药学学报  2016, Vol. 51 Issue (10): 1651-1654   PDF    
基于QSAR研发的诺氟沙星和沙星类药物
郭宗儒     
中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
1 前期的研究发现

最早发现喹诺酮酸结构及其抗菌作用的是Lesher等在合成氯喹的过程中, 分离出一个副产物, 具有微弱的抗菌活性, 遂合成了萘啶酮酸为母核的系列化合物, 对N1和C7作不同的烷基置换, 对C3上的羧基进行不同的酯基取代, 经体外和体内的抗菌实验, 发现萘啶酸(1, nalixilic acid)具有显著杀伤革兰氏阴性菌的作用, 1963年成为第一个试用喹诺酮类抗菌药(Lesher GY, Froelich EJ, Gruett MD, et al. 1, 8-Naphthyridine derivatives. A new class of chemothera peutic agents. J Med Pharm Chem, 1962, 5: 1063-1065)。

由于发现了抗菌药新的结构类型, 引起了世界范围的研究, 进而发现了奥索利酸(2, oxolinic acid)、吡哌酸(3, pipemidic acid)和氟甲喹(4, flumequine)等具有更强和更广抗菌谱的活性物质。在药物化学上, 重要的是萘啶环可变换成喹啉或嘧啶并吡啶环, 为后期的研究提供了较多的结构选择性。

2 多位点的取代基变换—定量构效关系研究

日本杏林公司Koga等基于已有的结构-抗菌活性的关系, 推测抗菌母核具有可变性, 而且可在环的1、6、7和8位进行不同的取代, 以提高和扩大抗菌谱。遂以二氢喹啉酮为母核, 以通式5的多个位置进行系统的取代基变换, 定量地研究结构与活性的关系。

彼时正是Hansch-藤田以线性自由能相关(LFER)为基础的定量构效关系分析法(QSAR)研究热火的年代, Koga等用化合物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)定量地评价受试化合物的活性作为因变量, 用分子结构中变换的原子或基团的电性、立体性、疏水性等参数作为自变量, 通过回归和显著性分析, 揭示QSAR方程。

2.1 考察化合物通式5中6位取代基对活性的影响

第一批合成的化合物为R1固定为C2H5、R7和R8均为H, 只变换R6为H、F、Cl、NO2、Br、CH3、OCH3和I。表 1列出了合成的化合物和测定抗菌活性, 活性的计算值是根据式1计算所得。表 1的数据经回归分析得到式1:

$ \begin{array}{l} \lg 1/MIC = - 3.318\left( { \pm 0.59} \right){\left[{{E_{s\left( 6 \right)}}} \right]^2} - 4.371\left( { \pm 0.85} \right)\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left[{{E_{s\left( 6 \right)}}} \right] + 3.924\\ \;\;\;\;\;\;\;n = 8, r = 0.989, s = 0.108, {F_{2.5}} = 112.29 \end{array} $ (1)
表 1 变换6位基团的化合物结构和活性. *按式1计算的结果

式1中MIC为最低抑菌浓度, 单位是mol·L-1, lg 1/MIC表示化合物的活性值, 数值越大, 活性越高(因是MIC的倒数); Es(6)为6位取代基R6的立体参数; n是参与回归的样本数(即化合物数); r为相关系数(越接近于1相关性越强); s为标准偏差(越小越好); F是方程的显著性检验值。方程中影响活性的只有Es(6), 而且含有二次项, 表明在最适Es(6)值下活性可达到最高值, 经求解最适Es(6)为-0.66, 大约相当于氟原子(Es(F)=-0.55), 提示6位的取代基以氟原子取代最佳。

2.2 考察化合物通式5中8位取代基对活性的影响

为了优化8位取代基, 固定了R1为C2H5、R6和R7为H, 变换R8合成了7个化合物, 结构和活性列于表 2。得到构效方程式2:

$ \begin{array}{l} \lg 1/{\rm{MIC = }} - 1.016\left( { \pm 0.46} \right){\left[{{B_{4\left( 8 \right)}}} \right]^2} - 3.726\left( { \pm 2.04} \right)\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left[{{B_{4\left( 8 \right)}}} \right] + 1.301\\ \;\;\;\;\;\;\;n = 7, r = 0.978, s = 0.221, {F_{2, 4}} = 44.05 \end{array} $ (2)
表 2 变换8位基团的化合物结构和活性. *按式2计算的结果

式2中B4(8)是另一种立体参数, 系指与C8相连的原子或基团在某个方向上的体积因素, 该参数在式2中也含有2次项, 提示存在一个最佳值, 可使活性达到最大值, 经计算B4(8)的最佳值1.83, 与甲基值(B4(CH3)=2.04)相近。

2.3 第三轮考察7位取代基对活性的影响

研究7位取代基的变换对活性的影响, 固定R1为乙基, R6和R8为氢, 合成了7个化合物, 结构和活性列于表 3。虽然在7位引入基团使活性提高了10~30倍(相对于R7=H), 但回归分析未能看出对活性的影响因素(7个样本的回归方程不具备显著性)。电性效应表明, 由拉电子的硝基到推电子的二甲胺基, lg 1/MIC的变化范围为1~1.5。但当7位取代基用指示变量表征对活性的影响时, 综合6、7、8位基团的变换与活性的关系, 得到了式3:

$ \begin{array}{l} \lg 1/{\rm{MIC}} = - 3.236\left( { \pm 0.89} \right){\left[{{E_{s\left( 6 \right)}}} \right]^2} - 4.210\left( { \pm 1.26} \right)\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left[{{E_{s\left( 6 \right)}}} \right] - 1.024\left( { \pm 0.32} \right){\left[{{B_{4\left( 8 \right)}}} \right]^2} - 3.770\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left( { \pm 1.43} \right)\left[{{B_{4\left( 8 \right)}}} \right] + 1.358\left( { \pm 0.40} \right){I_{\left( 7 \right)}} + 1251\\ \;\;\;\;\;\;\;n = 21, r = 0.978, s = 0.205, {F_{5, 15}} = 67.50 \end{array} $ (3)
表 3 变换7位基团的化合物结构和活性. *按式3计算的结果

式3中I(7)为7位取代基的指示变量, 推电子基团为1, 拉电子基团为0, 该项的回归系数为+ 1.358, 提示7位的推电子取代基比拉电子基团的活性提高1个数量级。为了进一步探索7位取代基的影响, 只变换7位基团成四氢吡咯、哌嗪、N-取代的哌嗪, 测定抗菌活性。由于哌嗪的N4呈碱性, 可被质子化, 也可被酰化, 所以电性的变化可以很大。为进行QSAR研究, 用指示变量I(7N-CO)表征哌嗪的N4的状态, 若哌嗪的N4被酰化赋值为1, 未酰化(可呈正电荷)的为0, 得到式4:

$ \begin{array}{l} \lg 1/{\rm{MIC}} = - 0.244\left( { \pm 0.05} \right){\left[{{\pi _{\left( 7 \right)}}} \right]^2} - 0.675\left( { \pm 0.15} \right){\pi _{\left( 7 \right)}} - \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;0.705\left( { \pm 0.27} \right){I_{\left( {7{\rm{N - CO}}} \right)}} + 5.987\\ \;\;\;\;\;\;\;n = 22, r = 0.943, s = 0.242, {F_{3, 18}} = 47.97 \end{array} $ (4)

式4中π(7)表示7位基团的疏水性常数, π(7)含有二次项, 提示7位具有最适疏水性的取代基可致抗菌活性最强。指示变量项I(7N-CO)的系数为负值, 表明哌嗪环未被酰化有利于提高活性。这就是为什么所有的沙星药物都在6位保持有碱性氮原子。

2.4 探索N1取代基对活性影响

进一步考察N1位取代基对活性的影响。固定C6和C8位为H, 7位为哌嗪基, 变换1位合成的化合物及活性列于表 4

$ \begin{array}{l} \lg 1/{\rm{MIC = }} - {\rm{0}}{\rm{.492}}\left( { \pm 0.18} \right){\left[{{L_{\left( 1 \right)}}} \right]^2} + 4.102\left( { \pm 1.59} \right)\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left[{{L_{\left( 1 \right)}}} \right] - 1.999\\ \;\;\;\;\;\;\;n = 8, r = 0.955, s = 0.126, {F_{2.5}} = 25.78 \end{array} $ (5)
表 4 变换1位基团的化合物结构和活性. *按式5计算的结果

式5中L(1)是取代基R1的STERIMOL长度参数, 是表征立体效应的另一种参数, 其最适值大约为4.2, 接近于乙基的长度(L乙基=4.11)。

2.5 多位点的同时优化

至此, 各个位置的最佳取代基已经确定, 即R1=C2H5, R6=F, R7=甲基哌嗪基, R8=Cl或CH3。将上述合成的化合物以及其他一些喹诺酮共71个化合物, 作综合性回归处理, 得到式6:

$ \begin{array}{l} \lg 1/{\rm{MIC}} = - 0.362\left( { \pm 0.25} \right){\left[{{L_{\left( 1 \right)}}} \right]^2} + 3.036\left( { \pm 2021} \right)\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left[{{L_{\left( 1 \right)}}} \right] - 2.499\left( { \pm 0.55} \right){\left[{{E_{s\left( 6 \right)}}} \right]^2} - 3.345\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left( { \pm 0.73} \right)\left[{{E_{s\left( 6 \right)}}} \right] + 0.986\left( { \pm 0.24} \right){I_{\left( 7 \right)}} - 0.734\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left( { \pm 0.27} \right){I_{\left( {7{\rm{N - CO}}} \right)}} - 1.023\left( { \pm 0.23} \right){\left[{{B_{4\left( 8 \right)}}} \right]^2} - \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;3.724\left( { \pm 0.92} \right)\left[{{B_{4\left( 8 \right)}}} \right] - 0.205\left( { \pm 0.05} \right)\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;{\left[{\sum {{\pi _{\left( {6, 7, 8} \right)}}} } \right]^2} - 0.485\left( { \pm 0.10} \right)\sum {{\pi _{\left( {6, 7, 8} \right)}} - 0.681} \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\left( { \pm 0.39} \right)\sum {{F_{\left( {6, 7, 8} \right)}} - 5.571} \\ \;\;\;\;n = 71, r = 0.964, s = 0.274, {F_{11, 59}} = 70.22 \end{array} $ (6)

式6比前几个复杂得多, 因为取代基位置的变化和化合物样本数多的缘故(参与回归分析的样本数越多, 可允许有较多的参数描述)。式中除含有前述的L(1)Es(6)I(7)I(7N-CO)B4(8)外, 新参数Σπ(6, 7, 8)表示6、7和8位取代基疏水常数之和, 由于其他位置基本是固定不变的, 因而Σπ(6, 7, 8)与化合物的分配系数log P呈线性相关。式中Σπ(6, 7, 8)含有二次项, 表明这3个位置的疏水性之和有1个最适值, 能够达到最高抑菌作用, 这可能也同时反映了化合物穿越细胞膜的转运过程。ΣF(6, 7, 8)是6、7和8位基团的场效应之和, 是电性诱导效应的一种量度, ΣF(6, 7, 8)项为负系数, 表明6、7、8位基团的推电子的诱导效应有利于提高活性。推测这些位置共同输送电子, 丰富了4位酮基的电荷, 有利于同酶的作用位点结合。这在后述的作用机制中得到回应。

式6中含有二次项的参数都有最适值, 分别是L(1)=4.19、Es(6)=0.66、B4(8)=1.83、Σπ(6, 7, 8)=-1.18, 与前述方程得出的最适值相近, 说明各个位置的取代基变化对抑菌活性的影响是稳定的。具体地说, R1为乙基、R6为氟原子、R8为甲基或氯、Σπ(6, 7, 8)中除去πFπCH3, π7应为-1.88, 这与哌嗪的π值-1.74相近, 所以7位的取代基以哌嗪为宜。[Koga H. Structure-activity relationships and drug design of the pyridine carboxilic acid typ3 (nalidixic acid type) syntheticantibacterial agents. In“药物の构造活性相关[II], 化学の领域, 增刊136号南江堂”, 1982: 177-202; Koga H, Itoh A, Murayama S, et al. Structure-activity relationships of antibacterial 6, 6-disubstituted and 7, 8-disubstituted 1-alkyl 1, 4-dihydro-4-oxiquinoline-3-carboxylic acids. J Med Chem, 1980, 23: 1358-1363]。

3 诺氟沙星的诞生

基于上述QSAR分析的结论, 似乎应当合成2-乙基、6-F、7-N-甲基哌嗪、8-甲基-喹诺酮酸。然而考虑到8-甲基化合物的合成难度, 杏林公司最终选择化合物35为候选药物, 命名为诺氟沙星(norfloxacin), 生物利用度F=30%~40%, 血浆蛋白结合率15%, 血浆半衰期t1/2=3~4 h。经临床研究后, 最初在意大利上市, 1986年经FDA批准在美国上市。

4 诺氟沙星的作用机制

诺氟沙星是杀菌剂, 通过抑制细菌的DNA回旋酶(gyrase)和拓扑异构酶IV (topoisomerase IV)抑制DNA的复制而起到抗菌作用。这两个酶负责调控细菌DNA分子的解旋、松弛、断裂和闭合。在这个过程中, 诺氟沙星通过3位羧基和4位羰基, 以及1、7和8位的基团, 形成沙星-拓扑异构酶-DNA三元复合物, 导致DNA末端的重链被抑制, 使细菌DNA发生断裂[Hawkey PM. Mechanisms of quinolone action and microbial response. J Antimicrob Chemoter, 2003, 51(S1): 29-35]。

5 后续的沙星 5.1 环丙沙星

由德国Bayer公司研发的环丙沙星(36, ciprofloxacin)是继诺氟沙星上市一年后的另一沙星, 借助了Koga等的研发经验, 只在N1的乙基增加一个碳原子成环丙基, 化合物对革兰氏阴性菌的活性提高了2~10倍, 尤其对绿脓杆菌的抗菌作用强于诺氟沙星4倍。环丙沙星的口服生物药代F=70%, 与血浆蛋白结合率为20%~40%, 血浆半衰期t1/2=4~6 h。作为跟随性的模拟创新药物, 环丙沙星的药效学和药代动力学性质显著超越首创药物, 这种后来者居上, 在20世纪80年代是常见的现象, 反映出首创药物在优化活性或成药性方面的不足。

5.2 左氧氟沙星

日本第一制药的Hayakawa等在1980年合成了消旋的氧氟沙星。氧氟沙星的骨架可视作氟甲喹(4)的电子等排体, 即与8位连接的次亚甲基被氧原子替换。虽然氟甲喹是合成的喹诺酮类第一个含氟的上市药物, 只因7位没有含氮杂环, 吸收性较差。氧氟沙星含有一个手性碳, 拆分为光学异构体, 证明S-(-)-构型为优映体, 其抗菌活性为消旋体的2倍, 强于R-(+)-劣映体1~2个数量级, 对于革兰氏阴性和阳性菌有强效广谱抗菌活性。左氧氟沙星的结构特征是用含氧烷链连接了N1和C8形成六元杂环, 这个结构因素其实在Koga的QSAR模型中已经预示了N1和C8结构可变性。左氧氟沙星口服后可完全吸收到血液中, 血浆半衰期为6~8 h, 主要以原形药从尿中排出(Hayakawa I, Atarashi S, Yokohama S, et al. Synthesis and antimicrobial activities of optically active ofloxacun. J Antimicrob Chemother, 1986, 29: 163-164)。

5.3 本世纪上市的沙星

细菌耐药性的出现不断催生了新一代的沙星的研发, 在本世纪已有多个新的沙星药物上市, 2002年诺华上市的巴洛沙星(38, balofloxacin)和三菱制药研发的帕珠沙星(39, pazufloxacin), 2003年Oscient研发的吉米沙星(40, gemofloxacin), 2008年第一制药三共株式会社上市的西他沙星(41, sitafloxacin)以及2009年辉瑞(原研Baunsch & Lomb)上市的贝西沙星(42, besifloxacin)。这些沙星的化学结构基本保持了首创药物诺氟沙星的原型, 只是在C7、C8和(或) N1作些改动罢了。有趣的是, 改动的幅度仍然在Koga推导的QSAR的框架之内。上海药物所杨玉社等研制的安妥沙星(43, antofloxacin)为(S)-5-氨基氧氟沙星, 是具有抗耐药菌谱广和安全性高的跟随性创新药物, 也是当初Koga等未曾考察的结构位置。安妥沙星于2009年经CFDA批准在我国上市。