2. 西南大学生命科学学院, 重庆 400715;
3. 西南大学药学院, 重庆 400715;
4. 西藏农牧学院药用植物研究中心, 西藏 林芝 860000;
5. 西南大学-西藏农牧学院药用植物联合研发中心, 重庆 400715
2. School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;
3. College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China;
4. Medicinal Plants Research Center, Tibet Agricultural and Animal Husbandry College, Nyingchi 860000, China;
5. SWU-TAAHC Medicinal Plants Joint R & D Centre, Chongqing 400715, China
托品烷类生物碱(tropane alkaloids, TAs)包括莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(anisodamine)[1]和东莨菪碱(scopolamine)[2], 主要提取自茄科植物的次生代谢产物, 如天仙子属(Hyoscyamus)、曼陀罗属(Datura)、颠茄属(Atropa)和莨菪属(Scopolia)等[3]。莨菪碱和东莨菪碱在临床医学上常常作为抗胆碱药物被广泛应用于副交感神经系统[4], 尤其是东莨菪碱, 是中枢麻醉药的主要成分[5], 其不良反应比莨菪碱小且药效更强, 因而价格更高。全球市场对东莨菪碱的需求量非常大, 仅在2004年, 其销售额已达到15亿美元[6]。在大多数茄科植物中, 莨菪碱的含量远高于东莨菪碱, 在过去的10年中, 常采用脱毒、杂交育种、射线诱变育种和多倍体育种等常规育种方法来提高东莨菪碱含量, 但均没有取得显著性的成效。随着植物生物技术不断发展, 利用代谢工程技术提高东莨菪碱产量已成为最近10年来该产业共同追求的目标。
颠茄(Atropa belladonna)是生产TAs的商业药用植物, 也是我国药典规定的TAs的药源植物[7], 但野生型颠茄中东莨菪碱含量极低, 仅为干重的0.01%~0.08%[8], 而莨菪碱的含量远高于东莨菪碱的含量, 其化学型属于莨菪碱型, 因此, 将颠茄从莨菪碱型转变为东莨菪碱型能够大幅度提高其药用和商业价值。在茄科植物中TAs合成起始于鸟氨酸和精氨酸的脱羧反应, 其代谢途径如图 1所示, 研究表明腐胺-N-甲基转运酶(putrescine-N-methyltransferase, PMT; EC 2.1.1.53)是合成途径中的第一个限速酶[9], 也是由初生代谢转向次生代谢的第一个关键酶, 催化腐胺(putrescine)的甲基化生成N-甲基腐胺(N-methylputrescine), 为TAs的合成提供前体物质。莨菪碱-6β-羟化酶(hyoscyamine-6β-hydroxlase, H6H; EC 1.14.11.11)是TAs生物合成途径中最后一个限速酶[10], 也是一个双功能酶, 具有羟基化和环氧化的作用, 通过催化莨菪碱的羟基化生成山莨菪碱, 而后继续催化山莨菪碱的环化生成东莨菪碱。PMT和H6H分别是TAs生物合成途径上的两个限速酶, 对东莨菪碱含量的积累起着重要的作用[11, 12], 因此编码PMT和H6H的两个基因常被用于研究TAs合成。本研究是在获得的T0代转NtPMT和HnH6H颠茄基础上, 采用自交法培育出T1代转基因颠茄并进行田间试验, 通过RT-PCR证明了NtPMT和HnH6H在转基因颠茄叶片均有表达, 采用HPLC分析了两种TAs含量, 结果表明过表达NtPMT和HnH6H后, T1代转基因颠茄东莨菪碱含量远高于非转基因颠茄东莨菪碱含量, 同时也发现T1代转基因颠茄东莨菪碱含量高于T0代, 实现了莨菪碱型颠茄向东莨菪碱型颠茄的转变, 从而大幅度地提高了颠茄的药用和商业价值。
材料 供试T0代转基因颠茄材料由西南大学培育, 采用颠茄无菌苗叶片为外植体, 根癌农杆菌LBA4404转化, 卡那霉素筛选获得转基因材料, 在转基因颠茄过表达烟草PMT和天仙子H6H基因, 该工作已经报道[13]。T1代转基因颠茄由西藏大学农牧学院繁育。采用T0代组培苗, 炼苗存活后移栽到西藏大学农牧学院药用植物园苗圃, 待其出现花蕾时, 用硫酸纸袋对花蕾套袋直到出现果实, 然后移除纸袋, 对果实进行标记, 待果实完全成熟后采收即获得T1代种子。T1代种子直接萌发成苗, PCR检测, 获得转基因阳性苗, 用于田间试验。T1代颠茄苗在温室长到10 cm左右时, 移栽至田间, 9月初植物果实完全成熟, 采集叶片和茎杆开展相关研究。对于分子检测材料, 采集后立即置于液氮速冻, -80 ℃保存备用; 对于生物碱含量分析材料, 采集后40 ℃烘干至恒重, 保存备用。
试剂 总RNA提取试剂盒为RNA Simple Total RNA Kit (TIANGEN); RNA反转录试剂盒为Fast Quant RT Kit (TIANGEN); Taq DNA聚合酶Trans Taq® DNA Polymerase High Fidelity; 本研究所用引物由上海英骏生物技术有限公司提供, 其他试剂均为国产分析纯试剂。
T0代转基因颠茄的获得 将含有PXI (PXI携带有NtPMT和HnH6H, 分别由35S启动子驱动)的LBA4404农杆菌转化颠茄叶盘, 通过含有kanamycin抗性的MS分化培养基筛选出具有抗性的颠茄, PCR鉴定后得到T0代转基因颠茄[13]。
DNA的提取及PCR的阳性鉴定 SDS法[14]抽提颠茄基因组DNA, 经电泳检测合格后用于PCR检测, PCR检测均采用野生型颠茄的基因组DNA作为阴性对照, 携带NtPMT和HnH6H的PXI质粒作为阳性对照。分别检测NtPMT和HnH6H, 引物序列见表 1。反应体系为: 2.5 μL 10 × PCR buffer、2.5 μL 2.5 mmol·L-1 dNTPs、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、0.25 μL Taq DNA polymers (5 U·μL-1)、DNA模板1 μL, ddH2O补至25 μL。反应程序为94 ℃预变性10 min, 35个循环(94 ℃变性30 s, 适当温度退火45 s, 72 ℃延伸45 s), 最后72 ℃延伸8 min。NtPMT的退火温度为56 ℃, HnH6H的退火温度为55 ℃。
RNA提取与cDNA合成 取适量颠茄样品在液氮中研磨, 按照RNA Simple Total RNA Kit说明书提取总RNA, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, HITACHI U-3010紫外可见分光光度计检测RNA纯度和浓度。按照Fast Quant RT Kit (TIANGEN)试剂盒说明书反转录获得第一链cDNA。
RT-PCR检测外源基因的表达情况 取1 μL反转录获得的第一条cDNA链为模板, 分别检测NtPMT和HnH6H表达情况, 以18S作为内参基因, 引物序列见表 1, 反应体系为: 2.5 μL 10 × PCR buffer、2.5 μL 2.5 mmol·L-1 dNTPs、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、0.25 μL Taq DNA polymers (5 U·μL-1)、cDNA模板1 μL, ddH2O补至25 μL。反应程序为94 ℃预变性10 min, 94 ℃变性30 s, 适当温度退火30 s, 72 ℃延伸20 s, 最后72 ℃延伸5 min。NtPMT的退火温度为58.6 ℃, 循环数为35; HnH6H的退火温度为58.2 ℃, 循环数为35; 18S的退火温度为57 ℃, 循环数为35。
生物碱的提取及HPLC检测 颠茄叶片和茎杆40 ℃烘干至恒重, 研磨成粉, 然后参照文献[15]发表的方法提取TAs用于HPLC检测。标准品均购自Sigma公司。HPLC检测使用岛津LC-60A高效液相色谱仪(泵: LC-6AD、柱温箱: CTO-10ASvp、控制器: SPD-20A), 色谱柱为Phenomenex Gemini 5 μ C18 110A液相色谱柱(250 mm × 4.6 mm), 流动相为甲醇-0.05 mol·L-1 pH 4.6醋酸胺缓冲液(流动相体系包含0.002 5 mol·L-1 SDS) (58:42), 流速1 mL·min-1, 柱温箱40 ℃, 检测波长226 nm, 进样量20 μL。
结果与讨论 1 T1代转基因颠茄种子萌发与田间种植将T0代自交法获得的D9系列转基因种子(T1代)播入装有营养土的花钵中, 温室萌发, 温度25 ℃, 光照16 h。待植株长至10 cm左右(图 2A), 可将其移栽至田间种植。转基因颠茄T1代和野生型颠茄在可见表型上没有明显区别, 这与本课题组在T0代转基因颠茄和野生型颠茄上观察的结果一致[13]。果实成熟期后, 可对地上部分材料进行分析(图 2B)。
通过提取T1代转基因颠茄基因组DNA, 然后利用基因组DNA作为模板, 通过PCR检测转基因植株中NtPMT和HnH6H的转入情况(图 3A), D9系列转基因颠茄均能检测到462 bp的NtPMT和1 044 bp的HnH6H片段, 而野生型颠茄却检测不到这两个基因, 说明所用于分析的颠茄材料是转基因阳性植株, T1代转基因颠茄PCR检测结果与T0代转基因颠茄PCR检测结果一致[13]; 通过RT-PCR分别分析野生型颠茄和T1代转基因颠茄NtPMT和HnH6H表达情况, 以18S作为内参(图 3B), 18S在野生型颠茄和转基因颠茄中均有表达, 而NtPMT和HnH6H仅在转基因颠茄中有表达, 说明所用于分析的转基因颠茄材料是NtPMT和HnH6H过表达颠茄, 因此这些材料可用于分析转基因颠茄TAs的含量。
本研究采用HPLC分别分析野生型颠茄和转基因颠茄叶片和茎杆中TAs的含量。东莨菪碱和莨菪碱标准品的保留时间分别为7.41 min和13.46 min (图 4A), 野生型颠茄样品(叶片)和转基因颠茄样品(叶片)的东莨菪碱和莨菪碱保留时间基本与标准品保留时间一致(图 4B、图 4C)。
在野生型颠茄样品中, 叶片和茎杆均能检测到莨菪碱(图 5A), 而在转基因颠茄叶片中只有D9-3、D9-6、D9-8能检测到极微量的莨菪碱, 其他转基因株系(叶片和茎杆)却检测不到, 野生型颠茄叶片富含高浓度的莨菪碱, 其在叶片中的含量很高(5.53~6.06 mg·g-1), 属于典型的莨菪碱型茄科植物, 检测的结果与已知报道结果相一致[13], 茎杆中莨菪碱含量很低(0.66~0.86 mg·g-1), 约为叶片莨菪碱含量的11%~16%。
在野生型颠茄和转基因颠茄样品中, 叶片和茎杆中均能检测到东莨菪碱(图 5B), 东莨菪碱在野生型颠茄叶片中的含量极低(0.25~0.30 mg·g-1), 而转基因颠茄叶片东莨菪碱的含量很高(4.68~9.09 mg·g-1), 约为野生型颠茄叶片东莨菪碱含量的15~36倍, 而转基因颠茄茎杆东莨菪碱的含量(1.03~2.59 mg·g-1)约为野生型颠茄茎杆东莨菪碱含量的37~108倍, 同时转基因颠茄叶片东莨菪碱含量高于茎杆东莨菪碱含量; 在野生型颠茄叶片和茎杆中主要以莨菪碱为主, 叶片中莨菪碱与东莨菪碱的比值约为22:1~30:1, 茎杆中莨菪碱与东莨菪碱的比值约为17:1~33:1, 而转基因颠茄叶片和茎杆中主要以东莨菪碱为主, 叶片中莨菪碱与东莨菪碱的比值约为1:115~1:340, 茎杆中莨菪碱检测不到, 莨菪碱和东莨菪碱在野生型和转基因型颠茄地上部分所占的比重发生了逆转。
讨论颠茄中的莨菪碱和东莨菪碱是TAs中极为重要的两种生物碱, 由于其显著的临床药用价值和巨大市场需求, 一直以来都是植物次生代谢领域研究的方向之一。随着代谢工程技术的不断发展, 对TAs的合成途径的研究逐步清晰, 这得益于对烟草、曼陀罗和莨菪等模式植物的研究, 而对于该代谢途径上两个关键酶基因(PMT和H6H), 分别在生化和转基因方面得到了深入的研究和验证。不同物种对PMT活性的调控有所差异, 在H.niger发根中过表达NtPMT后, 虽然PMT的直接产物N-甲基腐胺提高了4~5倍, 但是下游的莨菪碱和东莨菪碱却没有显著性变化[15], 说明在H.niger中PMT具有很高的N-甲基腐胺合成能力, 然而对于莨菪碱向东莨菪碱转化的能力是有限的; 在D.metel发根中过表达NtPMT后, 同样地, 虽然N-甲基腐胺提高了2~4倍, 但是莨菪碱和东莨菪碱以及另一条支路上的尼古丁含量却没有显著性变化[16]; 而Sato等[17]在A.belladonna和Nicotiana sylvestris过表达NtPMT后, 却得到了相反的结果, 过表达NtPMT的颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量没有显著性变化, 但是过表达NtPMT的N.sylvestris却提高了尼古丁含量, 说明虽然脱品烷生物碱和尼古丁的合成共用上游的一个途径, 但是当下游途径不同以及物种不同时对PMT的调控是有差别的; Moyano等[18]在Datura metel和Hyoscyamus muticus发根中超表达了NtPMT后, 莨菪碱和东莨菪碱的积累都得到了显著的提高, 这是首次单转PMT后提高TAs含量的成功例子; Suzuki等[19]的研究表明, PMT主要在中柱鞘中表达, 是一个组织特异性表达基因, 而在35S启动子的驱动下, 通过改变PMT的表达调控模式而不是通过提高PMT的活性来提高TAs的含量, 从而说明了TAs的合成是一个非常复杂的调控, 而这个调控会因物种的不同而有很大的差异。与PMT作用不同, H6H催化莨菪碱向东莨菪碱的代谢流动, H6H的表达量与东莨菪碱生物合成量呈正相关性[20], 在多种TAs植物中过表达H6H后都无一例外地提高了东莨菪碱的产量, 目前已有10多个物种的H6H被克隆并报道。1992年Yun等[21]在颠茄中过表达HnH6H后, 与野生型颠茄相比, 地上部分莨菪碱含量大幅度下降, 而东莨菪碱含量大幅度提高; 而后又有在D.innoxia[22]和A.baetica[23]发根中过表达HnH6H的报道, 东莨菪碱含量提高了3和9倍之多。从上面几个例子可以看出, 相比较于其他物种的H6H, HnH6H是被研究的比较透彻的一个酶且活性相对比较高[24], 因而HnH6H常作为研究TAs代谢途径的候选基因。
多个限速酶控制的代谢途径, 一个限速酶量的增加会限制后续的反应, 因而终产物提高的量不明显, 大多数单转PMT所取得的效果可以例证这个观点, 因而可以考虑采用多个关键酶的协同作用。PMT和H6H是TAs合成途径上两个关键酶, 控制着TAs的代谢流程, 近10年来, 通过共表达TAs合成途径上PMT和H6H两个关键酶的基因, 对提高东莨菪碱产量取得了显著成效。2004年, Zhang等[25]在天仙子发根中共表达NtPMT和HnH6H, 这两个基因的协同作用使得东莨菪碱含量得到极大提高; 随后, 在颠茄发根中共表达这两个基因, 东莨菪碱含量也有所提高[26]; 2013年, 本研究组在颠茄发根中共表达内源PMT和H6H[8], 4个转基因发根系东莨菪含量都有提高, 最优提高了8.2倍; 2011年本研究组首次获得共表达NtPMT和HnH6H的T0代颠茄植株[13], 并对获得的5个转基因株系进行基因表达和东莨菪碱含量分析, 其结果显示在5个转基因株系中, D9系列的HnH6H表达量最高, 其东莨菪碱含量提高倍数最大, 是野生型颠茄的7.3倍。
本文在已经获得的T0代东莨菪碱含量最高的D9转基因株系的基础上, 采用自交法培育出T1代转基因颠茄, 同时选择在高海拔、高紫外辐射和干旱的西藏林芝地区进行了田间试验, 并分析NtPMT和HnH6H在T1代转基因颠茄叶片中的表达情况及地上部分莨菪碱和东莨菪碱的含量, 通过与T0代比较, T1代转基因颠茄叶片提高东莨菪碱的倍数更高。在茄科植物中, 生物碱的合成及储存是在植物的不同部位进行, 生物碱主要是在须根中合成, 通过一系列的转运蛋白运输后, 最终储存在植物叶片的液泡中[27], 因而叶片中生物碱含量高于其他部位, 这与Yun等[21]在颠茄中过表达HnH6H所报道的结果一致。对AbH6H的酶活分析可知[24], 相比较于HnH6H, AbH6H的环氧化活性极低, 因而对于颠茄来说, H6H的环氧化活性是TAs合成的限速步骤, 从而导致野生型颠茄地上部分东莨菪碱的含量极低, 但是对于东莨菪型的物种来说, 如天仙子, 其HnH6H的高环氧化活性就不影响东莨菪碱的合成[28], 而共表达NtPMT和HnH6H后, 使得颠茄的环氧化活性得到加强, 打通了下游限速瓶颈, 促使莨菪碱向东莨菪碱的转化, 同时在NtPMT的作用下, 使得TAs的前体物N-甲基腐胺不断地流向下游, 改变了颠茄本身的TAs合成调控模式。利用植物代谢工程的方法来提高颠茄东莨菪碱的含量, 实现了颠茄从莨菪碱型向东莨菪碱型的转变, 这是用传统的方法所不能达到的效果, 因此, 可以通过选育出高产东莨菪碱的T1代转基因颠茄进行培育, 将有可能实现用高产东莨菪碱颠茄来代替化学型为东莨菪碱的茄科植物如天仙子和洋金花。
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