2016, Vol. 51
2. 中山大学临床药理研究所, 广东 广州 510060 ;
3. 中山大学附属第一医院器官移植科, 广东 广州 510060 ;
4. 中山大学中山眼科中心, 中山大学眼科学国家重点实验室, 广东 广州 510060
2. Institute of Clinical Pharmacology, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China ;
3. Kidney Transplant Department, Transplant Center, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China ;
4. State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China
他克莫司 (tacrolimus,FK506) 属于钙调神经蛋白抑制剂(calcineurin inhibitors,CNIs),是目前肾移植患者术后使用的一线抗排斥药。适当的他克莫司浓度对移植肾的长期存活至关重要[1],浓度过低易因移植物的排斥而导致移植失败,浓度过高则易导致感染及肝肾毒性的发生,他克莫司治疗窗窄,浓度应控制在5～10 ng·mL-1内。同时,体内代谢研究显示,他克莫司药动学个体差异极大[2]。临床上常规采用治疗药物监测 (therapeutic drug monitoring,TDM) 对其浓度进行监测[3],监测不但需要频繁进行,且不可避免地具有滞后性。因此,运用药物基因组学寻找新型生物标记物,在患者服药前预测其所需剂量,使血药浓度尽早达到治疗窗,将大大提高疗效及降低不良反应发生率。
他克莫司主要经CYP3A4、CYP3A5代谢[4],同时也是P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp) 的底物[5]。CYP3A5*3基因型与他克莫司浓度密切相关,是目前遗传药理学/药物基因组学研究一致的结论[6-8],CYP3A5*3的突变可引起可变剪切,产生不稳定的蛋白质,从而使携带CYP3A5*3/*3 基因型的人不表达CYP3A5,导致较高的他克莫司血药浓度。近年来,药物转运体的遗传药理学特征及其对药代、药效、药物毒性反应等方面的研究越来越受到重视。药物摄取和外排转运体的联合作用是药物吸收和消除过程中的关键性因素。P-gp属外排型转运体,作者[9]前期研究证实,在CYP3A5非表达型者中,其编码基因MDR1 C1236T、G2677T/A、C3435T的TTT-TTT型携带者他克莫司剂量校正谷浓度显著高于非TTT-TTT型携带者,因其突变,导致P-gp活性降低,使更多药物在体内蓄积,他克莫司浓度显著升高。
有机阴离子转运多肽OATP1B1 (又称OATP-C,编码基因SLCO1B1) 是一种特异性分布于肝细胞基底膜上转运蛋白,促进肝细胞将药物从肝门静脉血液中摄入细胞内[10]。肝脏作为药物最主要的代谢器官,OATP1B1转运体的摄取,使得药物在肝细胞内特异性聚集。他克莫司被证实是OATP1B1的底物之一[11]。研究表明,OATP1B1转运功能受特定的基因多态性影响,并直接影响底物药物的转运活性、代谢特征及其药理、毒理效应[12]。因此,SLCO1B1基因多态性极有可能是造成他克莫司个体吸收率及清除率巨大差异的原因之一。然而,目前国内外均未见相关报道。本实验拟通过回顾性研究,探索中国人群中常见的SLCO1B1基因的两个SNP-rs2306283 (388 A > G) 和rs4149032位点多态性与早期肾移植患者他克莫司浓度的相关性,为临床实施基因导向性个体化用药提供依据。
材料与方法试剂与仪器 引物 (中国Sangon公司); Complete iPLEX Gold Genotyping Reagent Set 96试剂盒 (美国Agena Bioscience公司)。
Veriti梯度PCR仪 (美国ABI公司); DNA质谱阵列基因分析系统 (美国Agena Bioscience公司); IMX全自动免疫分析仪 (美国Abbot公司)。
受试对象 本研究纳入2008年7月至2013年1月期间于中山大学附属第一医院器官移植中心进行肾移植手术的患者,共89例。入选患者均为首次接受肾移植手术,术后均采用他克莫司+霉酚酸酯+泼尼松三联免疫抑制疗法,且肝功能指标正常。他克莫司起始给药剂量0.05～0.075 mg·kg-1,每天两次,随后根据谷浓度监测值调整剂量; 霉酚酸酯1.0～1.5 g/天; 泼尼松30 mg/天。排除发生排斥反应或急性感染、接受多器官移植以及合用可能对他克莫司代谢有影响的药物 (如酮康唑、利福平等) 的患者。本研究符合赫尔辛基宣言规定,并经中山大学附属第一医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。
他克莫司浓度检测 患者连续服用同一剂量他克莫司至少3日后,在术后第7天,采集清晨服药前 (即末次给药后12 h) 的静脉血2 mL置于EDTA抗凝真空管,采用微粒子酶免疫法检测他克莫司全血谷浓度。为便于比较,对他克莫司的浓度进行剂量校正,即剂量校正谷浓度=全血谷浓度/体重剂量 (C/D)。
基因型检测 取患者外周静脉血2 mL,参照并优化Loparev等[13]的碘化钠-氯仿法提取基因组DNA。CYP3A5*3的基因型采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态 (polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP) 法检测,SLCO1B1 (rs2306283,rs4149032) 的基因型采用Agena Bioscience Mass ARRAY® system进行检测。所有引物均由美 国Agena Bioscience公司在线软件Assay Design Suite 设计得到 (https://www.mysequenom.com/Tools),见表 1。
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Table 1 Primers for polymerase chain reaction and extension reaction. F: Forward primer; R: Reverse primer; E: Extension primer |
多重PCR反应体系5 μL,包括1×PCR缓冲液、2 mmol·L-1氯化镁、500 mol·L-1 dNTPs、0.1 mol·L-1引物混合物、1 U PCR酶和全基因组DNA 10 ng。用0.5 U虾碱性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase,SAP) 去除游离dNTP。单碱基延伸反应体系2 μL,包括1.57 mol·L-1延伸引物混合物,1×iPlex终止混合物,1×iPlex酶。
PCR反应条件: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共45个循环; 最后72 ℃延伸5 min。SAP反应条件: 37 ℃孵育40 min,85 ℃失活5 min。单碱基延伸反应条件: 94 ℃预变性30 s; 94 ℃变性5 s,以下步骤5个循环: 52 ℃退火5 s和80 ℃延伸5s,共40个循环; 最后72 ℃延伸5 min。
统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。数据以x± s表示; 用χ2检验分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡; 用非参数检验比较不同组别之间他克莫司剂量校正浓度的差异; 采用在线软件SHEsis (http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php) 对各位点之间进行连锁不平衡分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 1 一般资料本研究共纳入89例中国汉族肾移植术后患者,患者的性别、年龄、体重、肝功能、肾功能指标见表 2,经统计分析,各项因素均与他克莫司浓度剂量比无关。
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Table 2 Demographics,clinical characteristics of 89 renal transplant recipients |
CYP3A5*3GG、GA、AA基因型频率分别为57.3%、34.8%、7.9%,G、A等位基因频率为74.7%、25.3%,与作者[9]的前期报道一致。SLCO1B1 rs2306283、rs4149032基因型及等位基因频率见表 3,3个SNP均符合Hardy- Weinberg平衡 (P > 0.05),研究资料具有群体代表性。
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Table 3 Genotype and allele frequency data of SLCO1B1 rs2306283 and rs4149032 in 89 Chinese renal transplant patients |
SLCO1B1 rs2306283、rs4149032各基因型组肾移植患者他克莫司剂量校正谷浓度见表 4,在rs2306283和rs4149032各基因型组中,他克莫司剂量校正谷浓度均无统计学差异。
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Table 4 Comparison C/D (concentration/dose) of tacrolimus in renal transplant patients according to SLCO1B1 rs2306283 and rs4149032 genotypes |
由于CYP3A5*3是目前公认的与他克莫司浓度密切相关的遗传因素,为排除CYP3A5*3基因型作为混杂因素影响分析结果,以CYP3A5*3基因型分层后再考察SLCO1B1 rs2306283、rs4149032基因型与他克莫司浓度的相关性。以CYP3A5*1/*1和CYP3A5*1/*3作为CYP3A5表达组,CYP3A5*3/*3作为非表达组。结果见表 5,在CYP3A5非表达型患者中,SLCO1B1 rs2306283 CC基因型组他克莫司剂量校正浓度显著高于CT+TT基因型组 (P < 0.05)。然而,在CYP3A5表达型患者中则未发现存在相关性。无论在CYP3A5表达型或非表达型患者中,SLCO1B1 rs4149032各基因型组他克莫司剂量校正谷浓度均无统计学差异。
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Table 5 Comparison C/D of tacrolimus in renal transplant patients according to SLCO1B1 rs2306283 and rs4149032 genotypes classified by CYP3A5 genotypes. P < 0.05 vs CC group in CYP3A5 nonexpressers |
有机阴离子转运多肽OATP是摄入型转运体中的一大类,隶属于溶质转运体超家族 (superfamily of solute carriers,SLC),对于内、外源性物质,尤其是药物的吸收、分布、消除具有重要影响[14]。其中OATP1B1转运体作用最为重要,OATP1B1特异性分布于肝细胞基侧膜,是主要的Na+离子依赖性胆酸盐肝摄取转运蛋白,负责将许多内、外源性化合物由肝门静脉系统通过肝血窦一侧主动转运进入肝细胞进行代谢和清除。OATP1B1不仅转运胆汁酸等内源性物质,还参与多种临床重要药物的转运,包括抗生素、抗肿瘤药等[15, 16]。其编码基因SLCO1B1高度变异,已在人群中发现超过40个突变位点,研究表明,SLCO1B1多态性是造成OATP1B1转运功能个体差异的主要原 因[17],然而,SLCO1B1多态性对他克莫司代谢的影响,目前国内外鲜有报道。
文献[18]报道,SLCO1B1 rs2306283突变在亚洲 人比较常见,中国人群中为62%～84%,和本实验结果 (66.3%) 一致。本文发现,在SLCO1B1 rs2306283和rs4149032各基因型组中,他克莫司剂量校正谷 浓度均无统计学差异。以CYP3A5*3基 因型分层后,SLCO1B1 rs2306283多态性与他克莫司浓度的相关 性仅存在于CYP3A5非表达型者中,因此可以推测,他克莫司的代谢主要依赖于CYP3A5,在CYP3A5表达组中,CYP3A5酶对他克莫司的代谢能力较强,OATP1B1介导的他克莫司摄取入肝过程对他克莫司
总体代谢水平影响不大。而在CYP3A5非表达组中,CYP3A5酶对他克莫司的代谢能力相应减弱,此时OATP1B1介导的药物摄取对他克莫司代谢的影响就被体现出来。同时,携带SLCO1B1 rs2306283 CT和TT基因型的患者,他克莫司剂量校正谷浓度显著低于CC型组,依此推测,rs2306283 T碱基突变,使OATP1B1转运活性增强,增加了他克莫司的肝摄取从而促进了它的清除,使血药浓度降低。SLCO1B1 rs2306283是位于外显子5的错义突变,使得OATP1B1蛋白质第130位的氨基酸由天冬酰胺变成天冬氨酸,但暂未见该位点功能的机制研究。目前有关该位点的研究多见于他汀类药物[19],体内研究报道,rs2306283多态性与OATP1B1对普伐他汀的转运活性增强相 关[17],与本文结果一致,但相关机制仍有待进一步探究。SLCO1B1 rs4149032基因多态性曾被报道与利福平体内浓度降低相关[20],但本文未观察到其与他克莫司浓度的相关性,有可能该位点对OATP1B1转运活性的影响存在底物特异性,相关机制有待后续验证。
本研究通过探讨OATP1B1编码基因多态性与他克莫司浓度的相关性,发现在CYP3A5非表达型者中,SLCO1B1 rs2306283T等位基因携带者,他克莫司剂量校正谷浓度显著降低,在临床治疗中,应该考虑肾移植患者SLCO1B1 rs2306283基因的遗传多态性,合理调整给药剂量。此研究结果为运用药物基因组学寻找生物标记物,解释不同个体他克莫司药代、药效差异,指导肾移植术后患者他克莫司个体化用药提供了参考依据。
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