2017, Vol. 52
二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydro genase, DHODH) 是一种催化嘧啶核苷酸从头合成第4步反应的黄素依赖性线粒体酶[1]。人类二氢乳清酸脱氢酶(HsDHODH) 抑制剂可以阻断嘧啶核苷酸生物从头合成途径, 阻止细胞进入DNA复制的S期, 进而减少快速增殖的淋巴细胞及肿瘤细胞的增殖。因此, HsDHODH可作为癌症和类风湿性关节炎、红斑狼疮、牛皮癣及多发性硬化症等自身免疫性疾病药物的靶点[2]。
DHODH分为两个家族: Ⅰ型和Ⅱ型。HsDHODH属于家族Ⅱ型酶, 以辅酶Q作为电子受体[3, 4]。在DHODH参与的催化反应过程中, 首先二氢乳清酸(DHO) 被氧化为乳清酸(ORO), 同时黄素单核苷酸(FMN) 被还原为还原型黄素单核苷酸(FMNH2), 其后在辅酶Q的作用下FMNH2被重新氧化为FMN, 参与到下一轮的催化循环反应中[5]。
布喹那(化合物1, 图 1) 和来氟米特(化合物2, 图 1) 是两种比较典型的DHODH抑制剂[6, 7]。来氟米特是唯一一个已上市的用于治疗类风湿性关节炎的HsDHODH抑制剂, 然而来氟米特的长期使用会引发较大的不良反应如腹泻、高血压、皮疹, 并且会导致肝功能损伤严重[8, 9]。布喹那联合顺铂或是环孢霉素A给药时, 会引起白细胞和血小板减少以及黏膜炎等不良反应[10, 11]。因此, 寻找高效新型、不良反应小、安全性高的DHODH抑制剂具有很高的研究价值。首先, 在布喹那和来氟米特基础上对其结构进行了优化尝试。化合物4 (FK778) 进一步延长了A771726烯醇上的疏水基团, 该化合物在2004年曾作为抑制肾移植排异反应的药物进行临床试验[12, 13]。2012年, 本课题组采用分子对接程序Glide和结合自由能计算法Prime/MM-GBSA联用的策略, 获得噻唑衍生物HsDHODH抑制剂先导物, 经过优化得到化合物5 (IC50=18 nmol·L-1), 同时对于CIA关节炎模型大鼠的关节肿胀有显著缓解, 且组织病理学切片镜检显示关节组织病变有明显改善[14, 15]。
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Figure 1 Reported structures of HsDHODH inhibitors and the lead compound (compound a is the hit in this study) |
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Scheme1 Synthetic route of target compounds b-i |
为寻找新型HsDHODH抑制剂, 本文以课题组前期发现的带有1, 2, 4-三氮唑母核的1-丁酰基-3-(4-氯苯基)-5-甲硫基-1H-1, 2, 4-三氮唑作为苗头化合物[14], 其抑制活性IC50值为5.84 μmol·L-1。为开展结构优化, 培养和分析了苗头化合物与DHODH的复合物晶体结构, 并制订了结构改造方案。以取代苯甲酸和氨基硫脲为原料, 设计合成了一系列结构新颖且具有较高抑制活性的基于三氮唑骨架的潜在人类二氢乳清酸脱氢酶抑制剂, 产物结构经1H NMR、13C NMR和HR-MS确认, 并对其构效关系进行深入研究, 目标化合物的合成路线如下所示(合成路线1)。
结果与讨论 1 苗头化合物a与HsDHODH共晶培养与解析为进一步阐述苗头化合物a与HsDHODH的结合模式, 提高后续结构优化的有效性, 培养了苗头化合物a与HsDHODH的复合物晶体(表 1)。
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Table 1 The data collection for the co-crystal structure of HsDHODH in complex with a. aRmerge=100×ΣhΣj|Ih, j-Ih|/ΣhΣjIh, j where Ih is the weighted mean intensity of the symmetry-related refractions Ih, j. bValues for the outermost resolution shell are given in parentheses. cRfree is calculated using a randomly selected 5% sample of reflection data omitted from the refinement |
苗头化合物a与HsDHODH复合物的晶体结构如图 2所示。苯环上的氯原子位于酶口袋深处由氨基酸残基Val134和Val143形成的一个小的疏水空腔中而产生疏水相互作用。同时, 1, 2, 4-三氮唑环和甲硫基处于辅酶Q结合口袋入口处较大的疏水空腔中, 整个分子主要通过与酶口袋活性位点处的氨基酸产生疏水相互作用而保持较高的抑制活性。
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Figure 2 X-ray crystal structure of HsDHODH in complex with a. 2Fo-Fc electron density for compound a is contoured at 1σ. Compound a is shown in cyan sticks, and some key residues are shown in purple sticks |
基于对苗头化合物与蛋白酶复合物晶体结构解析, 将苗头化合物展开以下几个方面的优化, 如图 3所示:为增强疏水性相互作用, 探寻与酶口袋内部由氨基酸残基Val134和Val143组成的小的疏水空腔相匹配的苯环取代基, 本研究将在苗头化合物中R1处引入疏水基团; 为通过增强抑制剂与Leu42、Ala59、Phe62、Leu68、Phe98、Met111和Leu359等残基的疏水作用和范德华力, 本研究将在苗头化合物中R2处引入一些疏水性基团; 针对苗头化合物中R3处疏水基团的优化, 希望找到与口袋疏水部分相匹配的疏水取代基, 进而增强化合物的抑制活性。
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Figure 3 Structural modification of the lead compound |
中间体的物理性质及1H NMR数据见表 2[15-21], 目标化合物表征见表 3。
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Table 2 Physical properties and 1H NMR data of intermediates |
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Table 3 Physical properties and 1H NMR, 13C NMR, HR-MS data of compounds b-i |
合成的目标化合物HsDHODH活性测试结果见表 4。比较化合物b与c、d与e、f与g的活性可以看出, 三氟甲基的引入比苗头化合物中的氯原子可较好地提高抑制活性, 化合物d比化合物e抑制活性提高一倍。原因可能是三氟甲基的体积较氯原子略大, 疏水相互作用的加强导致抑制活性的提高。在R2引入呋喃甲酰基时, 活性得到改善, 其中化合物d的IC50值可达1.50 μmol·L-1, 明显优于苗头化合物的抑制活性。比较化合物h和i, 发现活性很差, 而化合物c和e表现出高活性, 这说明乙硫基的引入, 可更好地与酶口袋疏水部分相匹配, 苄硫基的空间体积过大或空间取向冲突, 导致与周边氨基酸残基发生碰撞而活性变差。
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Table 4 Activities of compounds a-i against HsDHODHin vitro enzyme assays. aIC50 values were determined from the results of at least three independent tests, and attempts to determine IC50 values were made if the inhibition rate at 10 μmol·L-1 was larger than 50% |
本文基于苗头化合物与HsDHODH共晶结构培养和解析, 优化设计合成了一系列结构新颖的HsDHODH抑制剂, 并分析该系列化合物的构效关系。在苯环对位引入三氟甲基较氯原子可更好地占据酶口袋深处由氨基酸残基Val134和Val143组成的疏水凹槽, 有利于增强抑制活性; 疏水端三氮唑环R2处引入芳香环(如苯甲酰基、呋喃甲酰基) 较烷基更有利于增强与酶口袋入口处氨基酸残基Leu42、Ala59、Phe62、Leu68、Phe98、Met111和Leu359的π-π堆积疏水相互作用而提高化合物抑制活性, 化合物d的抑制活性达到1.50 μmol·L-1, 明显优于苗头化合物的抑制活性; 三氮唑环R3处乙硫基的引入, 与苗头化合物中的甲硫基比较可加强与酶口袋周围氨基酸残基的疏水相互作用。值得注意的是, 在三氮唑环的氮原子上引入较大体积芳香基团的同时在硫原子上引入较小烷基链时, 由Leu46和Thr360包围的酶口袋处不足以容纳过大的基团, 化合物在酶口袋内部可发生近180度的空间构型旋转, 较大体积的芳香基团占据酶口袋入口处疏水空腔, 进而提高抑制活性。此结论对三氮唑环类HsDHODH抑制剂的进一步优化提供了参考, 有助于发现更高活性的HsDHODH抑制剂。
实验部分 1 合成部分核磁共振仪(瑞士, Bruker AV-400);显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司, SGW X-4);质谱仪(惠普, HP5989A); 柱色谱硅胶(200~300目, 青岛海洋化工有限公司); 药品与试剂均为分析纯。
目标化合物的合成(以目标化合物c为例):
对氯苯甲酰氯(1c):称量对氯苯甲酸(500 mg, 3.20 mmol) 于25 mL烧瓶中, 加入二氯亚砜(1 mL) 及一滴DMF。加热至回流, 反应过夜。过量的二氯亚砜减压蒸馏后, 制备的酰氯直接用于下步反应。
4-氯苯甲酰氨基硫脲(2c):称量氨基硫脲(230 mg, 2.53 mmol) 于25 mL烧瓶中, 加入吡啶10 mL和中间体对氯苯甲酰氯(400 mg, 2.30 mmol), 加热至50 ℃, 反应12 h。将吡啶旋干, 剩余的固体, 加入水(10 mL) 搅拌, 过滤后得到白色的固体。得到的固体经过乙酸乙酯重结晶, 得到白色晶体。
3-(4-氯苯基)-1H-1, 2, 4-三氮唑-5(4H)-硫酮(3c):称量中间体4-氯苯甲酰氨基硫脲(200 mg, 0.87 mmol) 于25 mL烧瓶中, 加入1 mol·L-1 NaHCO3 (10 mL), 加热至回流, 反应24 h, 用稀HCl中和至中性, 之后用乙酸乙酯萃取, 有机相加入无水硫酸钠干燥, 浓缩的有机相用乙酸乙酯和石油醚重结晶, 得到白色晶体。
3-(4-氯苯基)-5-乙硫基-1H-1, 2, 4-三氮唑(4c):称量中间体3-(4-氯苯基)-1H-1, 2, 4-三氮唑-5(4H)-硫酮(600 mg, 2.84 mmol) 于25 mL烧瓶中, 加入1 mol·L-1 NaOH (6 mL), 量取碘乙烷(230 μL, 2.84 mmol) 和乙醇(1 mL) 加入烧瓶中, 室温反应24 h。加入水用乙酸乙酯萃取, 收集有机相, 经过无水硫酸钠干燥后, 浓缩有机相, 经柱色谱纯化, 得到白色固体。
3-(4-氯苯基)-5-乙硫基-1H-1, 2, 4-三氮唑-1-基) 苯甲酮(目标化合物c):称量化合物3-(4-氯苯基)-5-乙硫基-1H-1, 2, 4-三氮唑(50.0 mg, 0.21 mmol) 和三乙烯二胺(70.7 mg, 0.63 mmol) 溶于无水DMF (1 mL) 中, 苯甲酰氯(88.6 mg, 0.63 mmol) 溶于无水DMF (1 mL) 后加入上述溶液中, 氩气保护下, 在室温反应16 h。将溶液旋干后, 用二氯甲烷萃取, 用无水硫酸钠干燥。浓缩有机相, 得到油状物粗品, 用甲醇重结晶, 得到白色针状固体。
2 化合物的生物活性测试及苗头化合物-HsDHODH的复合物晶体培养 2.1 化合物的生物活性测试HsDHODH的蛋白表达和纯化方法参考文献所述[22, 23]。HsDHODH的抑制剂筛选采用DCIP的方法[22, 24]。将纯化后的HsDHODH蛋白用测活溶液(50 mmol·L-1 HEPES pH 8.0, 150 mmol·L-1 KCl, 0.1% Triton X-100) 稀释至10 nmol·L-1, 加入辅酶Q及DCIP至其终浓度分别为100及120 μmol·L-1。混匀后用排枪以每孔199 μL加入到96孔板中, 之后置于室温下孵育5 min, 然后每孔加入1 μL底物DHO至其终浓度为500 μmol·L-1。运用酶标仪读取600 nm处吸光值, 一共读取6 min, 每30 s读取一次。计算酶促反应初速度V0, 抑制剂活性测试则是在上述反应体系中加入不同浓度的抑制剂, 计算酶促反应初速度Vi, 通过公式(1-Vi/V0)×100%计算出化合物的抑制率。用软件Origin8.0计算化合物的IC50值。该实验以brequinar为阳性对照, 每次实验至少设置3个平行。
2.2 HsDHODH与苗头化合物的共晶培养苗头化合物和HsDHODH的复合晶体由悬滴蒸汽扩散法于20 ℃培养[22]。将纯化后的HsDHODH蛋白浓缩至20 mg·mL-1, 加入底物DHO及苗头化合物至终浓度均为2 mmol·L-1, 然后置于冰上孵育2 h。沉淀剂溶液包含0.1 mol·L-1醋酸pH 4.8、40 mmol·L-1 C11DAO、20 mmol·L-1 DDAO以及1.6~1.81 mol·L-1硫酸铵。一般情况下在3天内晶体即以黄色小方块的形式显现, 在3周内晶体可达到0.2 mm × 0.2 mm × 0.2 mm的大小。
2.3 HsDHODH与苗头化合物的晶体衍射数据及结构解析X射线晶体衍射数据是在上海同步辐射光源(SSRF) 生物大分子线站(BL17U1) 收集[25], 温度为100 K。收集的衍射数据运用MOSFLM软件进行初步处理[26], 用ccp4软件中的scale程序进行归并[27], 接着以1D3G为模板(去掉所有的水分子和配体) 采用分子置换法进行解析, 用Coot[24]和Refmac5[28]进行交替精修。晶体衍射数据及结构解析见表 1。分子图形用Pymol (DeLano, 2002) 软件作图。
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