药学学报  2016, Vol. 51 Issue (12): 1885-1890   PDF    
LC-MS/MS法测定人血浆中的安纳拉唑及药动学初步应用
程东霞1,2, 戴晓健2, 张逸凡2, 吴永谦3, 石崇铁3, 马西凤3, 李晋3, 陈笑艳2, 钟大放1,2     
1. 浙江工业大学药学院, 浙江 杭州 310014;
2. 中国科学院上海药物研究所, 上海 201203;
3. 山东轩竹医药科技有限公司, 山东 济南 250100
摘要: 安纳拉唑是处于临床试验阶段的口服用质子泵抑制剂。本文建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定人血浆中的安纳拉唑,并用于研究饮食对其在中国健康人体内的药动学影响。采用d313C-安纳拉唑作内标,血浆样品经乙腈沉淀蛋白后,经Extend C18(100 mm×4.6 mm,3.5 μm)色谱柱分离,线性范围为5.00~3 000 ng·mL-1r2>0.995)。本方法成功应用于14名健康受试者空腹及高脂餐后口服40 mg安纳拉唑钠肠溶片的药动学研究。受试者空腹给药后Cmax为(1 020±435)ng·mL-1,AUC0-t为(2 370±754)h·ng·mL-1,高脂餐后给药后Cmax为(538±395)ng·mL-1,AUC0-t为(1 610±650 h·ng·mL-1。与空腹给药相比,饮食条件下安纳拉唑的Cmax降低约47%,AUC0-t降低约32%。结果表明,进食会减少安纳拉唑在人体中的吸收。
关键词: 液相色谱-串联质谱     安纳拉唑     质子泵抑制剂     人体药动学    
Determination of anaprazole in human plasma by LC-MS/MS in pharmacokinetic study
CHENG Dong-xia1,2, DAI Xiao-jian2, ZHANG Yi-fan2, WU Yong-qian3, SHI Chong-tie3, MA Xi-feng3, LI Jin3, CHEN Xiao-yan2, ZHONG Da-fang1,2     
1. College of Pharmacy, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;
2. Shanghai Institute of Materia Medica, Shanghai 201203, China;
3. Xuan Zhu Pharma Co., Ltd., Jinan 250100, China
Abstract: Anaprazole is a proton pump inhibitor clinically used for curing peptic ulcer. A rapid, sensitive and convenient LC-MS/MS method was first established for the determination of anaprazole in human plasma. d3, 13C-anaprazole was used as internal standard (IS). After extraction from human plasma by protein precipitation with acetonitrile, all components were separated on an Extend C18 column (100 mm×4.6 mm, 3.5 μm). The assay was linear over the concentration range of 5.00-3 000 ng·mL-1 (r2 > 0.995). The method was successfully applied to a pharmacokinetic study of 40 mg anaprazole enteric-coated tablets in 14 Chinese healthy volunteers under fasting or high fat diet conditions. Cmax was (1 020±435) ng·mL-1 and AUC0-t was (2 370±754) h·ng·mL-1 under fasting condition. And Cmax was (538±395) ng·mL-1 and AUC0-t was (1 610±650) h·ng·mL-1 under high fat diet condition. The plasma results suggest that the exposure of anaprazole is reduced by the high fat diet.
Key words: LC-MS/MS     anaprazole     proton pump inhibitor     clinical pharmacokinetics    

安纳拉唑(anaprazole, 结构式见图 1)是山东轩竹医药科技有限公司研发的结构新颖的口服用质子泵抑制剂, 硫原子手性中心为R构型[1]。它通过与胃壁细胞分泌小管表面的H+/K+-ATPase酶作用, 抑制胃酸分泌过程的最后一步, 拟用于治疗胃溃疡、十二指肠溃疡和反流性食管炎。此类质子泵抑制剂在人体中的吸收受食物影响较大, 从而影响药效。因此, 研究食物对安纳拉唑的药动学影响具有很大的临床意义。

Figure 1 Product ion mass spectra of protonated molecules obtained from anaprazole (A) and its IS d3, 13C-anaprazole (B)

目前, 运用LC-MS/MS法研究其他质子泵抑制剂的药动学生物分析方法已有许多相关报道[2-6]。安纳拉唑目前处于临床试验阶段, 尚未见药动学相关报道。本实验旨在建立快速、灵敏、简便的LC-MS/MS法测定人血浆中的安纳拉唑, 并将验证后的方法应用于评价高脂餐对中国健康成人受试者单次口服安纳拉唑肠溶片药代动力学的影响, 为临床应用提供依据。

材料与方法

安纳拉唑钠(含量98.8%)、d3, 13C-安纳拉唑钠和安纳拉唑钠肠溶片(规格:每片20 mg)均由山东轩竹医药科技有限公司提供, 甲醇(德国Merck公司)、乙腈(德国Merck公司)、氨水(德国Fluka公司)、醋酸铵(美国ROE公司)均为色谱纯, 去离子水由Millipore纯水仪制备。

仪器  Triple Quad 5500型三重四极杆串联质谱仪, 配备大气压电离源(APCI源), 加拿大Sciex公司; 液相色谱系统, 包括DGU-20A3型脱气机、LC-20AD液相色谱泵、SIL-20AC型自动进样器和CTO-20A型柱温箱, 日本岛津公司。

色谱条件  分析柱: Extend C18色谱柱(100 mm × 4.6 mm, 3.5 μm, 美国安捷伦公司); 预柱: C18保护柱(4.0 mm × 3.0 mm, 5 μm, 美国Phenomenex公司); 流动相: A相(含0.005%氨水的5 mmol·L-1醋酸铵)-B相(乙腈); 流速: 0.7 mL·min-1; 进样量: 10.0 μL。

质谱条件  离子源: APCI源; 雾化电流: 3.0 μA; 离子源温度: 500 ℃; 离子源气体1 (N2)压力: 50 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa); 驻留时间100 ms; 气帘气体(N2)压力: 30 psi; 碰撞气压力(CAD): 8 psi; 去簇电压(DP)均为80 V; 碰撞能量均为25 eV; 正离子方式检测; 扫描方式为多反应监测模式(MRM)。待测物的离子反应分别为: m/z402.2→242.2 (安纳拉唑)、m/z406.2→246.2 (d3, 13C-安纳拉唑)。

标准系列样品和质控样品的制备  精密称取两份安纳拉唑钠对照品适量, 一份用于标准系列样品的制备, 一份用于质控样品的制备。分别用甲醇溶解并稀释, 获得质量浓度均为1.00 mg·mL-1左右的安纳拉唑储备液, 再以甲醇-水(50:50, v/v)稀释该储备液, 获得一定质量浓度的标准系列溶液: 0.250、0.500、1.50、4.00、10.0、25.0、75.0和150 μg·mL-1, 分别取上述标准系列溶液20 μL, 加入人空白血浆980 μL, 获得安纳拉唑的质量浓度为5.00、10.0、30.0、80.0、200、500、1 500和3 000 ng·mL-1的人血浆标准系列样品。以乙腈稀释内标储备液(0.700 mg·mL-1), 获得质量浓度为1.00 μg·mL-1的内标工作溶液。采用人空白血浆配制QC样品[安纳拉唑加入质量浓度为: 5.00 ng·mL-1 (LLOQ)、15.0 ng·mL-1 (LQC)、300 ng·mL-1 (MQC)和2 400 ng·mL-1 (HQC)]均储存于-70 ℃条件下备用。

血浆样品预处理  血浆样品预处理采用蛋白沉淀法。向100 μL血浆样品中分别加入内标工作溶液25 μL和乙腈500 μL, 涡流混合1 min后, 离心(14 000 r·min-1, 5 min), 取上清液40 μL加入流动相160 μL, 混匀, 取10.0 μL进行LC-MS/MS分析。

方法验证  对建立的方法进行方法验证, 参照中国药典2015年版指导原则[7]和欧盟EMA相关指导原则[8], 从方法的选择性、标准曲线和定量下限、精密度和准确度、稳定性、回收率、基质效应和重现性等方面进行方法验证。

选择性  分别取6个不同来源的人空白血浆样品以及用相应人空白血浆配制的LLOQ样品进行LC-MS/MS分析测定, 考察不同来源空白血浆中的内源性物质是否干扰待测物及内标的测定。接受标准为:测得的LLOQ样品值应为空白血浆基线值加上安纳拉唑的加入浓度, 其偏差应在±20%之内, 空白样品中的内标通道响应不超过LLOQ样品的5%。取标准曲线最高点ULOQ (安纳拉唑加入质量浓度为3 000 ng·mL-1), 除不加内标外, 按“血浆样品预处理”项下操作, 平行制备6样本, 作为ULOQ (无内标)样品, 以此考察待测物对内标的影响。

标准曲线  5.00~3 000 ng·mL-1 8个浓度点, 按照“血浆样品预处理”项下操作, 以每个待测物浓度为横坐标, 待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标, 采用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算, 得到的直线回归方程即为标准曲线。

精密度与准确度  取低、中、高3个浓度(安纳拉唑加入质量浓度分别为15.0、300和2 400 ng·mL-1)的QC样品, 按“血浆样品预处理”项下操作, 每一浓度进行6样本分析并在3日内测试, 根据当日标准曲线计算QC样品的测得浓度并根据QC样品结果计算本方法的日内、日间精密度与准确度。

基质效应  分别取6份不同来源的人空白血浆和1份溶血的人空白血浆100 μL, 分别加入乙腈500 μL, 涡流混合1 min后, 离心(14 000 r·min-1, 5 min), 取上清液575 μL, 加入内标工作溶液25 μL和对照质控溶液25 μL (安纳拉唑溶液质量浓度为60.0和9 600 ng·mL-1), 涡流混匀后进样分析, 得到相应峰面积(A)。同时另取水100 μL代替空白血浆, 按上述方法处理后得到相应峰面积(B)。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应, 公式为A/B×100%, 并以分析物和内标的基质效应比值计算内标归一化的基质效应。

回收率  采用人空白血浆配制低、中、高三个质量浓度(15.0、300和2 400 ng·mL-1)的血浆样品, 按“血浆样品预处理”项下操作, 每一质量浓度进行6样本分析。同时另取人空白血浆100 μL, 加入乙腈500 μL, 涡流混合1 min后, 离心(14 000 r·min-1, 5 min), 取上清液575 μL, 加入内标工作溶液25 μL和对照质控溶液25 μL (安纳拉唑溶液质量浓度为60.0、1 200和9 600 ng·mL-1), 涡流混匀后进样分析, 获得相应峰面积(n=3)。用提取后的色谱峰面积与未经提取获得的色谱峰面积之比计算处理回收率。

稳定性  考察安纳拉唑人血浆样品室温放置6 h、经沉淀蛋白处理后室温放置24 h、血浆样品经历3次冷冻-解冻循环和-70 ℃放置71天的稳定性。

实验样品再分析  本实验选取了48个血浆样品进行再分析, 占总样品数量的10%左右。ISR样品的选取标准为达峰浓度点附近及消除相末端浓度点(浓度为定量下限3倍左右)。按“血浆样品预处理”项下操作, ISR测得的样品浓度与初始浓度相比, 至少67%的样品浓度差异应在±20%以内。

人体药动学研究及数据分析  临床试验经北京大学第三医院伦理委员会审核批准, 选取14例健康男性受试者, 签署知情同意书后, 采用双周期随机交叉试验。将其随机分成A、B两组, 每组各7名受试者。试验分成两周期:第I周期A组受试者空腹口服试验用药, B组受试者开始进食高脂高热量早餐后30 min口服试验用药; 第II周期是在首次用药后第7天两组受试者交叉服药方式。两周期均采用单次口服给药, 给药剂量均为40 mg, 在每一周期给药前(给药前10 min内)及给药后1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、10、12、15和24 h采集静脉血3 mL至抗凝采血管中, 混匀后在0.5 h内置于低温离心机中, 4 ℃下离心(3 000 r·min-1, 10 min), 获得的血浆样品于-70 ℃或以下冷冻保存待测。

所得的血药浓度-时间数据采用Phoenix WinNonlin®6.3 (美国Pharsight公司)软件以非房室模型计算待测物的药动学参数。

结果 1 质谱分析

由于安纳拉唑的结构中含有碱性氮原子, 质谱电离时易获得质子, 优先选择正离子检测方式。通过比较实验发现, 待测物在APCI源条件下的准确度和重现性较ESI源好, 因此本实验选择APCI (+)模式对待测物进行定量分析。在正离子检测模式下, 安纳拉唑与内标分别主要生成m/z402.2和m/z406.2的[M+H]+峰。选择性对[M+H]+峰进行产物离子扫描分析, 安纳拉唑生成的主要碎片离子为m/z242.2, 内标生成的主要碎片离子为m/z246.2, 通过对碰撞能量和去簇电压的条件优化, 分别选择监测产生的主要碎片离子m/z242.2和m/z246.2作为定量分析检测的产物离子, 待测物及内标的[M+H]+产物离子全扫描质谱图见图 1

2 色谱

图 2可见, 空白血浆样品的色谱图中背景干扰很低。安纳拉唑和同位素内标的保留时间分别为2.41 min和2.37 min, 两者保留一致。容量因子约为0.61。

Figure 2 Typical LC-MS/MS chromatograms of anaprazole and d3, 13C-anaprazole (IS). A: Human blank plasma; B: Human blank plasmaspiked with IS; C: LLOQ (5.00 ng·mL-1) sample spiked with IS; D: Human plasma sample spiked with IS of 5 h after an oral administration at dose of 40 mg anaprazole; Peaks I and II refer to anaprazole and d3, 13C-anaprazole, respectively
3 方法学验证 3.1 选择性

结果表明, 空白人血浆中的内源性物质不干扰安纳拉唑和内标的测定, 且同位素内标不干扰待测物的测定, 待测物对内标也无影响。典型色谱图见图 2

3.2 标准曲线和定量下限

求得的标准曲线的相关系数(r2)均大于0.99。根据标准曲线, 定量分析方法的线性范围为5.00~3 000 ng·mL-1。典型标准曲线方程为: y=0.003 19 x + 0.000 481 (r2=0.998 4)。取LLOQ血浆样品(安纳拉唑加入质量浓度为5.00 ng·mL-1), 进行6样本分析, 连续测定3天, 并根据当日标准曲线计算每一样本测得质量浓度。求得该质量浓度安纳拉唑的日内精密度为5.1%, 日间精密度为6.4%, 准确度(RE)为-0.8%, 该结果表明LC-MS/MS法测定人血浆中安纳拉唑定量下限可达5.00 ng·mL-1

3.3 精密度与准确度

安纳拉唑每一浓度水平的QC样品的日内精密度小于5.8%, 日间精密度小于3.7%, 准确度(RE)在-5.9%~1.2%之间。待测物QC样品测试结果均符合生物样品测定有关要求。

3.4 回收率和基质效应

采用蛋白沉淀法可获得较好的回收率。安纳拉唑在低、中、高三浓度的回收率分别为99.4%、101%和96.1%。安纳拉唑在低、高两浓度经内标校正后的基质效应分别为103%和99.7%, 相对标准差分别为1.7%和1.5%。内标d3, 13C-安纳拉唑的基质效应为101%。结果表明, 待测物在本实验选择的色谱和质谱条件下, 可忽略基质效应的影响。

3.5 稳定性和试验样品再分析

实验结果表明, 在上述条件下安纳拉唑低、高两浓度血浆样品均稳定, 准确度在-2.8%~8.2%之间, 数据符合相关接受标准。实验结果还表明, 试验样品再分析结果与原始值的差异在-9.3%~5.1%之间, 100%达到了接受标准。

4 人体药动学研究

将所建立并经过验证的此方法应用于安纳拉唑的人体药动学研究。14例健康男性受试者单次口服安纳拉唑钠肠溶片(每人每次40 mg), 空腹和餐后药时曲线见图 3, 药动学参数见表 1

Figure 3 Plasma concentration-time curves of anaprazole after oral administration at dose of 40 mg in healthy Chinese volunteers. A: Under fasting condition; B: Under high-fat meal condition

Table 1 Pharmacokinetic data of anaprazole in human plasma under fast or high-fat meal condition
讨论

考察了临床前试验所采用的Gemini C18 (50 mm × 2.0 mm, 5 μm, 美国Phenomenex公司)柱, 发现色谱峰峰宽较宽且拖尾, 考虑到流动相为碱性, 改用了更适合碱性环境的Extend C18柱, 从而改善了峰形, 得到了尖锐且对称的峰。本实验还考察了流动相中有机相的比例, 通过尝试不同比例的有机相, 最终确定40%乙腈作为有机相。采用操作简便的蛋白沉淀法, 血浆用量100 μL, 用量较少。

健康中国人高脂餐后口服安纳拉唑钠肠溶片与空腹给药相比, 安纳拉唑的tmaxCmax在两种给药方式间的差异显著(P < 0.01), 餐后给药达峰时间延长。与空腹给药相比, 餐后给药血浆中安纳拉唑的达峰时间延长约2.5 h, Cmax降低约47%, AUC0-t降低约32%。Vaz-da-Silva等[9]在对奥美拉唑两种包衣制剂的生物利用度和生物等效性的研究中发现, 食物对Cmax和AUC0-t有显著影响, 与空腹给药相比, 餐后给药血浆中Cmax降低约63%, AUC0-t降低约38%。对奥美拉唑[10]、埃索美拉唑[11]、兰索拉唑[12, 13]、泮托拉唑[14]的药动学研究也发现, 食物会使生物利用度降低。本实验结果发现, 安纳拉唑与其他质子泵抑制剂的药动学受进餐影响相似。

图 3中看出, 安纳拉唑药动学在受试者中存在明显的个体差异, 这与其他质子泵抑制剂性质相似。然而图 4显示, 不同受试者空腹和餐后口服安纳拉唑钠肠溶片药动学多呈现交叉变化, 只有个别受试者的Cmax和AUC0-t偏低。虽然Andersson等[15]发现奥美拉唑的血药浓度有明显的个体差异系由药物代谢酶遗传多态性引起, 但体外CYP酶亚型代谢稳定性实验结果表明安纳拉唑属多酶代谢, 所以安纳拉唑药动学的个体差异可能与个体的整体代谢功能有关, 而非与P450酶的基因多态性相关。

Figure 4 The AUC0-t and Cmax in plasma of anaprazole after oral administration at dose of 40 mg in healthy Chinese volunteers under fasting and high-fat meal condition
致谢:北京大学第三医院开展临床试验。
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