连接的甲氧基碳信号δC 56.7证明存在反式阿魏酰基[5]。上述数据说明化合物1为存在反式阿魏酰基取代的乌苏烷三萜类衍生物。
1H-1H COSY显示 (图 2) H-1/H-2/H-3、H-5/H-6/ H-7、H-9/H-11/H-12、H-15/H-16、H-20/H-21/H-22、H-5'/H-6'/H-7'/H-8'存在相关, 进一步证实化合物乌苏烷型三萜类化合物, 且存在一个反式阿魏酰基。在HMBC谱中, δH 3.80 (s, -OCH3) 与δC 151.4 (C-3') 存在远程相关, 说明甲氧基连接在C-3'上; δH 3.05 (s, H-18)、δH 1.43 (s, H-29) 分别与δC 73.2 (C-19) 存在相关, 结合分子式推测化合物1的C-19分别存在甲基和羟基取代。另外, 在该HSQC中δH 4.30 (dt, J=9.6, 4.8 Hz, H-2) 与δC 66.9 (C-2) 存在直接相关, C-2位向低场移动说明C-2位存在羟基取代。化合物1取代基的立体构型由NOE谱确定, 乌苏烷型结构母核中H3-25为β构型, H-18为β构型, 在NOE谱中, H3-25与H-1β存在相关, H-2与H-1β存在相关, 说明C-2位的羟基为α构型, H-18与H3-29存在相关, 表示H3-29为β构型, 综上所述, 化合物1的结构完全阐明, 该化合物为一新化合物, 与3β-E-feruloyl corosolic acid相关数据[6-8]对比, 该化合物仅在19位多一个羟基取代, 因此, 将化合物1命名为19α-OH-3β-E-feruloyl corosolic acid。
Bylabuv-Ⅲ灯 (北京炳洋科技有限公司), Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振波谱仪 (德国Bruker公司), DZF-6030A真空干燥箱 (上海-恒科学仪器有限公司), Lumtech高效液相色谱仪 (K501四元低压半制备), RE-2000A型旋转蒸发仪 (上海振捷实验设备有限公司), 色谱柱为Agilent SB-Phenyl 9.4 mm × 250 mm, 5 µm (美国安捷伦公司), 普通试剂均为分析纯 (中国医药集团上海化学试剂公司), HPLC试剂均为色谱纯, 蒸馏水为实验室自制。
药材由桂林三金药业股份有限公司提供, 采集于桂林市雁山镇, 经广西壮族自治区民族医药研究院植物分类专家戴斌研究员鉴定为蔷薇科植物金樱子 (Rosa laevigata Michx) 的根。
1 提取分离金樱子根8.0 kg, 阴干后粉碎, 分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、50%甲醇加热回流提取3次, 每次提取1.5 h, 减压浓缩各提取液, 分别得到石油醚部位浸膏A: 11.2 g, 二氯甲烷部位浸膏B: 40.5 g, 乙酸乙酯部位浸膏C: 133.3 g, 丙酮部位浸膏D: 233.5 g, 50%乙醇部位浸膏E: 266.0 g。
取浸膏C (乙酸乙酯部位133.3 g), 经硅胶柱色谱 (100~200目) 分离, 流动相为二氯甲烷-甲醇 (100:0、100:1、80:1、50:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:100) 梯度洗脱, 将所得洗脱液薄层点板合并相同极性段部分, 得到C1~C7共7个部位。其中C4 (CH2Cl2-MeOH, 100:1、80:1) 部位用硅胶柱色谱分离, 洗脱剂为石油醚-二氯甲烷 (1:1)、二氯甲烷-甲醇 (100:0、40:1、20:1、5:1、0:100), 得到C4.1~4.4共4个流分, C4.3 (CH2Cl2-CH3OH, 5:1) 经半制备型HPLC (流动相CH3OH-H2O=80:20, 2 mL·min-1) 分离纯化, 得到化合物1 (10.0 mg, tR=50.3 min)。
取浸膏D (丙酮部位223.5 g), 经大孔树脂柱色谱分离, 流动相为乙醇-水 (0:100、10:90、30:70、50:50、70:30、100:0) 进行梯度洗脱, 得D1~D6共6个部位。D5 (70:30部位) 经中压柱色谱分离, 流动相为甲醇-水 (30:70、50:50、60:40、70:30、85:15、100:0) 进行梯度洗脱, 得到D5.1~D5.9共9个部位。D5.6、D5.7经制备型HPLC (流动相CH3OH-H2O=70:30, 流速: 10 mL·min-1) 分离纯化, 分别得到D5.6.1~5.6.9、D5.7.1~D5.7.9。D5.6.2经半制备型HPLC (流动相CH3OH-H2O=56:44, 2 mL·min-1) 分离纯化, 得到化合物2 (11.5 mg, tR=75.0 min)、3 (13.0 mg, tR=78.4 min), D5.7.6经半制备型HPLC (流动相CH3OH-H2O=78:22, 2 mL·min-1) 分离纯化, 得到化合物4 (16.5 mg, tR=45.0 min), D5.7.7经半制备型HPLC (流动相CH3OH-H2O=85:15, 2 mL·min-1) 分离纯化, 得到化合物5 (7.9 mg, tR=18.3 min)。
2 结构鉴定化合物1 白色粉末 (乙酸乙酯), 10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。[α]25 D+ 68.8 (c 1, 1 mol·L-1氢氧化钾乙醇溶液); HR-ESI-MS m/z: 687.385 1 [M+Na]+ (计算值: 687.387 3), 确定分子式为C40H56O8, 不饱和度为13。UV末端吸收峰λmax (log ε): 203 (3.84)、324.5 (3.18) nm。红外光谱显示结构中存在羟基 (3 480 cm-1)、甲基 (2 967, 2 876 cm-1)、双键 (1 636 cm-1) 等特征信号峰。NMR数据见表 1。
化合物2 白色粉末, 10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色; 分子式C30H48O6。ESI-MS m/z: 527 [M+Na]+。1H NMR (pyridine-d5, 600 MHz) δH: 1.06 (3H, s, H-24), 1.08 (3H, s, H-26), 1.10 (3H, d, J=6.6 Hz, H-30), 1.12 (3H, s, 25-CH3), 1.40 (3H, s, H-27), 1.64 (3H, s, H-29), 3.04 (1H, br s, H-18), 3.72 (1H, d, J=10.8 Hz, H-23a), 4.18 (1H, d, J=9.0 Hz, H-23b), 4.19 (1H, d, J=3.6 Hz, H-3), 4.37 (1H, dt, J=13.2, 6.6 Hz, H-2), 5.57 (1H, br s, H-12); 13C NMR (pyridine-d5, 150 MHz) δC: 48.7 (C-1), 69.3 (C-2), 78.7 (C-3), 44.1 (C-4), 48.4 (C-5), 19.1 (C-6), 33.6 (C-7), 40.9 (C-8), 48.2 (C-9), 38.9 (C-10), 24.7 (C-11), 128.4 (C-12), 140.4 (C-13), 42.6 (C-14), 29.7 (C-15), 26.8 (C-16), 48.3 (C-17), 55.0 (C-18), 73.1 (C-19), 42.8 (C-20), 27.3 (C-21), 39.0 (C-22), 66.9 (C-23), 14.7 (C-24), 17.2 (C-25), 17.7 (C-26), 25.1 (C-27), 181.1 (C-28), 27.5 (C-29), 17.7 (C-30)。其1H NMR及13C NMR谱数据与文献[9]报道的数据基本一致, 故将化合物2鉴定为23-hydroxy-tormentic acid。
化合物3 白色粉末, 10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色; 分子式C30H48O6。ESI-MS m/z: 527 [M+Na]+。1H NMR (pyridine-d5, 600 MHz) δH: 1.06 (3H, s, H-25), 1.08 (3H, s, H-26), 1.10 (3H, s, H-24), 1.11 (3H, s, H-30), 1.17 (3H, s, H-29), 1.56 (3H, s, H-27), 3.72 (1H, d, J=10.8 Hz, H-23a), 4.21 (1H, d, J=9.0 Hz, H-23b), 4.14 (1H, d, J=3.6 Hz, H-3), 4.25 (1H, dt, J=13.2, 6.6 Hz, H-2), 5.52 (1H, br s, H-12); 13C NMR (pyridine-d5, 150 MHz) δC: 47.9 (C-1), 69.3 (C-2), 78.6 (C-3), 44.1 (C-4), 48.9 (C-5), 19.1 (C-6), 34.1 (C-7), 40.5 (C-8), 48.4 (C-9), 38.8 (C-10), 24.6 (C-11), 123.9 (C-12), 145.3 (C-13), 42.6 (C-14), 29.6 (C-15), 26.8 (C-16), 46.4 (C-17), 45.2 (C-18), 81.5 (C-19), 36.1 (C-20), 29.2 (C-21), 33.4 (C-22), 66.8 (C-23), 14.8 (C-24), 18.0 (C-25), 17.7 (C-26), 25.2 (C-27), 181.3 (C-28), 29.3 (C-29), 25.2 (C-30)。其1H NMR及13C NMR谱数据与文献[10]报道的数据基本一致, 故将化合物3鉴定为2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxy-12-ene-28-oleanolic acid。
化合物4 白色粉末, 10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色; 分子式C30H48O5。ESI-MS m/z: 511 [M+Na]+。1H NMR (pyridine-d5, 600 MHz) δH: 0.86 (3H, s, H-26), 0.89 (3H, s, H-24), 0.94 (3H, s, H-25), 0.99 (3H, s, H-23), 1.07 (3H, d, J=6.6 Hz, H-29), 1.26 (3H, s, H-27), 1.27 (3H, s, H-30), 3.77 (1H, d, J=1.8 Hz, H-3), 4.35 (1H, m, H-2); 13C NMR (pyridine-d5, 150 MHz) δC: 43.2 (C-1), 66.6 (C-2), 79.7 (C-3), 39.3(C-4), 49.1 (C-5), 18.8 (C-6), 35.7 (C-7), 42.4 (C-8), 51.6 (C-9), 39.5 (C-10), 22.2 (C-11), 28.5 (C-12), 140.4 (C-13), 43.9 (C-14), 28.2 (C-15), 33.9 (C-16), 43.9 (C-17), 132.5 (C-18), 40.8 (C-19), 83.2 (C-20), 33.3 (C-21), 26.3 (C-22), 29.9 (C-23), 22.6 (C-24), 18.3 (C-25), 18.3 (C-26), 20.9 (C-27), 176.2 (C-28), 17.2 (C-29), 23.3 (C-30)。以上数据与文献[11]报道的基本一致, 故确定该化合物为2α, 3α, 20β-trihydroxyurs-13(18)-en-28-oic-acid。
化合物5 白色粉末, 分子式C30H48O5, 10%浓硫酸-乙醇溶液显紫红色。ESI-MS m/z: 511 [M+Na]+。1H NMR (pyridine-d5, 600 MHz) δH: 0.86 (3H, s, H-24), 0.97 (3H, s, H-26), 1.06 (3H, s, H-25), 1.08 (3H, d, J=6.6 Hz, s, 29-CH3), 1.12 (3H, s, H-23), 1.27 (3H, s, H-27), 1.28 (3H, s, H-30), 3.41 (1H, d, J=9.0 Hz, H-3), 4.14 (1H, m, H-2); 13C NMR (pyridine-d5, 150 MHz) δC: 48.7 (C-1), 69.2 (C-2), 84.2 (C-3), 40.3 (C-4), 56.3 (C-5), 19.2 (C-6), 35.7 (C-7), 42.2 (C-8), 51.7 (C-9), 39.3 (C-10), 22.3 (C-11), 28.5 (C-12), 140.3 (C-13), 43.2 (C-14), 28.2 (C-15), 33.9 (C-16), 43.9 (C-17), 132.6 (C-18), 40.8 (C-19), 83.2 (C-20), 33.3 (C-21), 26.3 (C-22), 29.7 (C-23), 18.0 (C-24), 18.4 (C-25), 18.5 (C-26), 20.9 (C-27), 176.2 (C-28), 17.2 (C-29), 23.3 (C-30)。以上数据与文献[11]报道的基本一致, 故确定该化合物为2α, 3β, 20β-trihydroxyurs-13(18)-en-28-oic-acid。
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