药学学报  2016, Vol. 51 Issue (10): 1638-1642   PDF    
高分辨率熔解曲线技术在多基原药材升麻鉴定中的应用
孙伟1, 熊超1,2, 李景剑3, 刘合刚2, 胡志刚1,2, 刘迪2, 任伟超1, 陈士林1,2     
1. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700 ;
2. 湖北中医药大学药学院, 湖北 武汉 430065 ;
3. 华南农业大学林学与风景园林学院, 广东 广州 510642
摘要: 高分辨率熔解曲线(HRM)分析是一种实时定量PCR技术,在核苷酸差异检测中具有快速、灵敏和准确等突出的优点,近几年来在基因突变、基因分型和遗传多样性等研究中发展迅速,但目前该技术应用于中药材鉴定的相关报道较少。本研究选取多基原药材升麻作为研究对象,广泛收集其主产区药材基原及其常见混伪品共41个样品,基于植物DNA条形码ITS2序列,通过对HRM反应体系和反应条件的优化,建立检测升麻及其混伪品的核酸荧光定量Bar-HRM方法,实现对升麻药材及其混伪品的鉴定,从而确保用药安全。该方法的特异性和灵敏性研究结果显示,升麻3个基原的各单倍型均能很好地表现出差异性,升麻及其混伪品均表现出良好单系性,能明显区分开。本研究证明HRM技术对升麻药材及其混伪品的鉴定能力强,在方法通用性和数据可视化方面具有优势,应用前景广阔。
关键词: 升麻     高分辨率熔解曲线     中药鉴定     ITS2    
Application of high resolution melting curve to identification of Cimicifugae Rhizoma
SUN Wei1, XIONG Chao1,2, LI Jing-jian3, LIU He-gang2, HU Zhi-gang1,2, LIU Di2, REN Wei-chao1, CHEN Shi-lin1,2     
1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China ;
2. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China ;
3. College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: High-resolution-melting analysis (HRM) is a new technology derived from qPCR and is widely used in the study of polymorphism, genotyping, and single nucleotide mutation. Advantages of HRM include cost-effectiveness and time-efficiency over PCR-based genotyping. However, the application of HRM in the authentication of herbal products is still limited with few studies on the classification and identification of herbal products. In this study, Cimicifugae Rhizoma was used as an example to verify the stability and accuracy of HRM technique in identification of Chinese materia medica. HRM assay was established for identification based on ITS2 region of Cimicifugae Rhizomas and its adulterants (including 41 samples). Our findings showed that HRM allows not only the identification of adulteration but also the quantification of the most common admixture. This study is significant for better quality in the verification of the authenticity of herbal medicine. The method is promising for future identification of traditional Chinese medicinal materials.
Key words: Cimicifugae Rhizoma     high resolution melting     identification of traditional Chinese medicinal materials     ITS2    

2015年版《中国药典》规定升麻为毛茛科大三叶升麻(Cimicifuga heracleifolia Kom.)、兴安升麻[Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.]、或升麻(Cimicifuga foetida L.)的干燥根茎, 具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功效[1]。升麻是世界公认的著名植物药, 其提取物广泛用于治疗更年期综合征和骨质疏松等, 在欧美备受关注。升麻药材与同属植物混用、误用较为常见, 随着时代变迁, 不断出现新的混伪品进行替代, 造成临床用药较为混乱[2], 为解决这一问题亟需寻找一个快速鉴别的方法。

高分辨率熔解曲线(high resolution melting, HRM)是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种新兴技术[3, 4]。由于HRM技术在核苷酸差异检测中具有快速、灵敏和准确等突出的优点, 近几年来, HRM技术广泛应用于单核苷酸多态分析、突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等研究, 已成为生命科学研究中的热点技术[5-9], 该技术已在药用植物鉴定中逐渐兴起[10, 11]。中国学者通过大样本量系统研究, 提出ITS2 (internal transcribed spacer 2)序列可以作为植物物种鉴别的通用条形码用于鉴定药用植物和近缘种[12]。目前以ITS2为主体的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》已被纳入2015版中国药典第四部。

为验证HRM技术在中药鉴定的可行性与准确性, 本文作者选取升麻药材作为研究对象, 广泛收集其主产区药材基原及其常见混伪品共41个样品, 对其进行真伪鉴定。基于植物DNA条形码ITS2序列, 通过对HRM反应体系和反应条件的优化, 尝试建立检测中药材混伪品的荧光定量Bar-HRM方法, 为完善中药材DNA条形码鉴定体系提供技术支持。

材料与方法

材料  本研究通过实地采集、药材市场购买等方式收集升麻药材及其混伪品样本41份。升麻样品分别为大三叶升麻基原植物3份; 兴安升麻13份, 包括基原植物2份, 药材11份; 升麻7份, 包括基原植物2份, 药材5份。混伪品样品有:南川升麻药材5份; 单穗升麻基原植物5份; 小升麻药材5份; 类叶升麻基原植物1份; 落新妇基原植物1份; 假升麻基原植物1份。实验材料经中国中医科学院中药研究所孙伟博士鉴定, 凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所。详细信息见表 1

Table 1 Sample information and number of Cimicifugae Rhizoma and its adulterants used in this study

试剂  植物基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。2 × HRM PCR master mix试剂盒购于凯杰(德国)生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。

样品DNA提取  升麻及其混伪品药材用75%乙醇擦拭药材表面后, 刮去外表皮, 取内部的药材约50 mg (叶片30 mg), 用研磨仪(Sceintz-48, 宁波新芝)研磨2 min (每秒50次)后, 利用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co., China)提取总DNA。采用Qubit 3.0分光光度计(Invitrogen Co., USA)测量DNA浓度, 逐步将DNA浓度稀释或浓缩到50~60 ng·μL-1并保存于-20℃备用。

PCR扩增  PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析在Rotor-Gene Q MDx (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)荧光PCR仪上进行, 反应试剂来自QIAGEN®HRM PCR master mix试剂盒, 序列扩增引物采用ITS2通用引物(ITS2F: 5'-ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT-3', ITS3R: 5'-GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT-3')。在实验过程中, 对反应体系进行了优化, 结果发现最佳的反应体系为25 μL, 50~60 ng基因组DNA 1.0 μL、2 × HRM PCR master mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL, 补足ddH2O至25 μL。最佳反应条件是采用72孔反应模块, 扩增程序为94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 循环40次, 每个循环结束时收集荧光信号数据。扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行, 程序为:熔解温度从70 ℃逐渐升温至90 ℃, 每0.15 ℃收集一次荧光信号。HRM-PCR扩增产物使用ABI 3730XL测序仪(Applied Biosystems Co., USA)进行双向测序。

数据分析  高分辨率熔解曲线分析采用QIAGEN公司的Rotor-Gene Q (version 2.3.1.49)软件进行。对获得的序列运用CodonCode Aligner V 4.2.5 (CodonCode Co., USA)进行测序峰图的校对拼接, 去除低质量序列及引物区; 使用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法[13]去除两端5.8S和28S区段, 获得ITS2间隔区序列。

结果与分析

ITS2-HRM分析结果显示大三叶升麻、兴安升麻、升麻和混伪品的熔解曲线都表现出不同的形状特点。在本研究中, 大三叶升麻具有1个单倍型, 兴安升麻具有5个单倍型, 升麻具有3个单倍型, 如图 1所示, 各单倍型均能相互分开, 且各物种的多个单倍型各自能聚在一起, 反映了升麻药材种内差异远小于种间差异, 故各物种的多个单倍型能聚在一起。针对升麻药材典型的混伪品, 图 2显示大三叶升麻、兴安升麻、升麻与混伪品能够很好地区分开。分型间的差异视图除了可以通过标准化的随温度变化的熔解曲线(normalized and shifted melting curve)形式来展示外(图 2a), 也可用其派生的曲线形式(normalized and temp-shifted difference plot)来表示(图 2b)。图 2b以基原植物升麻为基线, 与升麻其他基原以及混伪品相对荧光值的差值为纵坐标而生成派生熔解曲线。尽管从图 2a的形状变化可以明显地看出基因型的差异, 但其派生的图形可以使这种差异放大, 从而更方便观察基因型间的差别。最后, 通过基因型(geno types)设置, 以基原物种升麻作为参照, 并设置基因型置信值(genotype confidence percentages, GCPs)≥90%, 结果显示, 所有的升麻药材及其混伪品样品都能准确的鉴定。

Figure 1 Melting curve profiles of amplicons obtained by HRM analysis of the three species of Cimicifugae Rhizoma with the ITS2 type indicated. (a) Normalized melting profiles of three species with the ITS2 type indicated. (b) Difference curves of three species with one haplotype of C. foetida as the reference genotype. Color-coded legend of species corresponded to the colors of the melting curves

Figure 2 Melting curve profiles of amplicons obtained by HRM analysis of the nine species with the ITS2 type indicated. (a) Normalized melting profiles of nine species with the ITS2 type indicated. (b) Difference curves of nine species with C. foetida as the reference genotype. Color-coded legend of species corresponded to the colors of the melting curves

为了验证HRM的实验结果, 将HRM-PCR扩增产物进行双向测序, 将获得的ITS2序列在中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn)或GenBank数据库中应用BLAST (basic local alignment search tool)方法进行结果判定, 结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种, 结果见表 2

Table 2 The results of ITS2 sequences in this study
讨论

近20年来, 中药鉴定学新方法层出不穷, 常规的方法有光谱鉴定、显微鉴定、生物效应鉴定、DNA芯片、仿生鉴定和DNA条形码技术鉴定等[14]。2010年Chen等[15]提出ITS2序列可以作为标准DNA条形码鉴别药用植物及其近缘物种后, Yao等[16]基于大样本量分析证实ITS2序列可以作为植物物种鉴别的通用条形码。目前比较大的DNA barcoding数据库常以rbcL、matK、ITS2和psbA-trnH四个片段为主, 但由于前两个片段在物种间的变异度较低, 在HRM应用过程中的实用性较低, 而ITS2是一段相对较短、有足够变异且两端相对保守的基因片段, 在HRM应用中也具有较好的区分度, 故以ITS2为主和psbA-trnH为辅建立了中药材DNA条形码鉴定系统(www.tcmbarcode.cn), 也为Bar-HRM结果后续进一步验证提供了一定的标准手段。针对市场药材的检测过程, Bar-HRM提供了一种高效、直观的鉴别方式。高分辨率熔解曲线分析是近年来发展起来的一项荧光定量PCR新技术, 该技术是一种操作简单、样品不易污染、成本低、通量高的辨别DNA多态性的方法, 满足植物种质资源真实性和纯度检测标准化自动化发展的要求, 是一种理想的植物种质资源鉴定技术。

2009年, Xue等[17]将ITS序列与熔解曲线技术结合, 依据Tm值的不同对升麻药材及其混伪品, 以及市售升麻药材进行鉴定。而本文主要采用的是ITS2序列与高分辨率熔解曲线技术结合, 根据高分辨率熔解曲线的不同对升麻药材3个基原各单倍型区分, 以及可更直观更便捷对其混伪品进行鉴定。本研究在Xue[17]和Chen[18]等的基础上, 将DNA条形码与HRM技术相结合逐步探索在中药材鉴定中的应用, 以及为后续实际应用提供理论与技术基础。

本研究通过对升麻药材和混伪品进行检测, 所有的升麻正品药材的检测结果特异性较强, 各物种能够分别聚为一支, 同时, 也较容易与混伪品区分开。

HRM在广泛的应用实践中得到迅速发展, 其相关的理论和技术得到不断丰富和完善, 使HRM具有成为类似于PCR、凝胶电泳、DNA测序等重要技术手段能得到推广普及的潜力。将HRM分析作为DNA条形码的补充手段能够更加快速、准确地完成中药鉴定的工作, 在今后的药材流通、市场管理等实际应用中具有极大的价值。

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