2. 西南大学-西藏农牧学院药用植物联合研发中心, 重庆 400715;
3. 西南大学药学学院, 重庆 400715;
4. 西藏大学农牧学院, 西藏 850000
2. SWU-TAAHC Medicinal Plant Joint R & D Centre, Chongqing 400715, China;
3. School of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;
4. Agricultural and Husbandry College, Tibet University, Tibet 850000, China
托品烷类生物碱 (tropane alkaloids,TAs) 包括莨菪碱 (hyoscyamine)、山莨菪碱 (anisodamine) 和东莨菪碱 (scopolamine),是一类在茄科植物中合成的次生代谢产物[1]。TAs作为抗胆碱药物作用于副交感神经,其中莨菪碱及其衍生物已普遍用于临床,如治疗因平滑肌痉挛引起的各种内脏绞痛、全麻的术前给药以及治疗帕金森、抗休克、解有机磷中毒等[2]。TAs在植物侧根中合成并储存,也可以转运到植物地上部位储存。由于TAs的化学合成复杂且昂贵,因此目前尚未实现商业化生产,而主要依赖于从少数茄科植物中提取,如天仙子 (Hyoscyamus niger)、颠茄 (Atropa belladonna) 和曼陀罗 (Datura stramonium) 等。因此,研究TAs生物合成途径上的相关基因,进而采用次生代谢工程提高植物中TAs的含量具有重要意义。近些年来,通过分子生物学手段克隆并鉴定了TAs合成途径的一系列相关基因,如N-甲基腐胺转移酶 (putrescine N-methyltransferase)[3]、托品酮还原酶I (tropinone reductase I,TRI)[4]和莨菪碱-6β-羟化酶 (hyoscyamine-6β-hydroxylase,H6H)[5]。但总体而言,TAs生物合成途径仍未完全解析,比如部分关键步骤包括苯乳酸支路途径仍有待研究。由苯丙氨酸经过苯丙酮酸到苯乳酸的支路途径从理论上推测仅需转氨和还原两步反应 (图 1),但是相关的酶和基因有待鉴定和克隆。
氨基转移酶 (aminotransferases) 催化氨基酸与其相应的酮酸之间的可逆反应,其中氨基酸作为氨基的供体,而酮酸则作为氨基的受体。氨基转移酶在生物体内参与众多代谢途径,包括氨基酸的合成与分解、维生素的合成、碳氮代谢、次生代谢、糖质新生等[6]。放射性前体饲喂实验表明苯丙酮酸是TAs的合成前体,其来源于苯丙氨酸的转氨反应[7]。植物中存在一类芳香族氨基酸氨基转移酶 (aromatic amino acid aminotransferase,ArAT),非特异性地催化苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸3种芳香族氨基酸的转氨过程。2014年,Bedewitz等[8]首次通过分析颠茄各组织转录组数据库,采用病毒诱导的基因沉默技术 (virus- induced gene silencing,VIGS),克隆并鉴定了参与TAs生物合成的AbArAT4基因,该基因编码的蛋白能够优先以苯丙氨酸为底物,通过转氨反应生成苯丙酮酸。目前在其他TAs资源植物中还未见该基因的报道。
本实验室已完成天仙子侧根和叶片组织的转录组测序,通过对转录组数据分析,筛选到3条功能注释为ArAT的基因。在本研究中拟采用生物信息学、数字表达谱分析等方法锁定在天仙子中可能参与TAs生物合成的ArAT基因并对其进行功能验证,为进一步阐明TAs生物合成过程和开展代谢工程研究奠定基础。
材料与方法材料 天仙子种子由兰小中教授采集鉴定,天仙子实生苗由本实验培养。采用种子直接萌发,培养基质为蛭石、PINDSTRUP营养土、珍珠岩 (比例为6∶3∶1) ; 光周期为16 h; 温度为24 ℃。待植株长至5~6厘米,出现2片完全展开真叶,即可开展VIGS试验。
RNA 的提取与cDNA的合成 取适量天仙子植株的根和叶在液氮中研磨,按照RNA simple Total RNA Kit说明书提取总RNA,电泳检测RNA的完整性,同时使用Nanodrop 2000测定A260/A280的比值分析RNA的浓度和纯度,并反转成cDNA,用于基因克隆。
天仙子转录组数据分析 根据本实验室前期完成的天仙子侧根和叶片2种组织的转录组测序数据 (未发表),利用BioEdit软件进行本地BLAST分析,筛选HnArATs的UniGene进行序列分析,同时对HnArATs 基因的数字表达谱进行分析。
生物信息学分析 使用Vector NTI Suite8.0软件进行序列比对分析、ORF的查找及核苷酸的翻译、氨基酸序列多重比对; 用MEGA4.1构建进化树,重复次数为1 000次。
HnArAT3 基因编码区的扩增 根据EST序列,设计1对简并引物HnArAT3-F: 5'-CCGGGATCCCA CTACTTCCATATTCTCTCA-3'和HnArAT3-R: 5'-CC GGAGCTCCTTGCATTTTCATGCTCGTC-3',以天仙子根的cDNA为模板进行开放阅读框的序列扩增。
基因表达量检测 使用iScriptTM cDNA Synthesis Kit试剂盒将天仙子根和叶的RNA进行反转录,得到的cDNA做为荧光定量PCR检测模板,以18S rRNA作为内参检测各基因的表达量。所用引物见表 1。
病毒诱导的基因沉默 本研究所用VIGS法参照Li等[9]的方法,略有修改。根据EST序列,设计引物HnArAT3TRV-F: 5'-CCGCTCGAGGGAGCAATGTTT CTCATGGT-3'和HnArAT3TRV-R: 5'-CCG GAATTCC TTGCATTTTCATGCTCGTC-3',克隆HnArAT3带有部分编码框区237 bp及3'非编码区的152 bp特异片段,将片段直接连接到pTRV2载体,命名为pTRV2-HnArAT3,经测序验证后用于后续实验。将pTRV1、pTRV2、pTRV2-HnPDS和pTRV2-HnArAT3分别转化农杆菌GV3101,48 h后将单菌落挑于1 mL YEP培养基+50 mg·L-1利福平 (rifampicin,Rif) +50 mg·L-1卡那霉素 (kanamycin,Kan) +10 mg·L-1硫酸庆大霉素 (gentamycin sulfate,Gen) 28 ℃过夜活化,PCR检测相应工程菌。将1 mL菌液接种到10 mL (Kan+Rif+Gen) YEP液体培养基中,28 ℃、200 r·min-1振荡培养过夜,次日将活化菌液室温4 500 r·min-1离心10 min,弃上清,用缓冲液[10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 2-(N-吗啉)乙磺酸-水合物、20 μmol·L-1 AS(乙酰丁香酮)]重悬菌体至A600=1.0,室温静止3~5 h,注射前将pTRV1分别与所有pTRV2重组载体的农杆菌按1∶1混合,用去针头的注射器从幼嫩叶片的背面注射,使菌液充满整个叶片。将注射后的植株放在22 ℃暗培养48 h后正常培养,15天后取侵染植株的根进行基因表达量分析; 45天后取侵染植株进行生物碱分析。
生物碱提取与HPLC检测 天仙子植株生物碱的提取及检测参照本实验室发表的方法[10, 11]。莨菪碱、山莨菪碱及东莨菪碱的标品均购自Sigma公司,HPLC检测使用岛津高效液相色谱仪 (泵: LC-20AD,柱温箱: CTO-20A,自动进样器: STL-20A,检测器: SPD-M20A),Phenomenex C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)。
结果 1 HnArATs 基因序列分析根据转录组测序数据的功能注释,筛选到3条注释为“芳香族氨基酸转移酶 (ArAT)”的UniGene序列,分别命名为HnArAT1、HnArAT2和HnArAT3。HnArAT1 UniGene全长2 642 bp,包含一个963 bp的开放读码框,编码320个氨基酸残基; HnArAT2 UniGene全长1 493 bp,包含一个1 251 bp的开放读码框,编码416个氨基酸残基; HnArAT3 UniGene全长1 571 bp,包含一个1 260 bp的开放读码框,编码419个氨基酸残基。
2 HnArATs 基因的数字表达谱分析通过天仙子侧根和叶两个组织部位的转录组测序结果,分析HnArAT1、HnArAT2和HnArAT3 3条基因的数字表达谱 (图 2)。HnArAT1基因在根和叶中均有表达,但根中表达量高于叶; HnArAT2特异性在叶中表达; 而HnArAT3特异性在根中表达,叶中表达量甚微,其表达模式与TAs生物合成途径中其他合成途径基因 (PMT、TRI和H6H)[12-15]一致,暗示HnArAT3可能是参与托品烷生物碱合成的基因。
将推导的HnArAT1、HnArAT2和HnArAT3蛋白氨基酸序列与其他茄科植物、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 和罂粟 (Papaver somniferum) 等物种中已经报道的ArAT家族蛋白序列一起用neighbor-joining 方法构建系统进化树 (图 3),进行亲缘关系分析。结果表明HnArAT3在分子进化上与AbArAT4的亲缘关系最近,聚为同一支。AbArAT4是目前ArAT家族中唯一的已被鉴定参与托品烷生物碱生物合成的酶,这一结果强烈地暗示HnArAT3在天仙子中很可能行使相同的功能。因此,本研究中对HnArAT3基因进行了分析和功能验证。
分析HnArAT3 UniGene的假定5'-UTR,在预测的开放阅读框起始密码子ATG上游同一相位105 bp处,存在一个终止密码子TAA,表明该UniGene序列包含一个完整的开放阅读框,长1 260 bp,编码419个氨基酸。用高保真酶扩增该开放阅读框序列 (图 4),测序结果与Unigene序列完全一致,将该基因提交NCBI,获得GenBank登录号为KX058486。BLASTp分析结果表明,HnArAT3蛋白序列与AbArAT4的序列一致性最高,达到90.7%,与At5g36160及At5g53970的序列一致性分别为51.5% 和60.2%,与罂粟的Ps- TyAT序列一致性为50%,与矮牵牛 (Petunia hybrida) PH-PPY-AT序列一致性为62.4%。氨基酸多重序列比对结果表明HnArAT3与其他物种的ArATs一样,在249位氨基酸残基处,均存在保守的酪氨酸催化残基,同时,结合磷酸吡哆醛 (pyridoxal-5'-phosphate) 辅因子的另外9个氨基酸残基在相应的位置也都十分保守 (图 5)。以上结果表明HnArAT3很可能为AbArAT4的直系同源基因,在天仙子中催化苯丙氨酸的转氨反应。
利用荧光定量PCR检测HnArAT3基因在天仙子植株根和叶中的表达量,同时也检测了另外3个TAs生物合成途径基因PMT、H6H和TRI相应的组织表达情况。结果见图 6,PMT、H6H、TRI均在根中大量表达,HnArAT3基因的表达模式与数字表达谱基本一致,主要在根中表达,在叶中表达较少,与上述3个合成途径基因有相同的组织表达特异性。因此,HnArAT3基因很可能参与了托品烷生物碱的合成。
前期本实验室采用病毒诱导的基因沉默方法 (VIGS) 沉默了天仙子中的PDS基因,观察到了明显的光漂白现象,本研究采用此方法在天仙子植株中鉴定HnArAT3基因的功能。利用农杆菌注射的方法浸染天仙子,侵染15天后,实时荧光定量PCR检测侵染植株根的HnArAT3基因表达量,发现相比注射空载体pTRV2的对照植株,pTRV2-HnArAT3干扰植株中HnArAT3的基因表达量下降了70%~80% (图 7),表明目的基因已被成功沉默; 45天后,检测侵染植株中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的含量,结果见图 8,以pTRV2空载体侵染的植株作为对照,在浸染pTRV2-HnArAT3的植株中几乎检测不到莨菪碱; 山莨菪碱含量降低了55%; 东莨菪碱的含量极显著降低,只有对照的21%,说明通过VIGS沉默HnArAT3基因后,天仙子植株中托品烷类物质合成受到抑制,这些结果证实HnArAT3基因在天仙子中参与了TAs的生物合成。
植物代谢产物生物合成分子生物学的研究是开展植物次生代谢工程的前提与基础。托品烷类生物碱生物合成途径经过20多年的研究,部分限速步骤已经基本清楚,通过生化和分子生物学手段也鉴定到了相关限速酶基因并作为代谢工程靶点进行资源植物的遗传改造,取得了良好的效果。但是该途径仍然存在一些未知酶促反应步骤,限制了对其合成调控机制的研究和进一步代谢工程的应用,这些合成途径的盲点包括从苯丙氨酸到苯乳酸合成的支路途径、苯乳酸如何与托品缩合生成海螺碱以及海螺碱的分子重排中间体在未知的醇脱氢酶作用下生成莨菪碱。苯乳酸支路途径为托品烷类生物碱合成提供了托品酸骨架结构,曼陀罗发根的刺激子诱导实验表明苯乳酸支路途径与主流途径受到MeJA信号不同的调控[16]。TAs生物合成涉及到的转氨酶基因也仅在颠茄中有孤例报道[8]。
基于转录组测序和合成途径基因组织表达谱特征来发现和锁定未知的合成途径基因是一种行之有效的方法。在颠茄、曼陀罗和天仙子等植物中,托品烷类生物碱只在须根中合成,已鉴定的一些合成途径特异性的基因如PMT、CYP80F1和H6H等也都在须根中特异性地表达 (颠茄H6H在花粉中也表达)。正是基于这种组织表达特异性,Bedewitz等[8]从筛选出的颠茄6条AbArAT基因中,首次鉴定到了须根特异性表达并且参与托品烷类生物碱生物合成的AbArAT4基因。本研究也是基于该方法,从天仙子转录组数据库中筛选出了3条HnArAT基因,数字表达谱分析发现只有HnArAT3在须根中特异性的表达,与天仙子中PMT、TRI和H6H基因的组织表达谱一致,经过进化树分析及多重氨基酸序列比对,HnArAT3与AbArAT4的序列同源性最高,达到90.1%; 亲缘关系也最近,为直系同源基因; 两者均包含有保守的赖氨酸活性位点和辅酶结合位点。这些结果提供了初步的证据表明HnArAT3可能参与了天仙子中托品烷类生物碱的合成。
VIGS是一种广泛应用的研究新基因功能的反向遗传学技术,具有高通量、快捷和简便有效等特点。利用该技术最近已成功鉴定出CYP80F1和ArAT4这两个合成途径基因,进一步完善了托品烷类生物碱生物合成途径。在已有的研究中,前人用烟草脆裂病毒系统成功在黑莨菪 (Hyoscyamus muticus) 和颠茄中建立了VIGS体系[8, 9]。本研究也利用该系统和方法,以PDS为标志基因成功在天仙子中观察到了光漂白现象,漂白率达到100% (数据未显示),表明天仙子对该病毒系统非常敏感,基于该系统的VIGS在天仙子中相当高效。构建了VIGS沉默载体pTRV2- HnArAT3,进行天仙子侵染实验,初步鉴定了HnArAT3在天仙子体内的功能。实时荧光定量PCR检测到HnArAT3基因的表达量下降了70%~80%; HPLC检测沉默效果,生物碱含量降低50%~100%。这一结果明确表明HnArAT3是天仙子托品烷类生物碱生物合成的苯乳酸支路途径基因。
植物中通常存在多条芳香族氨基酸氨基转移酶,它们都能不同程度地以苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸作为氨基供体,主要以α-酮戊二酸作为氨基受体,生成相应的酮酸和谷氨酸,但新近克隆的参与托品烷类生物碱合成的AbArAT4却几乎只以4-HPP为氨基受体,优先以苯丙氨酸为氨基供体,转氨生成相应的酪氨酸和苯丙酮酸,而苯丙酮酸是托品烷类生物碱的合成前体。最近分别从矮牵牛和甜瓜中发现两个芳香族氨基酸氨基转移酶Ph-PPY-AT[17]和Cm-ArAT1[18],它们都以酪氨酸和苯丙酮酸为底物,生成苯丙氨酸和4-HPP。芳香族氨基酸氨基转移酶能催化可逆的反应,与AbArAT4不同的是,Ph-PPY-AT优先催化苯丙氨酸和4-HPP的合成,其活性是相应反向反应的2倍; 而AbArAT4优先催化苯丙酮酸和酪氨酸的合成,其活性是相应反向反应的250倍。这些结果表明,AbArAT4是颠茄中特有的参与次生代谢物托品烷类生物碱合成的转氨酶,而Ph-PPY-AT和Cm-ArAT1等转氨酶可能只是在植物体芳香族氨基酸稳态中发挥作用。HnArAT3是否具有和AbArAT4类似的酶活力特征还有待进一步研究。
本研究从天仙子中鉴定到了托品烷类生物碱生物合成支路途径的HnArAT3基因,为进一步研究托品烷类生物碱的生物合成和代谢调控奠定了基础,也为开展托品烷类生物碱代谢工程研究提供了新的候选靶基因。
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