医药科技的发展不断提出新的治疗策略和概念, 近年来出现的精准医学 (precision medicine) 的概念, 其核心是通过基因组和蛋白质组学等技术, 对于大样本人群与特定疾病类型从分子水平进行分析与鉴定、验证与应用, 从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶标, 最终实现对于疾病和特定患者进行个体化的精细和准确的治疗。
精准医学与药物密切相关, 药物是疾病治疗的手段和物质保障, 在精准医学的框架下体现在两个方面: 一是针对特定的靶标或机制进行新药研发, 提供安全有效特异和经济的药物; 二是临床应用, 根据患者疾病类型和病情进行个体化的准确治疗。创制安全有效乃至特效的药物是实现精确治疗的前提与保障; 按精准原则治疗的结果以及发现的线索或问题又反馈于深化新药研究, 二者相互依存和促进。
笔者不拟使用“精准药学”一语, 盖因见仁见智。就新药研发而言, 在精准的目标下所涵盖的大都是熟知的内容: 靶标的发现与确证; 靶标与适应证的关联 (概念验证); 先导物的发现与优化; 临床前研究的药效、药代和不良反应与临床试验的关联; 药品设计、产业化和药物经济学的精益化等等, 通过全价值链的实施与监管, 提供给精准治疗以安全有效药物。本文拟从药物分子设计的一角, 特别是从成功药物与靶标结合的微观特征, 讨论研发中的一些细节问题。
2 基于基因差异——伊马替尼的研制治疗慢性粒细胞白血病药物的伊马替尼是基于染色体基因变异, “量体裁衣”研制出的。细胞和分子生物学研究发现染色体22号与9号的相互易位, 导致22号染色体变短, 称作费城短染色体, 它携带有Bcr-Abl癌基因, 表达的Bcr-Abl融合蛋白, 含有功能高度激活的酪氨酸激酶, 导致细胞内信号转导的失控, 引起慢性粒细胞白血病 (CML) 的发生。CML具有Abl激酶高表达的遗传特征, 作为分子靶标, 诺华成功研制口服治疗CML的药物伊马替尼 (1, imatinib), 经概念验证和临床研究, 成为首个治疗CML的有效药物, 也因此开创了分子靶向药物治疗的新领域。
伊马替尼是通过基于结构的药物设计 (SBDD) 与药物化学构效关系 (SAR) 而实现结构优化的, 研制过程漫长而曲折, 本文不拟作全面介绍, 只从晶体结构和结合特征对设计的关键问题加以说明。图 1a和b分别是伊马替尼与Abl激酶的结合特征和疏水结合的内环境。其结合要点概述如下: ① 苯环A的6位甲基 (又称作旗甲基, flag-methyl) 设计的重要性: 甲基处于-NH-的邻位, 邻位基团的阻转效应逼迫嘧啶连同吡啶环发生一定角度的扭转, 定向地采取了稳定的构象, 将吡啶环“送到”酶的Tyr253残基处, 发生π-π结合作用; ② 连接苯环A与嘧啶环的-NH-作为氢键给体与酶的重要残基Thr315的侧链羟基 (接受体) 形成氢键, Thr315是催化中心的门户氨基酸, 守护和维持催化过程。由于羟基与伊马替尼的-NH-形成氢键, Thr315失去了门户守卫的作用; ③ A环4位的连接基-NH-CO-将B环及其连接的片段引导并插入到酶的裂隙之中, 苯环B进入由Ile293、Leu298和Leu354构成的疏水腔内, 将本来“埋入”其中的活性环套 (A-loop) 的DFG挤出, 使DFG-in变成DFG-out构象, 而ATP对酪氨酸的磷酸化须为DFG-in构象。这样, 伊马替尼通过影响变构位点阻断了激酶的催化功能。
这些关键性的微观特征保障了伊马替尼分子的分子形状 (构象) 从而发生特异性结合[1]。
3 克服对伊马替尼耐药的帕那替尼2001年上市的伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白血病的有效药物, 长期应用产生耐药性。分子生物学研究发现, 癌细胞为了逃逸伊马替尼的作用, 将门户氨基酸残基 (gatekeeper) 发生突变, The315变异为Ile315, 这样, 在结构上氨基酸侧链由CH(CH3)OH变成CH(CH3)CH2CH3, 不仅体积变大, 空间上阻碍了伊马替尼的进入, 而且侧链的羟基缺失, 失去与伊马替尼形成氢键的能力, 导致疗效减退。从变异后的结构特征如何克服耐药性呢?
ARIAD公司为克服AblT315I变异导致的耐药性, 研发的帕那替尼 (2, ponatinib) 于2011年上市, 帕那替尼对耐药的激酶和细胞有强效抑制活性 (IC50分别为40和8.8 nmol·L-1)。研发者针对AblT315I结构变异, 关键的设计有两点: ① 变换了伊马替尼苯环A与嘧啶环相连的-NH-基, 既然AblT315I的门户残基无氢键形成能力, 而且扩大了空间障碍, 就没有必要保留-NH-片段, 而是用乙炔基连接苯环A与杂环。乙炔基是疏水性的线型小体积连接基, 它避开异亮氨酸侧链的阻挡, 使得咪唑并吡啶杂环得以进入疏水腔中。此处乙炔基为”光秃”的两个sp1杂化的碳原子, 位阻最小, 长度适宜。相应的乙烯基或亚乙基化合物活性降低, 提示反式或顺式双键以及柔性的亚乙基不利于结合, 说明精确设计乙炔基之成功。② 将A环的4-胺酰基变为3-酰胺基, 位置的变迁和胺酰基的逆向, 增强了氢键的结合力, 并且有利于将苯环B输送入疏水腔中。图 2是帕那替尼与AblT315I晶体结构的简图, 标示出乙炔基与异亮氨酸侧链的相对位置以及酰胺片段的结合特征[2]。
4 发掘和利用药物与靶标有利结合的微观特征 4.1 提高结合热力学的焓贡献——第二代HIV蛋白酶抑制剂地瑞那韦药物的活性取决于同靶标的结合强度,结合能ΔG越高, 活性越强。热力学告诉我们, 药物与靶标结合的自由能是由焓 (ΔH) 与熵 (-TΔS) 构成, 虽然焓与熵之间的贡献往往有补偿作用 (enthalpy-entropy compensaton, 即焓强熵弱或熵强焓弱), 但精细的分子设计可以实现焓-熵同向正贡献, 并且使焓贡献最大化, 降低仍属正贡献的熵份额, 成为优质药物。疏水性药物与靶标的结合往往是熵因素占优, 结合能大都来源于疏水结合, 这种结合的特异性不如焓因素 (例如氢键, 盐键等) 高, 而且高疏水性药物的代谢作用也比较复杂。
Tibotec公司研制的地瑞那韦 (3, darunavir) 经美国FDA批准于2006年上市, 治疗艾滋病。地瑞那韦是模拟水解反应过渡态的HIV蛋白酶抑制剂, 属于第二代产品。从化学结构看, 地瑞那韦类似于GSK公司研制的安普那韦 (4, amprenavir), 只是在四氢呋喃环上又并合了一个四氢呋喃环。
地瑞那韦与上市前的“那韦”类药物的结构虽然不同, 但与HIV蛋白酶活性部位的结合模式大同小异, 都是蛋白酶底物的过渡态类似物, 呈现抑制活性的结合力包括疏水作用和氢键结合, 以疏水作用为主, 因而是熵驱动占优的结合。而地瑞那韦则是以焓为主要贡献。表 1列出了有代表性的沙奎那韦、替拉那韦、安普那韦和地瑞那韦的活性和热力学特征。
表 1的数据表明, 地瑞那韦的的活性强于既往的药物十倍至数百倍。比安普那韦强85倍。更重要的是地瑞那韦结合能的焓贡献是熵的5倍, 而其他那韦多数是熵大于焓, 即使安普那韦也只是焓熵持平。地瑞那韦的用药剂量低, 有效剂量低是高选择性和低脱靶性的表现。此外, 地瑞那韦对多种耐药株也有抑制活性。分析地瑞那韦结构和结合特征, 表明与活性中心发生了广泛的氢键结合[3]。图 3是地瑞那韦与HIV蛋白酶复合物晶体结构的简约图, 图中的9条虚线表示形成的氢键网络结构, 将药物分子牢固地结合于催化中心。特别是并合的四氢呋喃环, 氧原子与Asp29'和Asp30'又形成两个氢键, 增加的结合能来源于焓贡献, 大大提高了抑酶活性。所以, 地瑞那韦是在结构生物学和分子模拟的指引下, 利用了活性中心“空余”的氢键给体, 在安普那韦的基础上设计出有质性飞跃的蛋白酶抑制剂[4]。
初始的先导物优化,往往以对靶标的离解常数或IC50作为活性判断、研究构效关系和化合物取舍的标准, 然而, 离解常数或IC50是在封闭的平衡状态下测定的热力学特征, 是在受试化合物浓度不变的状态下测定的。其实, 从深层次上挖掘, 还有药物与靶标的结合动力学行为。
机体是个开放系统, 药物在体内是个动态过程, 在血浆和细胞中的药物水平处于不断地变化中。在体内药物与靶标形成复合物, 其离解作用不受游离药物浓度的影响, 复合物的离解速率koff决定了药物占据靶标和与之结合的时程, 结合的半衰期 (t1/2结合, 与药代的t1/2不同) 越长, 在靶标处驻留时间 (residence time, RT) 越久, 作用时程越长, 因而有效剂量低, 选择性高, 脱靶性低。用放射性标记测定酶抑制剂的结合 (kon) 与离解速率常数 (koff), 非标记方法如用电生理方法 (如膜片钳技术) 或表面等离子共振 (surface plasmon resonance, SPR) 和核磁共振技术。测定受试物的kon与koff值(并由此计算出离解常数Kd值), 依此可分析化学结构与结合动力学关系 (SKR)。SKR是深层次的SAR, 在一定意义上更接近体内的状态。当然, 用细胞测定受试物动态物质重分布[5] (dynamic mass redistribution) 或整体动物用正电子发射断层显影技术[6] (PET), 所测定的药物结合动力学数据更加实用。
药物分子与靶标的结合速率kon大, 离解速率koff小, 是由于结合过程伴随构象的变化, 尤其是靶标蛋白构象的改变, 提高了离解过程的能垒, 复原成游离状态须越过较高的能垒, 以至于koff变小, 造成“来之容易去之难”的后果。由于蛋白质的柔性和构象复杂性, 还不能从微观结构预测结合动力学性质, 但药物化学的SKR分析和复合物晶体结构特征, 可有助于理解动力学的某些过程。例如研究周期蛋白依赖性激酶8/周期蛋白C抑制剂, 化合物5的侧链增加两个亚甲基为化合物6, 进而变换为叔丁氧羰化合物7, 动力学性质乃至热力学的参数都发生显著改变, 表 2列出了这些数据。
表 2的数据表明, 化合物5~7的骨架结构相同, 影响热力学和动力学变化的主要因素是脲基连接的侧链不同。化合物5活性弱, Kd 3 500 nmol·L-1, t1/2结合只有1.2 min, 晶体结构表明末端羟基作为氢键给体与活化环套DMG的Met174的羰基形成氢键 (图 4a)。化合物6的侧链增加了两个亚甲基, 结合活性提高了40多倍, 离解速率变慢, t1/2结合 = 40 min, 晶体学提示侧链呈伸展型构象, 6的末端OH与Asp98的羰基形成氢键 (图 4b)。化合物7的侧链进一步增长, 并以叔丁基为终端, 结合作用增强7倍, 离解速率很小, t1/2结合 = 1 400 min, 虽然没有形成氢键的羟基, 但化合物7在活性中心占据的空间和形状加大 (图 4c灰色部分), 活化环套的构象发生显著变化, 离解复原成游离态需要越过较高的能垒, 因而7不仅活性强, 而且在活性部位的驻留时间也长, 预示7的作用时间持久, 选择性高[7]。
另一个实例是治疗慢性阻塞性肺病药物噻托溴铵 (8, tiotropium bromide), 于2012年在美国上市。噻托溴铵是毒蕈碱M3受体阻断剂, 可扩张支气管治疗哮喘和慢阻肺。其实, 噻托溴铵对M2受体也有抑制作用, 但并未显示出对心脏的不良反应, 原因是结合动力学提高了选择性作用。表 3列出了噻托溴铵对M3和M2受体的活性参数[8]。
如果只从Kd值分析, 由于对M3和M2受体活性相近, 预示着脱靶作用会引起心脏的不良反应。然而结合动力学的koff值相差很大, 对M3受体有很长的t1/2(DR), 比M2长10倍, 在动力学的层面上体现出选择性作用。噻托溴铵作为日服一次的长效喷雾剂, 未显示对心脏的副作用。此外, 由于t1/2(DR)长, 即使血药浓度的谷值降到pmol·mL-1, 仍然维持有舒张气管作用。分子动力学模拟显示, 当噻托溴铵从M3受体的结合部位解离出去时, 要经历如图 5a箭头所示的路径, 图中的黑点代表了噻托溴铵的莨菪烷上的C3原子的踪迹, 最终停留在胞外受体的门庭处 (虚线圈附近); 若将噻托溴铵放到溶剂中 (图 5b), 分子所处的位置大致与图 5a的门庭处相同。用M2受体作动力学分子模拟, 由于跨膜蛋白的柔性和可移动性强于M3受体, 噻托溴铵在受体部位的驻留时间短, 较快地离开M2受体, 体现了动力学选择过程。图 5c是噻托溴铵与M3和M2结合与离解过程的自由能变化图, 与M3的复合物过渡态自由能高于M2, 显示出慢离解特征[9]。
去水合位点(dehydrons) 是蛋白质结构域中比较常见的现象, 它的发生是当可溶性蛋白在空间排布构成高级结构时, 在不相邻的氨基酸残基之间可形成氢键N-H…O=C, 如果由于所处的环境使该氢键一部分被水合、一部分被疏水性基团包围, 这样的氢键就不太稳定, 被认为是有缺陷的氢键, 这种氢键具有亲近疏水基团、“挤走”水分子的趋势, 因为氢键在疏水环境中更加稳定。去水合位点具有趋近、吸引和融合非极性基团的倾向, 易于接近配体的非极性基团, 因而利用存在的去水合位点在原有配体 (或药物) 的基础上可设计新的配体分子 (redesign), 从而提高选择性, 降低脱靶作用[10]。
利用水合位点进行重新设计的一个实例, 是对抗肿瘤药物伊马替尼 (1) 结构的再优化。前已述及, 伊马替尼是抑制Bcr-Abl和c-Kit激酶的抗肿瘤药物, 但由于脱靶作用而抑制心脏c-Kit激酶, 导致心肌细胞的ATP枯竭, 引起心脏损伤。对伊马替尼分子的再设计, 是利用Bcr-Abl和c-Kit激酶的结合部位存在多个去水合位点, 其中Bcr-Abl的Met318与Gly321之间形成了完全被疏水包裹的氢键, 而在c-Kit激酶结构域中的Cys673与Gly676生成的氢键是有缺陷的去水合位点, 因而, 如果在伊马替尼接近Cys673-Gly676的部位加入疏水性基团, 有可能提高和改变对c-Kit激酶的结合。图 6是化合物9 (WBZ_4, 在伊马替尼的吡啶环上连接4-甲基) 与Bcr-Abl和c-Kit激酶分子对接图, 甲基的引入干预了c-Kit去水合位点, 提高了肿瘤细胞c-Kit激酶氢键的稳定性和结合强度, 而对于心脏c-Kit的去水和位点影响小, 因而提高了抑制肿瘤的选择性作用[11, 12]。
5 受体相互作用蛋白1激酶抑制剂的研究本节所叙述的例子还未达到成药上市的阶段, 但从发现苗头和先导物、优化的理念和机制的论证, 所用的技术方法对于精准的药物研发有所借鉴[13]。
5.1 常规性普筛未能获得苗头化合物受体相互作用蛋白1激酶(receptor interacting protein 1 kinase, RIP1) 是肿瘤坏死因子介导的炎症和病理过程的重要驱动剂, 例如, 调控前炎性细胞因子的产生, 引起细胞凋亡, 以及下调TNF受体1的表达等, 因而是最近发现的治疗多种炎症的药物靶标。
为了发现先导物, GSK公司首先用既往研发激酶抑制剂所合成的化合物, 特别关注筛选结合于活性环套的DFG-out构象的2型抑制剂, 进行了广泛的筛选, 虽发现了活性化合物, 但由于分子尺寸大, 难以优化, 而且对其他激酶呈现泛抑制作用, 故而未作深入研究。
遂之用高通量方法筛选了200万个化合物, 得到的苗头化合物经优化结构, 化合物10有良好的体外活性与选择性, 然而对小鼠的口服利用度低, 成药的前景渺茫, 也终止了研究[14]。
5.2 筛选超大型DNA编码化合物库获得了有研发前景的苗头化合物为了发现新的结构类型,GSK筛选了自己构建的超大型DNA编码化学库 (DEL), 大约有77亿个结构多样性分子 (关于用DNA片段作为条形码分别标注和识别小分子化合物的DEL, 其原理与应用可参阅文献[15])。从中只发现极少数具有苯并噁氮䓬酮为母核的分子, 与RIP1有特异性结合。由于结构类型与已知的激酶抑制剂完全不同, 分析其结构和成药性前景, 认为有必要深入研究, 遂合成了相关的化合物, 其中11~13有较好的抑制RIP1 酶活性和细胞活性, 11的活性 (IC50酶 = 32 nmol·L-1; IC50细胞 = 16 nmol·L-1) 强于12和13, 进而合成11的对映体14(R构型), 考察活性与构型的关系, 结果表明14的活性完全丧失 (IC50酶 > 10 000 nmol·L-1), 提示化合物的S构型具有特异性。
5.3 优化S-构型的化合物结构化合物15是11的N-甲基化合物, 进一步提高了活性 (IC50酶 = 1.3 nmol·L-1; IC50细胞 = 10 nmol·L-1) 。同时还测定了这些化合物的结合动力学性质, 提示化合物15的离解速率显著低于其他化合物, t1/2结合 = 11 min (koff = 0.001 5 s-1), 进一步找到15高活性和高选择性的根据。
为了确定化合物15与RIP1结合的特征, 测定了化合物的光亲和标记作用 (photoaffinity label), 分别合成了在15的分子结构两端 (与RIP1结合的重要位置) 引入三氟甲基二氮杂环丙烷, 后者在光作用下, 开环形成活泼的亲电性基团, 对邻近氨基酸残基加以标记。经LC-MS分析表明与RIP1是1:1化学计量性结合, 被标记的位置分别是活化环套的Ser161和富含甘氨酸环套的Phe28残基, 从而定位了化合物15的结合模式。图 7是基于光亲和标记的质谱分析对化合物15与RIP1的分子模拟图, 可以看出分子的两端苯并噁氮䓬酮和苄基分别与两个环套的Ser161与Phe28发生结合。
进而还用同位素方法揭示15的结合特征。首先, RIP1经氢-氘交换将肽链上的H-N交换成D-N后, 质谱分析显示发生显著的变化的区域有: 富含甘氨酸残基的环套、活化环套、C螺旋和铰链。与化合物15低温温孵的质谱分析结果表明, 前3个区域的结合作用减退, 而铰链处质谱行为没有发生变化, 推论化合物15未同酶的铰链区结合。
5.4 化合物15与RIP1的晶体结构图 8是化合物15与RIP1复合物晶体结构图, 显示出化合物15埋藏在C-端和N-端结构域之间的腔穴内, 没有同铰链发生相互作用, 证实了上述氢-氘交换质谱分析的推论。苯并噁氮䓬酮环没有占据ATP的腺嘌呤位置, 而是处于α磷酸基的区域。因而15与RIP1的结合方式既不是1型抑制剂, 也不是纯粹作用于变构位点的2型抑制剂, 而属于激酶的3型抑制剂。
6 其他基于靶标结构的分子设计结合药物化学的构效关系分析, 在研发激酶抑制剂领域得到广泛的应用, 并有诸多的成功范例。例如针对黑色素瘤高表达的B-RafV600E变异激酶研发的维罗非尼 (16, vemuraf-enib)。靶标为间充质上皮转化因子激酶 (c-Met) 在肿瘤细胞中变异和高表达, 克唑替尼 (17, crizotinib) 不仅抑制 c-Met, 还抑制ALK蛋白激酶, 结合探针性试剂盒的应用对于ALK呈阳性表达的小细胞肺癌患者具有特异性治疗作用。诺华公司为克服伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病而产生的耐药性, 针对变异的激酶Bcr-AblM315I, 成功研制了第二代的抗耐药抑制剂尼洛替尼 (18, nilotinib)。针对在B细胞抗原受体的信号通路中起重要作用的Bruton酪氨酸激酶 (BTK), 成功设计的BTK激酶抑制剂依鲁替尼 (19, ibrutinib), 治疗B细胞恶性增生和风湿性关节炎, 该药物的分子结构中含有迈克尔加成基团, 接近于激酶开口处的Cys481, 与亲核性基团巯基发生共价结合, 提高了选择性作用。诺华公司研制的另一个靶向药物ribociclib (20) 是细胞周期蛋白依赖性激酶4和6 (CDK4/6) 双重抑制剂, 对激素成阳性 (HR+) 和表皮生长因子受体2呈阴性 (HER2-) 的绝经期妇女晚期乳腺癌疗效显著, 有望获得批准上市。靶向药物的研制为患者的个体化治疗提供了有针对性选择。
精准医学是在大数据网络时代和深化的分子医学相结合而产生的新的医疗理念, 药物作为治疗手段的供应侧, 对其品质提出了更高更精确的要求。在这方面最近出现的肿瘤免疫疗法可谓精准医疗的尝试, 把靶标蛋白的生理特征与抗原-抗体的结构高度互补性相结合, 克服了技术上一道道难关实现了某些肿瘤治疗的颠覆性的突破。尽管对抗原-抗体结合的三维结构尚不清晰, 但划时代的疗效引领了精准医学的实施和革新。
小分子药物的精准设计与此不同, 更依赖于对靶标的功能和三维结构的清晰了解, 通过基于结构的药物设计 (SBDD)、结构生物学、分子模拟和构效分析 (SAR等, 对分子的微观结构做到“精雕细刻”的优化, 同时将微观结构完全融汇到分子的宏观性质中, 满足物理化学和药代动力学 (ADME) 性质的要求。其中药物对靶标组织或器官的特异性分布(D) 仍属于药代的瓶颈, 是分子设计的盲区, 处于“打哪儿指哪儿”的宿命状态。以代谢组学为切入点, 也是精确药物设计和应用的重要领域。所以, 从更宽的视野考量药物, 最终体现在优于现有的标准治疗方法。新药研究任重道远。
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