2. 广东药科大学医药化工学院, 广东 广州 510006
2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
荧光标记是分子水平机制研究不可或缺的手段之一, 通过物理包埋、化学连接或静电作用等将荧光探针标记在目标物上, 然后再借助荧光成像, 在分子水平观察目标物与组织等的相互作用。荧光标记除了在标记抗体[1, 2]、蛋白[3]等方面广泛应用外, 近年来在制剂如微球[4, 5]、纳米粒[6]和脂质体[7]等方面的应用也越来越多。但是, 有关荧光标记胶束的报道却相对较少, 在已有的报道中胶束的荧光标记方式大多为物理包埋[8, 9]。胶束不稳定且容易受环境的影响, 随着实验时间延长, 胶束的稳定性下降 (尤其是用时比较长的实验), 可能会导致包载的荧光探针从胶束内核中释放出来, 这样荧光信号就不能准确反映胶束的体内行为, 从而干扰实验结果的测定。另外, 胶束材料包括小分子两亲性表面活性剂和大分子两亲性聚合物材料, 因为后者含有较多易于修饰的活性基团, 容易进行荧光探针的化学标记, 所以本课题组选择实验室自制的基于β-环糊精的两亲性嵌段4臂聚合物 (β-CD-[P(AA-co-MMA)-b-PVP]4) 为被标记模板, 用化学连接的方法对其进行荧光标记, 同时也为两亲性嵌段共聚物胶束材料建立一种荧光标记方法。
荧光探针的选择尤为重要, 因为机体组织对荧光有吸收、散射等干扰使得荧光强度变弱。另外, 组织、体液等吸收大部分可见光后也会发射一定波长的光, 从而与荧光探针发射的荧光混在一起, 容易造成干扰。所以, 要选发射波长较大的荧光探针, 最好是近红外荧光探针, 如多甲川系列青染料 (Cy5.5[10]) 和酞青类[11]等。但是考虑到化学标记时, 分子量大的荧光探针 (多甲川系列青染料、酞青类) 可能会对被标记物的性质有影响。因此, 本课题组决定选择发射波长接近近红外区且分子量小、荧光量子产率为1的罗丹明B为荧光探针, 其激发波长为552 nm、发射波长为588 nm。
长春西汀 (vinpocetine, VP) 是从夹竹桃科小蔓长春花 (Catharanthus roseus (L.) G. Don) 中提取的一种吲哚类生物碱, 是一种治疗心血管方面的药物, 几乎不溶于水, 生物利用度低。因为胶束具有显著的增容能力, Li等[12]制备的混合胶束、药物白藜芦醇的溶解度为5.92 mg·mL-1, 与药物本身溶解度相比, 提高了约197倍。所以, 选择VP作为模型药物制备长春西汀荧光胶束, 考察其体内分布行为。
本实验中, 借助罗丹明B (RhB) 结构中的羧基基团, 待其活化后通过酯交换反应引入含有双键的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA), 然后通过双键聚合反应将罗丹明B标记到实验室自制的两亲性嵌段共聚物上, 得到荧光标记终产物 (β-CD-[P(AA-(HEMA- RhB)-MMA)-b-PVP]4); 采用红外光谱和荧光光谱相结合的方式对标记产物进行表征; 以难溶性的中药提取产物长春西汀为药物模型, 制备荧光载药胶束进行组织分布实验和小动物活体荧光成像实验。
材料与方法仪器和材料 紫外分光光度计(UN-2550型)、荧光分光光度计 (RF5301 PC型) (日本Shimadzu公司); TENSOR-3型傅立叶变换红外光谱仪 (TENSOR-3型); 小动物活体成像仪(NightOWL Ⅱ LB983型, 德国Berthold公司)。
罗丹明B、芘、HEMA、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N-乙烯基吡咯烷酮(VNP) (阿拉丁公司); 长春西汀 (99%, 辽宁海德制药有限公司); 基于β环糊精的二硫代酯RAFT试剂 (CTA, 实验室自制); 乙酸乙酯 (天津市富宇精细化工有限公司, 分析纯); 丙烯酸 (AA, 天津科密欧化学试剂有限公司, 分析纯); 甲基丙烯酸甲酯 (MMA)、2, 2-偶氮二异丁腈 (AIBN) (天津市福晨化学试剂厂, 分析纯); 乙醇 (国药集团化学试剂有限公司)。
动物 BALB/c-nu小鼠, SPF级, 雄性, 体重18~22 g, 购于中山大学 (大学城) 实验动物中心, 许可证号SCXK (粤) 2011-0029; Sprague-Dawley大鼠, SPF级, 雄性, 体重180~220 g, 购于广东省医学实验动物中心, 许可证号SCXK (粤) 2013-0002, 所有动物实验均遵循《实验动物保护条例》。
罗丹明B的活化和修饰 取0.123 g (0.25 mmol) 罗丹明B和0.072 g (0.375 mmol) EDC于含有5 mL 二甲基甲酰胺 (DMF) 的圆底烧瓶中, 室温条件下, 避光反应10 h; 活化产物与30.5 µL (0.25 mmol) HEMA于室温避光条件下继续反应3 h, 即得RhB-HEMA产物, 活化和修饰过程见图 1。
荧光标记高分子聚合物 取全部RhB-HEMA产物加入盛有DMF的圆底烧瓶中, 再分别加入AA和MMA, 加热、充氩气条件下按β-CD-[P(AA-co-MMA)- b-PVP]4第一嵌段聚合反应的方法进行第一嵌段荧光标记反应。产物用乙酸乙酯沉淀, 多次反复洗涤后用DMF溶解; 取荧光标记后的第一嵌段产物和NMP, 按β-CD-[P(AA-co-MMA)-b-PVP]4第二嵌段聚合反应的方法进行第二嵌段荧光标记反应 (β-CD-[P(AA-co- MMA)-b-PVP]4的合成方法另文发表)。即得最终荧光标记后的两嵌段共聚物, 经二氯甲烷沉淀并洗涤至无色; 装入透析袋, 先用DMF透析1天再用水透析至透析液为无色; 冷冻干燥后称重, 避光密封保存。
表征 KBr压片法检测材料的FT-IR光谱吸收; 荧光分光光度计方法扫描其荧光吸收, 对荧光标记后的产物进行表征。
荧光标记前后临界胶束浓度的比较 采用芘荧光探针法检测荧光标记前后聚合物的临界胶束浓度 (CMC)。避光条件下配制0.08 mg·L-1芘-丙酮溶液; 然后再分别配制质量浓度为2.5×10-1、1.0×10-1、5.0×10-2、2.5×10-2、1.0×10-2、5.0×10-3、2.5×10-3、1.0×10-3、5.0×10-4、2.5×10-4、1.0×10-4和5.0×10-5 mg·L-1未标记的胶束材料 (β-CD-[P(AA-co-MMA)-b-PVP]4) 和经罗丹明B标记的胶束材料 (β-CD-[P(AA-(HEMA- RhB)-MMA)-b-PVP]4) 水溶液; 取0.08 mg·L-1芘-丙酮溶液1 mL于10 mL棕色量瓶中, 氮气吹干丙酮后, 分别加入配制好的胶束材料水溶液, 于25 ℃水浴超声30 min, 于避光处40 ℃恒温放置过夜。
设定发射波长为390 nm, 光栅缝隙宽度 (slit width) 为1.5, 读取各浓度的样品在激发波长为338 nm、333 nm处的荧光强度。以338、333 nm处荧光强度的比值 (I338/I333) 对各聚合物浓度的对数 (LogC) 作图, 分别计算标记前后该两亲性聚合物的CMC。
荧光标记产物的确证及应用 采用溶剂挥发法制备长春西汀荧光聚合物胶束, 进行小鼠活体荧光成像实验和载药胶束体内组织分布实验, 对比两个实验结果组织分布行为的一致性, 同时确证荧光产物是否标记成功。
在避光条件下, 称取胶束材料20.00 mg、长春西汀10.00 mg, 加20 mL甲醇溶解; 35 ℃、1 400 r·min-1恒温磁力搅拌条件下匀速滴加去离子水10 mL, 继续搅拌2 h; 减压旋转蒸发法蒸干有机溶剂; 0.45 µm微孔滤膜过滤; 4 ℃冰箱保存。
按8 mg·kg-1剂量尾静脉给药, 分别于30和 90 min处死小鼠, 取心、肝、脾、肺、肾和脑组织, 生理盐水洗净血渍, 称重后组织匀浆。取0.4 mL组织匀浆液加0.8 mL甲醇, 涡旋1 min于4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心15 min, 上清液经0.22 µm微孔滤膜过滤后, 10 µL进样进行高效液相检测。
按8 mg·kg-1剂量尾静脉给药, 分别于0、30、90和140 min进行小鼠活体成像, 记录荧光成像情况, 然后处死小鼠, 取出脏器进行荧光成像并记录结果。
标记产率 精密称取荧光标记产物β-CD-[P(AA- (HEMA-RhB)-MMA)-b-PVP]4 20.2 mg, 甲醇定容至10 mL, 检测紫外吸收, 利用紫外分光光度法进行罗丹明B荧光标记产率的计算。产率 = ωm0/m, 其中, ω: RhB占整个荧光标记产物的质量分数 (%); m0: 荧光标记产物总重量 (g); m: 荧光标记物的质量 (g)。
结果 1 最适激发波长的选择由图 2可以看出, 不同激发条件下β-CD-[P(AA- (HEMA-RhB)-MMA)-b-PVP]4的荧光吸收是不同的, 考虑到发射波长比激发波长长, 所以经对比得出: 533 nm是该荧光聚合物的最适激发波长, 在该波长的激发下其发射波长在582 nm产生吸收。
2 最适溶剂的选择同一物质在不同溶剂中的响应情况有所不同, 有必要对RhB标记后的荧光产物的最适合溶剂进行筛选。因为对聚合物标记的最终目的是通过荧光标记, 为后续荧光成像等方面的应用提供可能, 如进行荧光探针的实时监测对其体内行为进行研究或通过荧光显微成像研究荧光探针与其他物质的相互作用等, 这些都需要该荧光探针的荧光具有较强的穿透力, 且抗淬灭, 所以发射波长越长越好。
由图 3A可见, RhB在水、甲醇、乙醇中有较强的荧光吸收且荧光强度依次增加; 图 3B中HEMA是反应原料, 所以要选择的溶剂必须是HEMA没有荧光吸收的, 由图可知HEMA在水和DMF中没有荧 光吸收; 图 3C荧光标记产物β-CD-[P(AA-(HEMA- RhB)-MMA)-b-PVP]4在水、DMF和乙醇中都有较好的荧光吸收, 但RhB和β-CD-[P(AA-(HEMA-RhB)- MMA)-b-PVP]4在水中的荧光吸收较其他溶剂发生了红移。考虑到越接近近红外区的激发波长, 会有越好的荧光穿透力, 所以选择水为最适合的溶剂。
由于本实验建立的荧光标记方法, 在荧光标记产物中引入了大量的酯基, 使得羰基的吸收情况发生变化。未荧光标记的聚合物(图 4A红色谱图) b、c分别是酯羰基和酮羰基, 而在标记物产物中 (图 4A蓝色谱图) 表现为酯羰基(b) 的吸收峰明显增强, 而酮羰基的吸收峰 (c) 则相对减弱, 这也说明罗丹明B确实通过本实验建立的方法连接到目标高分子化合物中。同时, 由图 4B反应原料以及产物的荧光吸收图可知, 反应物EDC、HEMA均无荧光吸收, 不会对反应物的荧光性质考查产生干扰; 对比图 4B罗丹 明B (黑) 和荧光标记产物 (红) 可以发现, 荧光标记产物不仅有荧光吸收且该吸收较罗丹明B 发生了约10个单位的红移 (从582 nm红移至593 nm)。荧光吸收谱图不仅证明罗丹明B的成功标记, 同时标记产物的荧光吸收出现红移现象, 这对后续小动物活体荧光成像实验也是有利的, 因为波长长的荧光探针其荧光穿透力强, 可以避免组织体液的自发荧光干扰。
计算得到标记前后该两亲性高分子聚合物的CMC值分别为5.09×10-3和4.96×10-3 mg·L-1 (图 5A, B)。由此可知, 标记前后CMC值基本无变化, 说明本文建立的荧光标记方法对该两亲性高分子聚合物的胶束行为几乎无影响。
图 6A记录了罗丹明B的荧光标记聚合物胶束水溶液在激发波长550 nm和发射波长600 nm的条件下已经过度曝光, 说明该胶束水溶液的荧光强度很高, 足够用于小动物的体内成像实验。同时该胶束的荧 光响应, 也能侧面证明本实验确实通过HEMA修饰RhB并参与聚合物嵌段形成的方式将罗丹明B标 记到基于β-环糊精的两亲性嵌段4臂聚合物 (β-CD- [P(AA-co-MMA)-b-PVP]4) 上, 且荧光标记产物具有较强的荧光强度, 可以用于荧光活体成像实验研究。图 6B、C、D和E分别表示胶束通过小鼠尾静脉给药后0、30、90和140 min的体内荧光成像。由图可见, 90 min时小鼠体内还有很强的荧光吸收, 这对于一些用时较长的实验研究是非常有利的; 但140 min后, 小鼠体内的荧光强度就很弱了, 以至于活体成像几乎观察不到荧光信号, 只有在脏器成像中可以看到微弱的荧光。另外, 这些荧光成像图也展现了荧光胶束在小鼠体内的分布情况, 与VP展示的组织分布情况 (图 7) 基本吻合, 说明本文建立的荧光标记方法, 几乎不会影响β-CD-[P(AA-co-MMA)-b-PVP]4的化学性质, 如胶束载药行为和体内分布行为。
罗丹明B的标准曲线方程式y = 15.432 x - 0.037 87, R2 = 0.999 88, 表明线性良好, 可以用于含量测定。实验测得2.02 g·L-1的β-CD-[P(AA-(HEMA-RhB)-MMA)- b-PVP]4的紫外吸收为0.518 3, 带入方程可求得以罗丹明B计算的质量浓度是0.036 g·L-1, 则β-CD-[P(AA- (HEMA-RhB)-MMA)-b-PVP]4中罗丹明B的质量分数为1.782%。
反应中罗丹明B的投样量是0.123 g; 最终制备的β-CD-[P(AA-(HEMA-RhB)-MMA)-b-PVP]4干重为0.285 g, 所以罗丹明B标记高分子聚合物的荧光标记产率为4.13%。
讨论本文利用双键聚合反应的原理, 将罗丹明B标记到基于β-环糊精的两亲性嵌段4臂聚合物 (β-CD- [P(AA-co-MMA)-b-PVP]4) 上。整个实验过程都在避光条件下进行, 因为光照会加快罗丹明B的淬灭。阶段性反应产物需要纯化, 所以一嵌段聚合物产物的沉淀剂选择用乙酸乙酯沉淀并反复洗涤多次; 最终产物沉淀剂选择的是二氯甲烷, 因为二氯甲烷既可以使产物沉淀又可以溶解未反应的罗丹明B, 起到很好的除杂效果; 透析除杂选择两种溶剂是为了借助DMF强大的溶解能力除去一些水不溶性的杂质, 再经过水透析除去水溶性杂质。
因为激发波长和溶剂都会影响荧光吸收, 所以要筛选出最符合实验需要的、同时又可以避免干扰的激发波长和溶剂。对目标物进行荧光标记的目的是为了借助荧光的示踪功能 (荧光成像和荧光显微成像) 进行不同需要的实验研究。但组织、体液等会对荧光有吸收、散射等干扰, 穿透能力强即发射波长接近或在近红外区的荧光容易透过组织、体液等被荧光成像系统捕捉到。所以本实验选择没有荧光干扰的EDC和HEMA, 且激发波长最长的水作为最适合的溶剂。另外, 在荧光性质考查时要注意控制单一变化条件, 比如考查溶剂对荧光的响应情况, 要控制浓度、激发波长、发射波长及光栅缝隙宽度条件一致。
设定发射波长为390 nm, 罗丹明B在激发波长338和333 nm处无荧光吸收, 排除罗丹明B干扰, 所以本文选择芘荧光探针法测定CMC。Nagasaki等[13, 14]发现在发射波长为390 nm时, 芘在333和335 nm的激发光强度之比 (I335/I333) 是探针周围溶剂环境的函数: 两亲性聚合物浓度小于CMC时, 芘的I335/I333与其在水中I335/I333相同; 当浓度为CMC时, I335/I333急剧增大; 当浓度大于CMC时, I335/I333变成常数, 与聚合物浓度无关。Chen等[15]研究发现, 聚合物浓度从低于CMC到高于CMC, 芘的激发光谱带出现红移, 选取强度较大的峰值波长的荧光强度值用于计算CMC值时更准确、灵敏。所以本文选取333和338 nm的荧光强度值进行计算。
本文采用红外、荧光分光光度法和小动物活体 荧光成像相结合的方法来对该荧光标记物进行表征及确证。通过红外谱图中特征官能团分析来判断罗 丹明B是否标记到目标物上。另一方面也通过荧光分光光度法考查了标记产物的荧光性质, 最终确定本实验确实将罗丹明B连接到目标物上。最后通过小鼠活体荧光成像观察, 不仅再次确证了罗丹明B的成功标记, 还证明了罗丹明B标记后目标物的荧光性能较好, 可穿透组织、体液等, 用于实验的荧光示踪实验。
结论本实验通过与EDC活化后的罗丹明B发生酯交换反应将HEMA中的双键引入罗丹明B中, 进而参与目标高分子聚合物的嵌段聚合反应, 从而将罗丹明B标记到目标高分子聚合物上, 荧光标记产率达4.13%。且标记前后该两亲性高分子聚合物的CMC值几乎无变化, 证明本文建立的荧光标记方法对其胶束行为无影响; 为了使标记后的产物有一个较优的荧光性质, 借助荧光分光光度计筛选出最适合的激发波长和溶剂; 采用红外、荧光分光光度法和小动物活体荧光成像相结合的表征手段对标记产物进行表征和确证; 另外, 通过小鼠活体荧光成像实验对比组织分布结果, 也证明了本文建立的荧光标记方法对聚合物胶束材料的胶束载药行为和体内分布行为几乎没有影响。希望本文建立的荧光标记方法对高分子嵌段聚合物的荧光标记具有一定的借鉴意义。
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