近年来,我国动脉粥样硬化 (atherosclerosis,As) 的发病率始终处于上升趋势,已成为严重危害人类健康的一大元凶,并且有逐渐年轻化的趋势。As不稳定斑块破裂、继发血栓形成所致急性心血管事件,成为As致死的主要原因。As斑块破裂与否取决于斑块的稳定性,炎症反应是不稳定斑块的突出特征。研究发现,动脉外膜炎症在As的发生发展中发挥不可忽视的作用,被激活的血管外膜积极参与了As发生发展的全过程。血管外膜分布的成纤维细胞、肥大细胞、树突状细胞及滋养血管、血管相关淋巴组织和血管周围神经等均可参与As发生发展进程[1]。其中肥大细胞在动脉粥样斑块部位血管外膜处明显聚集,并被大量激活、脱颗粒,削弱纤维帽,成为As斑块失稳定乃至破裂[2, 3]的重要原因之一。
参莲片由丹参、穿心莲组成,是根据中医临床经验,针对As炎症反应网络、以活血化瘀、清热解毒法组方用以预防和治疗As疾病的中药复方。前期研究证实,参莲片对As疾病具有良好的预防和治疗作用,可局限As斑块面积,减轻病变程度,其作用与阻断As炎症反应有关[4-7]。
本实验在建立apoE-/-小鼠外膜肥大细胞活化介导的不稳定斑块模型的基础上,研究参莲片对不稳定斑块及其活化过程中炎性反应的影响,深入探讨对其不稳定斑块保护作用的机制。
材料与方法动物 apoE-/-小鼠,SPF级,雄性,体重20~22 g,由北京大学医学部提供,动物许可证号SCXK (京) 2011-0012; 雄性C57B/L小鼠,体重20~22 g,由北京大学医学部提供,动物许可证号SCXK (京) 2011- 0012; 雄性SD大鼠,体重250~300 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号: SCXK (京) 2012-0001。
药品与试剂 P物质 (substance P,批号: 021M5060V)、普朗尼克F-127 (批号: SLBC8439V),均购于美国Sigma公司; PE Rat Anti-Mouse CD117抗体(批号: 2104559) 购于美国BD公司; 重酒石酸去甲肾上腺素 (批号: 1001343435) 购于武汉远大制药集团有限公司; 血清总胆固醇 (serum total cholesterol,TC) 试剂盒 (批号: 20121203)、高密度脂蛋白 (high density lipoprotein,HDL-C) 试剂盒 (批号: 20120827) 由北京北化康泰临床试剂有限公司提供; 血清高敏C反应蛋白 (serum high-sensitivity C reactive protein,hs-CRP,批号: F182038)、基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9,MMP-9,批号: F337626)、白介素- 1β (Interleukinil- β,IL-1β,批号: F406575)、核因子- κB (nuclear factor kappa B,NF-κB,批号: F117068)、小鼠组胺 (histamin,批号: F331887) ELISA试剂盒均由美国Uscn Life Science & Technology公司提供; 蛋白定量试剂盒 (BCA法,货号: 23227) 由美国Pierce公司提供。MicroRotofor裂解试剂盒 (货号: 1632141)、Bio-RadBi o-Plex信号转导检测试剂盒 (货号: LQ00000S6KL81S),由美国Bio-Rad公司提供; 参莲片采用中试品干浸膏粉,为棕黄色粉末,采用醇提取、大孔吸附树脂富集纯化的方法制备,提取物中含丹参酮ⅡA 3%、丹酚酸B 38%、穿心莲内酯20%[8],由中国中医科学院中药研究所化学室提供; 阿托伐他汀钙片(atorvastatin,批号: 029012K) 购于美国辉瑞公司; 色甘酸钠 (cromoglicate sodium,批号110711) 由江苏克胜药业有限公司提供; 其他试剂均为分析纯。
仪器 ST21台式高速冷冻离心机 (美国杜邦公司); FV1000激光共聚焦显微镜 (日本Olympus公司); Bio-Plex悬浮分析系统 (Bio-Plex 200 reader,美国 Bio-Rad公司)。
体外实验[9]大鼠腹腔肥大细胞培养 SD大鼠断颈处死后,将大鼠 (除头部外) 于80% 乙醇浸泡数秒后取出,四肢固定于操作台上,静脉注射 (ip) 无钙台氏液20 mL (100 mL中含NaCl 0.8 g、KCl 0.02 g、NaH2PO4·H2O 0.005 g和D-glucose 0.11 g),轻按揉腹部4 min,打 开腹腔,吸取腹腔冲洗液,1 500 r·min-1离心10 min,弃上清,取细胞悬液缓慢加入Percoll梯度分离液中,2 500 r·min-1离心15 min,收集30% 和80% 交界处 细胞,磷酸盐缓冲液 (PBS) 清洗2次 (4 ℃,1 500 r·min-1离心10 min),置于RPMI 1640培养液中镜下计数,调细胞数至5~6×106个/mL。台盼蓝染色活力大于95%,甲苯胺蓝染色纯度大于90%。
细胞分组与处置 分为对照组、模型组、参莲片各剂量组 (100、50、25和12.5 mg·L-1) 及色甘酸钠 (200 μg·L-1) 组。
药物干预及刺激剂刺激肥大细胞脱颗粒 细胞以5×106个/mL接种于96孔培养板中,每孔100 μL,加药预处理2 h后(加药量为每孔10 μL) 加入刺激剂P物质 (200 μg·mL-1) 37 ℃孵育2 h,1 500 r·min-1离心5 min,取上清液,加入PBS清洗细胞1次,离心后加入PBS置于-80 ℃冰箱中反复冻融3次,离心后取上清液 (细胞裂解液)。
检测指标 检测细胞上清液中组胺和类胰蛋白酶含量,并计算释放率; 检测上清液中炎症因子IL-1β和NF-κB表达。
体内实验分组及处置 将雄性C57B/L小鼠作为正常对照组 (C),将雄性apoE-/-小鼠随机分为模型组1 (M1)、模型组2 (M2)、模型组3 (M3),参莲片低、中、高剂量组 (95、190和380 mg·kg-1·d-1),阳性对照阿托伐他汀组 (2.6 mg·kg-1·d-1)。
造模方法[10] 对照组和M1进行颈动脉套管假手术,其他组颈动脉实施套管手术,术后即给予高脂饮食 (含基础饲料79%、猪油10%、胆固醇1%、蛋白粉10%,喂养6周) 建立动脉粥样硬化模型。术后1周起参莲片各剂量组和阳性对照组分别给予参莲片和阿托伐他汀钙。术后6周对照组、M1组和M2组于右侧动脉套管部位滴加空白凝胶,M3组在套管部位滴加P物质凝胶 (0.5 μg/只) 诱发斑块破裂、出血及炎症反应。
取材方法 滴加空白或P物质凝胶3天后取材。小鼠经眼眶取血,3 500 r·min-1离心15 min,分离血清,低温冰箱冻存待测。小鼠处死后取颈总动脉和主动脉弓,常规固定,石蜡包埋。
病理学检测HE染色 将固定好的组织经梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋后,4 μm切片,进行HE染色,光镜观察病理变化。
斑块内出血检测 HE染色后以光镜下血管壁中红细胞沉积及共聚焦显微镜560 nm激发光下红细胞自发荧光判断斑块内出血情况。比较组间斑块内出血发生率。
肥大细胞脱颗粒 切片经脱蜡复水,进行甲苯胺蓝染色,肥大细胞颗粒异染呈紫红色,二甲苯透明,中性树胶封片,在光镜下观察外膜处肥大细胞浸润数量及脱颗粒情况 (包膜破损,胞质中深染颗粒物释放到周围组织中为脱颗粒细胞) 。
肥大细胞CD117表达 按照HE染色中方法脱蜡复水后进行抗原修复,滴加封闭用正常山羊血清封闭液,37 ℃孵育30 min,甩干不洗,滴加PE Rat Anti-Mouse CD117荧光抗体,37 ℃孵育1 h,室温放置10 min,PBS洗5 min×3次。滴加DAPI 避光孵育2 min,PBS洗1 min×3次,最后用含抗淬灭剂甘油封片,并在共聚焦显微镜下观察 (激发光波长488 nm,发射光峰值575 nm)。
血清脂质检测 取血检测总胆固醇,高密度脂蛋白含量,计算动脉硬化指数 (AI)[11]。AI = (TC - HDL-C) / HDL-C。
血清斑块稳定相关因子、肥大细胞活化相关因子检测 取血检测hs-CRP、MMP-9及组胺含量。
血管组织中信号转导蛋白检测 -80 ℃保存样品冰上融化,MicroRotoforTM裂解试剂盒裂解后,以12 500 r·min-1,4 ℃离心10 min,收集上清置于冰上,测定蛋白浓度; 稀释样品,用Bio-Rad磷酸化检测试剂盒检测血管组织中p-IκB、p-ERK1/2、p-p38 MAPK、p-Stat3、p-c-JUN、p-IGF-IR、p-MEK1和p-Akt,实验过程严格按照试剂盒说明书操作。使用Bio-Plex悬浮分析系统 (Bio-Plex 200 reader) High PMT设置读板获取数据,并进行数据分析。
统计学处理 所有数据用均数 ± 标准差表示。应用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析统计,两两比较,假定方差齐者用LSD检验,方差不齐采用Dunnett’s T3检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 1 参莲片对P物质诱导大鼠腹腔肥大细胞活化的影响 1.1 参莲片对P物质诱导大鼠腹腔肥大细胞组胺、类胰蛋白酶释放的影响由研究结果可见,P物质刺激后可显著升高大鼠腹腔肥大细胞组胺、类胰蛋白酶的释放 (P < 0.05或 P < 0.05); 参莲提取物100、50和25 mg·L-1组可显著降低组胺释放率 (P < 0.01或P < 0.05); 参莲提取物100、50、25和12.5mg·L-1组可显著降低类胰蛋白酶释放率 (P < 0.01或P < 0.05) (表 1)。
P物质刺激后均可显著升高大鼠腹腔肥大细胞细胞上清中IL-1β和NF-κB含量 (P < 0.01); 参莲提取物组100、50、25和12.5 mg·L-1可降低其含量,并呈剂量依赖性 (P < 0.01或P < 0.05) (表 2)。
对照组和M1组在造模期内右颈总动脉血管内膜未见明显泡沫细胞积聚,中膜及外膜结构正常 (图 1A,B。M2组和M3组均可见套管处动脉内膜增厚,可见较多泡沫细胞聚集,斑块形成明显,部分斑块从内膜上脱落,其中M3组炎症细胞浸润较明显。结果表明,局部套管手术可有效促进血管局部斑块形成,P物质刺激后,局部炎症反应增强 (图 1C,D)。参莲片各剂量组 (380,190,95 mg·kg-1) 右颈总动脉病变较M2、M3组均有不同程度的减轻 (图 1E~G)。阿托伐他汀组 (2.6 mg·kg-1) 管腔内未见斑块形成,内膜可见少许泡沫细胞聚集,中膜及外膜结构正常,血管壁周围可见轻度炎细胞浸润 (图 1H)。提示参莲片和阿托伐他汀预防性给药均可有效减轻As斑块形成及斑块活化过程中的炎细胞浸润。
3个模型组 (M1、M2和M3) 较对照组的TC 含量显示升高 (P < 0.01)、HDL-C含量明显降低 (P < 0.01),AI值增加10倍以上 (表 3)。表明apoE-/-小鼠饲喂高脂饲料可显著影响动物血清脂质含量,而颈动脉套管手术及P物质诱发对其影响不明显,故3 个模型组间无差距。参莲片各剂量组对各 模型组TC、HDL-C含量有一定的影响,但差别无统计学意义,参莲片380和190 mg·kg-1剂量组可明显改善模型组AI值的异常增高 (P < 0.05),降低动脉粥样硬化发生风险。阿托伐他汀对HDL-C、AI也有明显改善作用。
结果表明,对照组、M1组、M2组血管外膜处均可见少量的肥大细胞脱颗粒,M3组经P物质刺激后血管外膜脱颗粒的肥大细胞明显增多,存在明显的肥大细胞活化现象。参莲片各剂量组及阿托伐他汀组脱颗粒情况有减轻趋势,但仍重于对照组 (图 2)。
对照组及M1组血管壁基本无肥大细胞浸润,M2组有少量分布,M3组血管中CD117阳性染色显著增强,结果表明肥大细胞浸润明显增多。参莲片各剂量组荧光强度明显减弱,阿托伐他汀组作用更明显 (图 3)。
对照组、M1组、M2组均未见斑块内出血现象。M3组经神经肽刺激后,HE染色光镜下斑块内出血情况明显,内皮下有大量出血点 (图 4C),共聚焦显微镜下560 nm处自发荧光显著升高 (图 5C) 斑块内出血发生率达40%。参莲片各剂量组和阿托伐他汀组对斑块内出血情况有不同程度减轻,光镜下出血点减少,560 nm处自发荧光强度减小 (图 4E,H; 图 5E,H),斑块内出血发生率低于20%。
检测结果表明,M1组、M2组血清斑块稳定相关因子hs-CRP、MMP-9和组胺含量均与对照组无明显差别; M3组经神经肽刺激后,hs-CRP、MMP-9和组胺含量均显著升高 (P < 0.01)。参莲片各剂量及阿托伐他汀组显著降低了hs-CRP、MMP-9和组胺含量,与M3组比较有显著性差异 (P < 0.01或P < 0.05) (表 4)。
为进一步探索参莲片增加斑块稳定性的机制,选取M2、M3和参莲片190 mg·kg-1组血管组织检测了信号转导相关蛋白磷酸化水平。结果表明,经神经肽刺激的M3模型组血管组织中IκB、p38 MAPK、ERK1/2和c-JUN的磷酸化水平都有显著增高,p-Stat3、p-MEK1和p-Akt无明显变化,表明在此模型中存在多条信号通路活化的现象。参莲片190 mg·kg-1组可减轻模型组血管组织中IκB和p38 MAPK磷酸化程度,从而发挥抗炎作用。此外,在M3模型中还发现IGF-1R磷酸化明显降低,参莲片可显著增高模型组血管组织中IGF-1R磷酸化水平 (P < 0.05) (图 6)。
As稳定斑块向不稳定转变与心血管急性事件密切相关,炎性反应是导致斑块不稳定的重要原因之一。提高As斑块稳定性是现代心血管疾病防治的研究热点。
肥大细胞是多种炎症性疾病,如心血管病、代谢性疾病及其相关并发症至关重要的效应器,其发挥生理、病理作用与其释放组胺颗粒、细胞因子、趋化因子、特异性糜蛋白酶和类胰蛋白酶等蛋白酶类有关[12]。现已证实肥大细胞特异性蛋白酶可直接或间接参与As形成过程[13, 14],斑块中溶血磷脂酸蓄积增加是血管外膜肥大细胞激活诱发斑块失稳定过程中的一个重要因素[15]。肥大细胞蛋白酶如人类β-类胰蛋白酶可能成为药理学的靶标[16]。
多种神经肽如黑皮质素[17]、神经肽Y[18]和P物质[10]均可影响As斑块稳定性,其中神经肽Y和P物质的诱导作用与活化血管壁肥大细胞有关。肥大细胞通过分泌和活化蛋白水解酶 (胃促胰酶、类胰蛋白酶和金属蛋白酶) 降解细胞外基质中的胶原,斑块纤维帽中的主要蛋白成分,调节内皮和平滑肌细胞的增殖和凋亡,诱导斑块内出血[10],导致斑块不稳定。
前期实验中作者已发现,参莲片对大鼠腹腔肥大细胞C48/80刺激肥大细胞脱颗粒有一定的稳定作用[9]。本实验中,首先采用神经源性炎症介质P物质进一步验证参莲片对肥大细胞活化的保护作用。结果显示,P物质对大鼠腹腔肥大细胞的组胺和类胰蛋白酶释放率、炎症介质释放都有明显升高作用,而加入参莲片预处理后,明显抑制了P物质对肥大细胞的活化作用,组胺释放率、炎症因子释放均明显降低,提示参莲片具有稳定肥大细胞的作用。
在体外确证参莲片对活化肥大细胞具有膜稳定作用的基础上,采用apoE-/-小鼠颈总动脉套管合并高脂饮食诱导As斑块形成,在套管部位血管外膜处滴加P物质建立外膜肥大细胞活化介导的不稳定斑块模型。结果表明,滴加P物质后模型组可见血管 外膜处肥大细胞增殖和脱颗粒,同时诱发病灶处外膜炎性细胞的浸润,斑块内可见出血 (红细胞沉积),中膜平滑肌变薄,伴随血清中组胺含量、斑块炎性活化相关指标hs-CRP、MMP-9显著增高,斑块组织中IGF-1R磷酸化明显降低,提示存在肥大细胞颗粒物质释放及其诱导的炎症反应,同时斑块基质成分降解明显,表明本模型有典型的P物质致肥大细胞活 化介导的As斑块的不稳定现象,与文献[10]报道相符,模型构建成功。有研究[19, 20]报道,在活化的肥大细胞中p38 MAPK、NF-κB等炎症调节通路存在相互作用,从而影响肥大细胞TNFα、IL-6等细胞因子的产生,其中NF-κB发挥核心作用。作者发现此模型组血管组织中IκB、p38 MAPK磷酸化水平也明显增高,同时ERK1/2和c-JUN的磷酸化均有增高,表明在此模型中存在多条信号通路活化的现象。这些信号通路间是否存在交互影响?哪条通路发挥主导作用?值得深入探讨。
心血管系统中内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细 胞都可以合成分泌IGF-1及其相应的受体和结合蛋白。老年冠心病患者血清IGF-1浓度与IMT、总斑块积分、软斑块积分呈负相关关系,低浓度的IGF-1可能增加斑块的不稳定性。急性脑梗死患者颈动脉As斑块稳定性与血清IGF-1的相关性分析发现,血清IGF-1水平的减少与不稳定性颈动脉粥样硬化斑块形成有密切联系。本实验结果证实,参莲片可减轻As斑块形成,降低动脉粥样硬化指数AI,与本课题组前期研究结果一致。同时,参莲片可减轻外膜肥大细胞活化介导的不稳定斑块模型病灶外膜炎性细胞浸润和斑块内出血程度,增高模型组血管组织中IGF-1R磷酸化水平,从而发挥增加As斑块稳定性作用。
总之,本研究表明,参莲片对As斑块稳定性具有一定的干预作用,由于As的复杂性及研究的阶段性,参莲片对As斑块稳定性的深入机制尚有待进一步研究。
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