僵蚕 (Bombyx Batryticatus) 为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄的幼虫感染(或人工接种) 白僵菌Beauveria bassiana (Bals.) Vuillant而致死的干燥体^[1], 亦称白僵蚕、姜虫、天虫等, 始载于《神农本草经》, 为传统的平肝息风药。现代药理研究表明僵蚕具有抗癌、神经营养和保护、镇静安眠、促进微循环、抗血栓、降血糖、抗菌、抗凝等作用^[2-4]。临床上僵蚕可作为单方或与其他中药配伍使用, 在治疗糖尿病及其并发症、高血压、脂肪肝、前列腺增生、甲状腺瘤、哮喘和荨麻疹等疾病发挥良好疗效。据统计, 在我国513种常用成药中, 含有僵蚕的有49种, 64种儿科成药中含有僵蚕的有29种, 如小儿奇应丸、七珍丸、小儿镇惊丸等。随着僵蚕在药用、保健食品和化妆品应用, 僵蚕的药用价值备受关注, 药材市场需求量剧增, 每年国内需求量达到2 500～3 000 t, 且常年外销出口^{[5, 6]}。目前, 已采用性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱、HPLC、SDS-PAGE、紫外指纹图谱、红外光谱、HPCE、微量升华法等方法对僵蚕药材进行鉴定^[7-12], 未见DNA条形码分子鉴定技术应用于动物药材僵蚕。

DNA条形码分子鉴定技术是生物学分类和物种鉴定的研究热点, 为中药材流通领域及食品药品相关行业的监管提供了强有力工具^[13]。Chen等^{[14, 15]}在大量实验研究基础上建立了以ITS2为主、psbA-trnH为辅的植物类药材和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材鉴定系统, 该系统包含中药材标准DNA条形码序列、相关研究资料和中药材DNA条形码分子鉴定法标准操作流程 (SOP), 涵盖中国、韩国、日本、美国、印度和欧洲药典95%以上的药材, 可实现对 中药材基原物种、药材饮片、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确快速鉴定, 能够满足不同行业不同科研背景工作者对中药材鉴定的要求。中药材DNA条形码分子鉴定指导原则已纳入《中国药典》(2015版)^[1]。由于核糖体ITS (internal transcribed spacer) 基因区段具有广泛的序列多态性, 在种内不同菌株之间高度保守, 而在真菌种间差异明显, 这种特点使得ITS被作为真菌通用的DNA条形码序列, 并得到国际条形码联盟 (the Consortium for the Barcode of Life, CBOL) 评估, 已广泛应用于真菌的分子鉴定以及属内种间或种内差异较明显的菌株间的系统发育关系分析^[16-19]。本研究基于COI序列和ITS序列分别对僵蚕药材的基原物种家蚕和白僵菌进行分子鉴定, 为动物药材僵蚕的准确鉴定提供科学依据, 保障临床用药安全。

材料 本研究共115个批次僵蚕药材作为待检对象, 分别购自国内药材市场及各大药店, 具体信息见表 1。

表1(Table 1)

Table 1 Sample information of Bombyx Batryticatus. NS: No sequence; US: Unknown species Voucher No. No. of samples Locality Barcode ID COI ITS YC2069MT01-07 7 Bozhou, Anhui B. mori B. bassiana YC2069MT08 1 Bozhou, Anhui B. mori Metarhizium anisopliae YC2069MT09 1 Bozhou, Anhui B. mori B. bassiana YC2069MT10 1 Bozhou, Anhui NS NS YC2069MT11-15 5 Bozhou, Anhui B. mori B. bassiana YC2069MT16-19 4 Chengdu, Sichuan B. mori B. bassiana YC2069MT20-21 2 Nanning, Guangxi B. mori B. bassiana YC2069MT22 1 Nanning, Guangxi B. mori Nomuraea rileyi YC2069MT23 1 Nanning, Guangxi B. mori B. bassiana YC2069MT24 1 Nanning, Guangxi NS NS YC2069MT25 1 Nanning, Guangxi B. mori B. bassiana YC2069MT26-29 4 Kunming, Yunnan B. mori B. bassiana YC2069MT30-31 2 Nanjing, Jiangsu B. mori B. bassiana YC2069MT32 1 Nanjing, Jiangsu B. mori US YC2069MT33-34 2 Nanjing, Jiangsu B. mori B. bassiana YC2069MT35 1 Yongan, Fujian B. mori B. bassiana YC2069MT36-37 2 Yongan, Fujian B. mori US YC2069MT38-42 5 Nanchang, Jiangxi B. mori B. bassiana YC2069MT43-45 3 Guangzhou, Guangdong B. mori B. bassiana YC2069MT46-51 6 Lintao, Gansu B. mori B. bassiana YC2069MT52-56 5 Zhengzhou, Henan B. mori B. bassiana YC2069MT57-59 3 Chongqing B. mori B. bassiana YC2069MT60 1 Chongqing B. mori Scopulariopsis brevicaulis YC2069MT61 1 Yinchuan, Ningxia NS NS YC2069MT62-63 2 Yinchuan, Ningxia B. mori B. bassiana YC2069MT64 1 Yinchuan, Ningxia B. mori US YC2069MT65-71 7 Jinan, Shandong B. mori B. bassiana YC2069MT72-74 3 Wuhan, Hubei B. mori B. bassiana YC2069MT75 1 Wuhan, Hubei NS NS YC2069MT76-77 2 Wuhan, Hubei B. mori B. bassiana YC2069MT78-83 6 Tianjin B. mori B. bassiana YC2069MT84-88 5 Changsha, Hunan B. mori B. bassiana YC2069MT89-94 6 Beijing B. mori B. bassiana YC2069MT95-97 3 Haikou, Hainan B. mori B. bassiana YC2069MT98-100 3 Huhehaote, Neimenggu B. mori B. bassiana YC2069MT101 1 Lasa, Xizang B. mori N. rileyi YC2069MT102-107 6 Lasa, Xizang B. mori B. bassiana YC2069MT108-115 8 Hangzhou, Zhejiang B. mori B. bassiana

Table 1 Sample information of Bombyx Batryticatus. NS: No sequence; US: Unknown species

实验操作流程 取僵蚕药材, 用75% 乙醇擦拭药材表面后, 放置45 ℃烘箱中充分干燥, 然后用已灭菌的小锤子, 避开头尾, 防止杂菌污染, 将样品敲 碎成小块, 分别取约35和20 mg, 用DNA提取研 磨仪 (Retsch MM400, Germany) 充分研磨2 min (每秒30次) 后, 分别利用动物基因组DNA提取试剂 盒 (Tiangen Biotech Co., China) 和植物基因组DNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech Co., China) 提取总DNA。将上述两种试剂盒提取获得的DNA同时扩 增COI和ITS序列。COI序列扩增、测序及数据处理依照中药材DNA条形码分子鉴定法标准操作流 程 (DNA barcoding SOP) 完成^[15]。ITS序列PCR扩增、测序引物正向ITS5F为5'-GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGG-3', 反向ITS4R为5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3' ^[20], PCR反应体积为25 µL, 体系内包含ddH₂O 8.5 µL、2.5 µmol·L^-1引物各1.0 µL (生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成)、2×Taq PCR Mix 12.5 μL、模板DNA约2 µL (约30 ng)。扩增程序: 94 ℃变性5 min, 再进行35个循环 [94 ℃变性 1 min, 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min (+3 s/循 环)], 最后72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物经纯化后, 使用ABI3730XL测序仪进行双向测序。

鉴定系统 (http://www.tcmbarcode.cn), 应用BLAST (basic local alignment search tool) 方法进行结果判定, 相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种^[14]。然后, 将所有获得的ITS序列用软件MEGA5.0 (molecular evolutionary genetics analysis) 分析比对^[21], 用邻接 (NJ) 法构建系统聚类树, 利用bootstrap (1 000次重复) 检验各分支的支持率。

二维DNA条形码的生成与应用 基于开源代码PHP QR Code的编码方式对实验所得DNA条形码序列及相应物种拉丁名进行编码, 将其转换成二维码图片, 使用移动终端 (Android手机、iPhone等) 扫描识读该二维码信息, 实现DNA条形码信息的跨平台转换, 详细流程参见《中国药典中药材DNA条形码标准序列》^[15]。将扫描识读出的二维码信息通过移动终端上的网页浏览器提交至中药材DNA条形码数据库 (http://www.tcmbarcode.cn) 即可获知鉴定结果, 实现二维DNA条形码与中药材DNA条形码数据库在中药流通监管领域的鉴定作用。

利用动物基因组DNA提取试剂盒从115条僵蚕药材样品成功提取到111份满足后续实验要求的基因组DNA, PCR产物经电泳后条带清晰, 显示可成功扩增COI和ITS序列, 但有4条药材样品的PCR产物电泳后无条带。利用植物基因组DNA提取试剂盒从115条僵蚕药材样品成功提取到111份满足后续实验要求的基因组DNA, 并成功扩增111条ITS序列, 但所有样品的COI序列并未扩增成功, 有4条药材样品的ITS序列PCR产物电泳后无条带。研究表明使用动物基因组DNA提取试剂盒提取的基因组DNA可同时扩增出COI和ITS序列, 并且ITS序列扩增结果与植物基因组 DNA 提取试剂盒相一致。

市售僵蚕药材仅凭外观形态难以准确辨认, 尤其是经麸炒加工后的药材 (图 1)。研究共获得111条COI序列, 种内无变异位点, 经中药材DNA条形码鉴定系统鉴定为2015版《中国药典》规定基原物种家蚕Bombyx mori Linnaeus。其中安徽亳州药市、广西南宁市、宁夏银川市、湖北武汉市共4个不同来源的药材样品未能获得COI序列 (图 1: b～e)。

Figure 1

Figure 1

Figure 1 Bombyx Batryticatus from drug stores or Chinese medicinal materials market. (a: YC2069MT01; b: YC2069MT10; c: YC2069MT24; d: YC2069MT61; e: YC2069MT75)

对115条僵蚕药材样品, 利用植物基因组DNA提取试剂盒和动物基因组DNA提取试剂盒分别提取总DNA, PCR产物直接测序均成功获得111条ITS序列, 且分析结果一致。其中白僵菌Beauveria bassiana序列103条, 种内无变异位点, 其他杂菌ITS序列 4条, 分别为莱氏野村菌Nomuraea rileyi序列2条、绿僵菌Metarhizium anisopliae序列1条、短帚霉Scopulariopsis brevicaulis序列1条; 另外4条ITS序列在鉴定系统提交后显示未查询到最接近物种, 显示这4条序列与白僵菌的ITS序列差异很大。此外, 安徽亳州药市、广西南宁市、宁夏银川市、湖北武汉市4 个不同来源共4份药材样品未能获得ITS序列 (图 1: b～e)。基于ITS序列构建白僵菌及其他致病菌株邻接 (NJ) 树 (图 2), 结果表明白僵菌单独聚为一支, 有明显的单系性。其他莱氏野村菌、绿僵菌、短帚霉单独聚为一支。因此, 基于ITS序列构建的邻接树能够明显区分白僵菌与其他致病菌株。

Figure 2

Figure 2

Figure 2 NJ tree constructed using the ITS sequences of the Beauveria bassiana and other fungi species. The bootstrap scores (1 000 replicates) are shown (≥50%) for each branch

将实验获得的ITS和COI序列转换为彩色条形码图片, 以不同颜色分别表示不同碱基 (ATCG), 数字表示核苷酸序列长度, 形象化展示僵蚕药材DNA条形码序列。此外, 将家蚕和白僵菌的物种拉丁名及DNA条形码序列进行编码, 获得各物种二维DNA条形码图片, 此图片可通过不同移动终端的多种二维码扫描软件识读物种拉丁名及DNA条形码序列。扫描识读的序列信息可通过网页浏览器提交至中药材DNA条形码鉴定数据库进行鉴定。将二维码技术与DNA条形码技术相结合, 开创“互联网+”二维条形码技术, 建立基于二维码技术跨平台信息交换的“互联网+”中药材物种鉴定系统 (图 3), 为每个药材基原物种提供标准二维DNA条形码, 有利于DNA条形码信息在不同平台间转换, 为二维DNA条形码技术在实际流通监管工作中的应用提供理论基础, 实现中药材鉴定新模式。

对于真菌基因组DNA的提取, 文献^[22-24]往往采用改进SDS方法和植物试剂盒进行提取, 本研究采用动物基因组提取试剂盒提取的同一份DNA, 选用不同的引物, 分别可以成功扩增动物COI序列和真菌ITS序列, 并且ITS序列扩增、测序结果与植物基因组 DNA 提取试剂盒相一致, 表明动物基因组DNA提取试剂盒可一次性将动物和真菌的DNA同时提取出来, 具有简便、快捷的优点, 可以为其他含有动物和真菌类药材的DNA提取提供示范。

Figure 3

Figure 3

Figure 3 “Internet Plus” DNA barcoding system for identifying herbal medicine based on two-dimensional DNA barcode

通过比较市售样品外观性状, 发现市售僵蚕药材大致可分为两种类型, 一种是直接感染白僵菌病死的家蚕, 未经过炮制加工, 通体灰白色, 表面有白色菌丝; 另一种是经过麸炒加工, 蚕体多弯曲皱缩, 表面灰黄色 (图 1c)。这两种类型的僵蚕药材均质硬而脆, 市场流通过程中易发生蚕体头部或尾部出现断裂的情况, 故实验在取样时, 需注意灭菌操作, 并尽量避开头尾部, 防止外源性污染。此外, 用已灭菌的小锤子敲碎样品后, 提取家蚕基因组DNA时尽量选取蚕体内部的碎块, 提取白僵菌基因组DNA时尽量选取表面白色的药材碎块。由于僵蚕药材同时包含家蚕和白僵菌, 针对药材不同部位, 通过多次反复实验对比发现, 称样量控制在20～35 mg、适当延长水浴时间, 都可以提高其消化程度, 且在抽提及纯化过程中, 操作动作应轻柔, 避免对样品DNA造成损伤。

此外, 研究中来自安徽亳州药市、广西南宁市、宁夏银川市、湖北武汉市4个不同来源共4份药材 样品未能获得COI序列和ITS序列, 分析其影响因 素有以下几点: ① 药材前期处理, 麸炒炮制过程的差异, 导致DNA降解严重, 提取相对困难。② 研究报道发现, 目前药材市场上, 除了使用黑死蚕、空心僵蚕作为混伪品掺假以外, 还有不法商贩掺入石膏、石灰水等杂质以增加其重量或直接使用这些杂质伪造僵蚕药材, 严重影响DNA的提取。总之, 这4份样品在药材质量上存在疑问。

2015版《中国药典》规定僵蚕正品为家蚕的幼虫感染 (或人工接种) 白僵菌而致死的干燥体, 由于其外观极其相似, 炮制加工程度的不同, 通过性状鉴别难以区分^[25], 而且对家蚕致病菌是否为白僵菌不能进行鉴别。本研究利用DNA条形码技术, 结合COI序列和ITS序列成功对家蚕和白僵菌进行分子鉴定, 结果更为客观和准确, 为解决僵蚕药材混用和掺伪等问题提供强有力的科技支撑, 同时也为含有动物及真菌的药材鉴定提供示范。

DNA条形码首先在动物鉴定研究中提出, COI序列对动物鉴定的有效性在多个类群中得到了验证, 已成为动物条形码鉴定的核心序列。Zhang等^[26]应 用COI序列对中国药典45个动物药材51种基原动物进行了鉴定研究, 表明COI序列作为条形码序列适用于动物药材的鉴定。Shi等^[27]建立了中国动物药材DNA条形码数据库, 包含800余种动物药材和大量混伪品及密切相关物种。Jia^{[28, 29]}、Zhang^[30]等证实COI序列能成功鉴定穿山甲、鹿茸粉、海马等动物药材, 对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护具有重要意义。本研究表明COI序列能够有效鉴别僵蚕药材的家蚕蚕体, 从而达到对市售僵蚕药材市场监控的目的。

据报道, 真菌某些属的鉴定可使用COI基因作为DNA条形码^{[31, 32]}, 但是, 研究发现该基因在真菌的很多类群中存在内含子或多拷贝现象^{[33, 34]}, 为了获取某些种的短片段, 需设计许多引物, PCR扩增与测序成功率低, 难以达到便捷、快速的物种鉴定的目的。本研究证实以家蚕和白僵菌混合的DNA样品为模板, 采用动物通用COI序列, 可特异性扩增获得家蚕COI序列, 而未扩增出白僵菌COI序列, 保证僵蚕药材家蚕蚕体鉴定的准确性。

ITS序列作为真菌通用的DNA条形码, 其进化速度快, 区域相对保守, 能提供足够多的变异来进行类群间的比较, 且该序列具有多拷贝特性, 使ITS 区很容易从少量、稀疏或高度降解的DNA样品中获得^[35]。Xiang等^[23]基于ITS序列对53份珍稀濒危药材冬虫夏草及其7个近缘物种进行分子鉴定, 结果显示采用BLAST1和Nearest distance法对冬虫夏草 及其混伪品的鉴定效率为100%, DNA条形码技术能准确、快速鉴定冬虫夏草及其常见的混伪品及近缘种。本研究显示称取少量僵蚕药材样品即可成功扩增ITS序列, 且ITS序列可有效鉴别白僵菌及其他污染杂菌, 为僵蚕药材的质量控制提供强有力工具。此外, 研究发现主要外源杂菌为莱氏野村菌、绿僵菌和短帚霉3种, Zhang等^[36]研究表明莱氏野村菌为昆虫致病性真菌, 能感染家蚕发生绿僵病, 由此推测僵蚕药材可能为病害家蚕。短帚霉是一种腐生性条件致病真 菌, 僵蚕药材很可能由于前期处理及储藏环境不当, 发生霉变。

由于ITS序列在动物和真菌中广泛存在^[19], 僵蚕药材本身包含动物家蚕与真菌白僵菌, 结果显示并未将家蚕的ITS序列扩增出来, 保证了ITS条形码序列对白僵菌鉴定的稳定性和准确性。ITS属于非编码区序列, 包含的ITS1和ITS2分别位于18s～5.8s和5.8s～28s之间, 从低等到高等的真核生物, 这些RNA高度保守, 非常有利于设计PCR引物并成功扩增出ITS序列。在已研究的动物和真菌的ITS序列中, 发现ITS序列不仅在种间存在着差异性, 在同一个种的不同地理种群中也存在着明显的差异性, 并且由于个体的基因组中有多个rDNA拷贝存在, 不同的ITS间隔序列之间也存在着差异。研究采用真菌的DNA条形码ITS序列能够成功鉴定白僵菌, 为其分类学研究提供科学依据。

研究开创“互联网+”二维条形码技术, 基于DNA条形码信息的跨平台转换, 建立僵蚕药材二维DNA条形码流通监管体系, 实现二维DNA条形码与中药材DNA条形码数据库在中药流通监管领域的鉴定作用, 有效监管僵蚕药材流通领域的各个环节。中药材流通体系涵盖了中药材种植到采收、产地加工、包装、仓储和运输一体化的现代物流体系等环节, 其产业链条长, 行业跨度大, 结构复杂且涉及多个产业部门。中药材市场流通中缺乏符合生产实际、与市场流通配套的中药材质量评价标准。针对市售中药材在流通领域可能面对的各种问题, 研究者提出了基于开源代码QR Code (quick response code) 将DNA条形码序列转换为二维码, 赋予不同物种不同的二维码图像, 类似超市中不同物品的不同条形码, 以中药材DNA条形码鉴定系统为平台, 建立中药材二维DNA条形码流通监管体系, 能够有效实现数字化监管, 使DNA条形码技术的实际应用更加便捷^[37]。二维DNA条形码流通监管体系为解决中药产业链各环节的药材的混用、掺假等行业问题提供了强有力的工具, 对保障传统中药材临床用药安全具有重大现实意义。