原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤, 严重威胁人类健康, 近年来, 其发病率和致死率呈逐年上升的态势[1, 2], 在抗肿瘤药物研究中, 天然产物取得了显著的疗效。长白山珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)属蔷薇科植物, 有活血化瘀、消肿止痛、抗炎和抗肿瘤的作用。前期研究发现, 珍珠梅抗肿瘤主要成分为5, 2', 4'-三羟基-6, 7, 5'-三甲氧基黄酮(5, 2', 4'-trihydroxy-6, 7, 5'-trimethoxyflavone, TTF1)单体化合物, 并发现其抗肿瘤生长作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞血管生成有关[3, 4]。为增加其水溶解性, 本课题组以硬脂酸为载体, 制备生物体可降解吸收的、直径在150~200 nm之间的新剂型TTF1纳米粒(TTF1-NP)[5]。
信号传导与转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是STAT家族重要成员。本课题组前期研究发现, STAT3参与大鼠原发性肝癌发生过程, 并在成癌过程中大量活化表达[6]。近年来, 许多学者研究表明天然植物中提取的有效抑癌成分通过抑制STAT3活化表达, 可以促进肿瘤细胞凋亡, 抑制其增殖[7, 8], 推测STAT3有望成为潜在肝癌治疗新药筛选的靶点。本研究以人肝癌HepG-2细胞为研究对象, 探讨TTF1-NP对STAT3的影响, 以及抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的抗肿瘤效应, 为进一步开发利用珍珠梅提供理论和实验依据。
材料与方法 药品和试剂TTF1-NP由延边大学药学院关丽萍教授惠赠; LipofectamineTM 2000 (Lipo 2000)、DMEM培养液、胰酶(美国Invitrogen公司); STAT3-siRNA (吉玛基因股份有限公司); STAT3过表达质粒(通用生物系统有限公司); 小牛血清、青链霉素及DMSO (美国Gibco公司); STAT3和p-STAT3抗体(英国Abcam公司)、cleaved caspase-3和survivin单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司); β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司); 羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG (中杉金桥股份有限公司); Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(美国BD公司); Hoechst荧光染料(碧云天生物技术研究所); MTT (美国Sigma公司); SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Solarbio试剂公司); ECL发光试剂盒(美国Merck millipore公司)。
细胞培养人肝癌HepG-2细胞、正常肝Chang liver细胞购买于南京凯基生物制品有限公司。细胞培养于DMEM培养液中(含10%胎牛血清、100 g·L-1青霉素及100 g·L-1链霉素), 培养条件为37 ℃、5% CO2、湿度95%, 细胞生长对数期进行传代、备用。
MTT检测取对数生长期的HepG-2和Chang liver细胞接种于96孔板中(1×105个/孔)。细胞贴壁后, 分为含25、50、100、200和400 μmol·L-1 TTF1-NP实验组和DMEM常规培养的空白对照组(vehicle), 分别培养6、12、24、36和48 h, 加入MTT溶液, 培养4 h, 加入DMSO, 测定490 nm处各孔内吸光度值(A), 计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(1 -A样本 / A空白对照组) × 100%。
HE染色贴壁生长的细胞, 胰酶消化, 调整细胞数约为每毫升1×105个, 滴加于盖玻片上, 培养后, 于96孔板中取出细胞爬片, PBS洗涤, 95%乙醇固定, PBS洗涤, 苏木素染液染核, 用1%盐酸酒精溶液分色, 浸入伊红染液染胞质, 吹干或自然晾干细胞爬片后, 中性树胶封片。
Hoechst 33258染色50、100和200 μmol·L-1 TTF1-NP实验组和DMEM常规培养的空白对照组(vehicle), 分别培养6、12、24、36和48 h后, PBS清洗, 4%多聚甲醛固定, PBS清洗, Hoechst 33258染色, 避光, 荧光显微镜检测并拍照。
免疫细胞化学检测TTF1-NP实验组(50、100、200 μmol·L-1)细胞分别于96孔板爬片内培养6、12、24、36和48 h, 将各实验组细胞清洗后, 4%多聚甲醛固定, 山羊血清室温封闭。加入一抗STAT3 (1:200)、p-STAT3 (1:500), 4 ℃孵育过夜, PBS清洗后二抗(1:1 000) 37 ℃孵育2 h。PBS清洗后加入DAB显色液, 避光孵育。PBS清洗, p-STAT3抗体孵育组加苏木素复染色, PBS清洗, 二甲苯内浸泡, 晾干, 中性树胶封片。
流式细胞仪检测将待检测的各组细胞收集到离心管内, 离心, 制成细胞悬液。离心后弃去液体, 用结合缓冲液重悬细胞, 室温避光孵育, 加入Annexin V, 避光室温静止。离心, 弃去液体, 重新加入结合缓冲液重悬细胞, 加入碘化丙啶(PI), 避光孵育。检测后用FACS Diva 4.1软件对结果进行分析, 结果以凋亡细胞的百分率表示。
免疫印迹技术检测提取各实验组总蛋白。用BCA法测定蛋白的浓度, 并根据蛋白标准品的浓度标准曲线, 计算出各组样品的蛋白浓度。制备相关分子质量的凝胶, 加样, 电泳(80 V, 60~90 min), 转膜(100 V, 30~60 min)。5%脱脂奶粉中室温封闭1 h, 加入一抗STAT3 (1:1 000)、p-STAT3 (1:5 000)、survivin (1:1 000)、cleaved-caspase 3 (1:1 000)和β-actin (1:1 000), 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜后加入二抗(1:5 000), 室温封闭2 h, ECL显影液孵育, 显影、拍照, 应用Image J软件对所得条带进行灰度分析。
STAT3-siRNA干扰STAT3特异性片段STAT3-siRNA和碱基顺序随机片段NC-siRNA (阴性对照)由吉玛基因公司合成。将待干扰HepG-2细胞分为6组(vehicle、NC、siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4), 细胞培养, 稀释siRNA, 室温孵育, 稀释Lipo 2000, 两者混匀, 室温孵育20 min。待细胞密度达到50%时, 将siRNA-Lipo 2000混合液加入培养孔中, 培养4~6 h后, 更换新鲜培养基继续培养48 h, 收集细胞提取总蛋白, 利用免疫印迹技术筛选STAT3干扰最佳siRNA序列。
STAT3过表达质粒构建及转染携带STAT3基因全长的质粒由通用生物系统有限公司合成, 经BLAST查询, 确定是STAT3的特异性序列, 同时排除与其他基因同源。转染前一天将待转染HepG-2细胞以1×105个/孔接种于细胞培养板中, 使转染时细胞密度能够达到50%。稀释质粒, 稀释Lipo 2000, 混匀, 室温孵育; 将质粒-Lipo 2000混合液加入培养孔中, 混匀后培养4 h, 更换新鲜培养基继续培养48 h, 收集细胞提取总蛋白, 免疫印迹检测筛选转染情况。
数据处理所有数据均采用x±s表示, 采用单因素方差分析统计, P < 0.05有显著性统计意义, P < 0.01有极显著性统计意义。
结果 1 TTF1-NP对人肝癌HepG-2细胞增殖的抑制作用MTT检测发现, 25、50、100、200和400 μmol·L-1 TTF1-NP实验组细胞生长抑制率(%)分别为: 13.5±3.1、21.8±3.1、44.8±2.8、72.1±2.7和78.4±3.1。TTF1-NP (400 μmol·L-1)作用人正常肝Chang liver细胞, 其生长抑制率(%)仅为30.9±2.1, 见图 1A。经软件计算后人肝癌HepG-2细胞的IC50值为: 98.26 μmol·L-1。用100 μmol·L-1 TTF1-NP处理人肝癌HepG-2细胞6、12、24、36和48 h, HepG-2细胞生长抑制率(%)分别为: 5.9±0.8、14.3±2.9、29.9±2.8、45.5±2.0和54.8±1.9;随着作用时间的延长, TTF1-NP也抑制人正常肝Chang liver细胞生长, 与vehicle组比较, 差异无统计学意义(P > 0.05), 见图 1B。
随着TTF1-NP剂量增加、作用时间延长, 人肝癌HepG-2细胞减少, 细胞变小、变圆、细胞核固缩、边移、深染, 出现明显凋亡形态, 见图 2A, B; TTF1-NP处理后的HepG-2细胞可见蓝白色荧光的凋亡细胞, 见图 2C, D; 不同浓度(50、100、200 μmol·L-1) TTF1-NP实验组HepG-2凋亡率(%)分别为: 22.5±1.9、55.1±4.7和80.7±5.3, 100 μmol·L-1 TTF1-NP作用HepG-2细胞不同时间, 其凋亡率(%)分别为: 5.6±1.2、9.8±2.3、57.8±9.19、66.6±4.9和70.45±5.7, 见图 2E, F; 随着TTF1-NP作用浓度增加、作用时间延长, 蛋白cleaved caspase-3表达增加, survivin蛋白表达下降, 见图 2G~J。
不同浓度(50、100、200 μmol·L-1) TTF1-NP作用于人肝癌HepG-2细胞, STAT3、p-STAT3蛋白表达明显受到抑制, 呈浓度依赖性(P < 0.05, P < 0.01);随着TTF1-NP作用时间的延长, HepG-2细胞STAT3、p-STAT3蛋白表达抑制越明显, 呈时间依赖性(P < 0.05, P < 0.01), 见图 3A~D。免疫细胞化学染色发现, vehicle组细胞STAT3蛋白呈深棕色, 胞浆胞核均大量表达, p-STAT3蛋白呈深棕色, 胞核内大量表达; TTF1-NP处理后细胞数量明显减少, STAT3、p-STAT3蛋白颜色逐渐降低, 与免疫印迹检测蛋白表达结果基本一致, 见图 3E。
人肝癌细胞HepG-2经STAT3不同siRNA序列干扰后, 相对于vehicle组和NC组, siRNA3组STAT3、p-STAT3蛋白表达明显下降, 见图 4A, siRNA3干扰组效果最佳。因此, 选择siRNA3位点(5' AUAAAG CCCAUGAUGUACCTT 3')为后续实验干扰位点。Vehicle组、TTF1-NP组(100 μmol·L-1)、siRNA组和siRNA+TTF1-NP (100 μmol·L-1)组HepG-2细胞凋亡率(%)分别为: 7.6±1.2、52.2±3.3、33.6±4.5和40.2±8.4。结果表明, siRNA沉默STAT3可诱导细胞凋亡, siRNA+TTF1-NP组比siRNA沉默STAT3组凋亡率高, 见图 4B; 与vehicle组比较, TTF1-NP组、siRNA组和siRNA+TTF1-NP组survivin蛋白表达降低, cleaved caspase-3蛋白表达升高(P < 0.05), 见图 4C, D。
脂质体转染STAT3表达载体质粒, STAT3过表达后人肝癌HepG-2细胞STAT3过表达组的STAT3、p-STAT3蛋白表达相对于vehicle组和NC组明显升高, 见图 5A。Vehicle组、TTF1-NP组(100 μmol·L-1)、STAT3过表达组和STAT3过表达+TTF1-NP (100 μmol·L-1)组细胞凋亡率(%)分别为: 7.7±2.2、31.7±6.5、5.5±3.5和44.5±7.3; STAT3+TTF1-NP组与STAT3过表达组相比对细胞凋亡促进作用更明显(P < 0.05), 见图 5B。STAT3过表达可增加survivin表达, 抑制cleaved caspase-3表达(P < 0.05, P < 0.01), STAT3过表达+TTF1-NP组cleaved caspase-3和survivin表达量与vehicle组比较差异显著有统计学意义(P < 0.05), 见图 5C, D。
TTF1在水中的溶解性较差, 采用低温-固化法制成了以硬脂酸为载体的固体脂质纳米粒, 使药物被包封在硬脂酸纳米粒中, 提高了药物溶解性及利用效率, 为TTF1-NP诱导细胞凋亡机制的研究提供了药物基础[5]。
既往研究发现, TTF1-NP可以通过内质网应激途径诱导人肝癌HepG-2细胞的凋亡, 抑制以人肝癌HepG-2细胞建立裸鼠移植瘤的生长[9, 10]。本研究以人肝癌HepG-2细胞为研究对象, 探讨TTF1-NP对STAT3的抑制作用以及抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的抗肿瘤效应。MTT实验结果表明, TTF1-NP对人肝癌HepG-2细胞增殖有显著的抑制作用, HE和Hoechst染色观察到典型的细胞凋亡特征, 流式双染凋亡检测发现细胞凋亡率逐渐增加, 呈时间、浓度依赖性, 这些结果说明TTF1-NP可以抑制人肝癌HepG-2细胞增殖, 诱导细胞凋亡。
STAT3羧基端705位(Tyr705)的酪氨酸磷酸化位点的磷酸化是STAT3活化的标志。STAT3活化表达于多种肿瘤细胞中, 参与调控肿瘤细胞的形成、增殖、侵袭、转移等诸多环节, 是若干致癌信号转导过程的汇合点, 与恶性肿瘤的发生及发展密切相关[11, 12]。在大部分细胞中, STAT3的活化能起到抑制细胞凋亡的作用。Bhardwaj等[13]在研究白藜芦醇抗肿瘤作用时发现, 其可抑制STAT3的活化, 诱导肿瘤细胞凋亡。本研究发现, TTF1-NP处理后, HepG-2细胞内的STAT3、p-STAT3Y705蛋白的表达均减少, 呈时间、浓度依赖性, 说明TTF1-NP可以抑制STAT3的活化。
细胞凋亡是由多种因素引起的多细胞因子和信号蛋白参与的复杂过程, 其中caspase-3作为促凋亡家族重要成员、survivin作为抑制凋亡蛋白家族的成员之一, 对细胞凋亡起重要作用, 而cleaved caspase-3是细胞凋亡的执行者[14, 15]。有研究表明抑制STAT-3活化表达, 可调节survivin等蛋白的表达, 促进细胞凋亡, 抑制肿瘤细胞过度存活[16]。本研究证实TTF1-NP通过抑制STAT3的活化, 抑制survivin蛋白的表达, 促进cleaved caspase-3蛋白的活化, 诱导肝癌HepG-2细胞凋亡; RNA沉默及过表达STAT3从正、反两个方面证实了TTF1-NP诱导细胞凋亡是通过抑制STAT3的活化而实现的。
与其他抗肿瘤单体药物相比, 实验过程中发现TTF1-NP抗肿瘤作用的浓度较高。TTF1是从长白山抗肿瘤药材中提取分离得到的新的抗肿瘤单体化合物, 值得深入研究, 今后将通过对TTF1的化学结构修饰, 筛选效果更佳、剂量更小的抗肿瘤药物。
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