大部分实体瘤存在不同程度的乏氧现象[1]。肿瘤细胞生长迅速,血管供氧能力弱,局部氧分压降低,形成乏氧区域。乏氧细胞对化放疗产生抵抗作用,影响肿瘤迁移和预后[2]。通过检测肿瘤乏氧程度和区域,可评价患者的放化疗敏感性,也可用于肿瘤诊断。通过氧电极、乏氧标志物测定及放射性核素乏氧显像均可检测肿瘤乏氧。而放射性核素乏氧显像作为一种无创手段,得到越来越广泛的应用。
放射性核素经静脉注射、口服等方式进入体内随血液循环并依靠核素自身性质分布 (如碘蓄积于甲状腺),通过PET (正电子发射型计算机断层显像) 和SPECT (单光子发射计算机断层显像) 等技术检测放射信号。绝大部分放射性核素在体内组织分布无选择性,即病灶与正常组织无信号差。因此,需要合适的化合物“引导”放射性核素实现“靶向”于病灶[3]。放射性核素乏氧显像正是基于肿瘤特质——乏氧与正常组织的常氧之间的差别来进行设计的。乏氧显像剂通常包括3部分: 乏氧靶向基团 (识别区)、连接基团及放射性核素 (图 1)[4]。放射性核素作为信号源,在乏氧靶向基团的引导下识别并聚集于肿瘤乏氧组织,产生放射性浓聚区,从而与正常组织产生信号差。连接基团连接靶标与核素,其通常含有N、O、S等原子,提供与放射性核素结合的位点,决定与放射性核素结合的形式以及显像剂的空间位阻,还影响显像剂的还原速率、亲脂性与稳定性等。放射性核素的选择除了考虑半衰期、螯合稳定性和制备方法,更应注意临床普适性,如18F、99mTc。
以硝基咪唑为母核的化合物因其“乏氧靶向性”在乏氧显像剂研究中有着十分重要的作用。目前已研究成功了多种基于PET和SPECT的硝基咪唑类放射性核素肿瘤乏氧显像剂。
1 硝基咪唑类在肿瘤乏氧显像剂中的作用硝基咪唑类化合物的“肿瘤乏氧靶向性”主要是基于硝基咪唑在不同氧浓度下的还原敏感性。正常氧含量的细胞中,该类化合物的硝基在黄嘌呤氧化酶作用下生成自由基阴离子,并迅速再氧化成硝基扩散出细胞; 在乏氧条件下,自由基阴离子被硝基还原酶进一步还原,产物与细胞内组分结合,滞留于细胞内 (图 2)[5]。
18F-MISO (18F-fluoromisonidazole,图 3) 乏氧显像剂最早用于临床,现已广泛用于神经胶质瘤、头颈癌、肾肿瘤和非小细胞肺癌等的诊断。它仅对乏氧活细胞敏感,可明显滞留于氧分压小于10 mmHg的肿瘤细胞中[6]。它的乏氧诊断标准为: 静脉注射2 h后,T/B (肿瘤放射信号/血液放射信号) 值大于1.2的部位为乏氧区域,小于1.0是正常组织。该显像剂早期被认为是硝基咪唑类乏氧显像剂的标准药物,但后来在临床应用中发现其有末梢神经毒性,且从正常组织和血液中清除较慢。18F-FAZA (18F-fluoroazomycin- arabinofuranoside,图 3) 和18F-HX4 (18F-3-fluoro-2-(4- ((2-nitro-1H-imidazol-1-yl) methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)propan-1-ol,图 3) 在18F-MISO基础上增加了亲水性,增加了清除速率,在短时间内拥有更高的肿瘤/背景信号比,缩短检测时间[6, 7]。18F-FAZA和18F-HX4在携荷横纹肌肉瘤R1的大鼠中T/B值分别在2 h、3 h达到最大值 (4.0,7.2),而18F-MISO的T/B值随时间一直增加,6 h时达到9.0,并具有上升趋势。
BMS181321 (Oxo[3,3,9,9-tetramethyl-l-(2-nitro-1H- imidazol-l-yl)-4,8-diazaundecan-2,10-dionedioximato] (3-)-N ',N '',N '''-99mTc,图 3) 是采用99mTc标记的硝基咪唑类乏氧显像剂。与F标记不同的是,由于锝的金属特性,连接基团与锝元素进行螯合需要含较多杂原子结合位点的化合物。BMS181321是第一代该类显像 剂,在肿瘤细胞表现出乏氧选择性,T/M (肿瘤放射信 号/肌肉放射信号) 值在注射后4 h可达到3.5。但是其在体内外稳定性不佳,且背景信号过强,注射2 h后T/B仅为0.31,限制了在临床中的应用[8]。基于BMS 181321的问题,BRU59-21 (Oxo[3,3,9,9-tetramethyl-5- oxa-6-(2-nitro-1H-imidazol-l-yl)-4,8-diazaundecane-2,10-dionedioximato](3-)-N ',N '',N '''-99mTc,图 3) 在BMS 181321基础上进行了结构改造[9],将丙烯桥上的亚甲基取代为氧原子,2-硝基咪唑从连接基团的1位变为6位,这种改造使得BRU59-21结构更加稳定,亲脂性更低,因此与BMS 181321相比,T/B更高,清除的也更快。
2 硝基咪唑类乏氧显像剂显像效果的影响因素经过近40年的发展,开发出18F-MISO、BMS 181321和BRU59-21等典型的硝基咪唑类乏氧显像剂,并进行了临床评价。但依然与理想的乏氧显像剂有一定差距。从临床角度出发,理想的乏氧显像剂应兼具诊断与测定的特点,即能通过显像结构定性判断肿瘤的大小,又能定量测定乏氧的程度,理想的乏氧显像剂应具备[10, 11]: ① 对乏氧 (肿瘤) 组织有特异选择性; ② 具有适宜的脂水分配系数,即具有一定的亲脂性,能够进入包括肿瘤在内的组织,同时具备一定的亲水性,清除速率快,能够达到较高的肿瘤/正常组织比值; ③ 能够建立准确的诊断标准; ④ 具有乏氧依赖的代谢及降解方式; ⑤ 对肿瘤治疗下的氧浓度依然敏感; ⑥ 能够实现氧电极法具备的直接准确反映细胞内氧浓度的特点。
乏氧靶向基团和连接基团的结构设计、改造与修饰是设计更为理想核素显像剂的重要研究内容,同时显像剂进入体内,经过吸收 (静脉注射无此过程)、分布、代谢和排泄等过程,受到体内诸多因素的影响。因此,在设计化学结构时,除了从结构设计层面上重点考察显像效果,还需要研究影响显像剂细胞摄取能力、体内稳定性的因素。下面将从结构及整体性质的角度,探讨影响显像效果的因素,为合理设计乏氧显像剂提供一定的思路。
2.1 硝基的位置咪唑环上硝基的位置主要包括2-硝基咪唑 (2-N)、4-硝基咪唑 (4-N)、5-硝基咪唑 (5-N) 及2-甲基-5-硝基咪唑。2-N还原电位最高,意味着 其在乏氧环境最容易被还原,18F-MISO、BRU59-21等都属于2-N化合物。但并不意味着其他硝基咪唑 化合物不具备应用潜力。99mTc-N4IPA (99mTc-1-(4- nitroimidazole-yl)-propanhydroxyiminoamide,图 4) 在前期2-N的基础上构建为4-N化合物,考察了在U87、A549两种肿瘤模型上的行为,两种模型都表现出了肿瘤强信号,在U87荷瘤小鼠模型中4 h时T/B为3.44,并随着时间进一步增加[12],增加连接基团的长度 (图 4),显像剂亲脂性增加,乏氧细胞中的绝对摄取也逐渐增多,但亲脂性的改变对乏氧选择性无影响[13]。
5-N结构会发生互变异构转化为4-N,因此5-N 显像剂并不常见。分离得到的5-N亚氨基二乙酸化合物 (1 ) T/M较高而T/B较低,反映出5-N显像剂并不具备优势[14]。在5-N的C-2位修饰甲基 (即甲硝唑),尽管会降低还原电势,但可显著提高稳定性。这种甲硝唑二甲酸 (IDA) (2 ) 在注射0.5 h后T/M值1.75,3 h后T/M值高达17,但是T/B值始终小于1,T/B值较低的问题仍未得到明显改善[15]。进一步对连接基团进行修饰,引入醚键并延长碳链的长度 (3 )。醚键的引入显著提高了肝脏的清除率[16],并延长了在肿瘤中的滞留时间,但是亲脂性的提高反而降低了血液、肌肉中的清除率,使得T/M、T/B均降低。考虑单醚键的引入是不够的,对其进行二乙烯乙二醇或三乙烯乙二醇修饰可能会有更好的效果。
在IDA的基础上,对连接基团的N侧链结构改造。图 5分别为IDA、二乙胺 (DETA) 和乙胺乙酸 (AEG) 化学结构,同时改变硝基的位置 (R1、R2、R3),即为2-N、4-N、5-N[17, 18]。9种化合物的结构表明亲脂性相对较高的IDA类具有更高的绝对肿瘤摄取和滞留量; 单电子还原电势 (single electron reduction potential,SERP) 相对更高的2-N化合物显像效果较好; 但是即使2-N的IDA依然面临T/B较低的问题。
基于乏氧滞留的机制,理论上增加还原中心的个数无疑会增强乏氧敏感性。化合物67Ga-DOTA-MN2拥有两个对称性甲硝唑结构 (图 6),注射后6 h时T/B为4.55,T/M为4.42[19]。
以BMS181321为基础开发出多种双硝基咪唑化合物(图 7)。4-N化合物 (6 和7 ) 无论是单或双还原中心均无乏氧选择性,而2-N化合物单中心 (4 ,即BMS181321)、2-N化合物双中心 (5 ) 和2-N、4-N双中心化合物 (8 ) 都表现出很高的乏氧细胞摄取,再次验证了2-N取代的优势。细胞摄取4 h时,化合物5 的乏氧摄取率是化合物4 的2.4倍,表明双还原中心确实促进了乏氧滞留[20]。
采用酰胺键将Cu-ATSM [Cu-diacetyl-bis (N4- methylthiosemicarbazone),一种非硝基咪唑类乏氧显影剂] 和硝基咪唑两种不同还原机制的结构轭合 (图 8)[21]。9 为4-N,10 为2-N,11 与10 相比增加了乙氨基,12 为对照物,保留酰胺键并在末端修饰乙基,保证其与硝基咪唑对酰胺键有相似的空间与电荷效应。4种化合物在细胞中都表现出乏氧选择性,摄取1 h时,12 的乏氧选择指数 (hypoxia selective index,HSI) 仅为0.51,9 为0.64,10 为0.71,11 为0.84,说明双还原中心的设计有显著效果; 10 与9 亲脂性几乎相同,而10 的HSI比9 高,再次验证了硝基位置的微小改变即可影响乏氧敏感度,间接表明硝基咪唑在该双还原系统中的作用可能更加关键; 11 与10 相比,乏氧细胞摄取相当,11 明显降低了常氧细胞摄取,可能是乙氨基引入降低了Cu(I/Ⅱ) 还原电势; 11 效果最好,在不同氧浓度下HSI均高于Cu-ATSM,随着氧浓度的升高,Cu-ATSM的HSI明显下降,而11 在5% 氧浓度下依然具有很高的乏氧选择性,提示11 在温和的乏氧条件下应用的优势。
对于一些多价金属元素如锝、镓,设计连接基团时,要考虑连接基团与金属元素形成配合物的合理性。齿合度即指连接基团中与金属原子产生键合的原子个数。两种齿合度分别为2和3的化合物Tc-Ntm-1和 Tc-Ntm-2 (图 9) 结构近似,但齿合度为3的结构较齿合度为2的结构表现出更高的稳定性、低血浆蛋白结合率、低血液肝脏摄取及更快的清除率。在细胞模型中,Tc-Ntm-2乏氧细胞摄取是常氧细胞摄取的2.2倍; 在动物模型中表现出高T/B、T/M值,注射后2 h时T/B为1.86,T/M为3.11。这可能是由于齿合度为2的化合物热力学稳定性较低,体内的蛋白质易置换配位层中的不稳定水结合分子,造成在组织中滞留较多[22]。
除了靶标硝基咪唑,连接基团中常涉及手性结构。手性结构的存在增加了制备提纯的难度,且不同的对映体可能会表现出不同的药代动力学特征,显像效果有可能不同。以荷瘤 (FaDu) 小鼠为模型,比较了对映体 (R)-18F-MISO和 (S)-18F-MISO的显像效果,结果表明 (R)-18F-MISO在肿瘤、肝、肌肉中的摄取较(S)-18F-MISO快,但是两者的T/M和T/B值在各时间点无差异,且两者在1和3 h的生物分布无显著区别,证实了在临床中使用18F-MISO消旋体是合理的[23]。
2.5 单电子还原电势未取代的2-、4-、5-N的SERP分别是 -418、-527和-450 mV。而加入连接基团后,化合物的SERP将有可能发生改变,从而影响乏氧选择性。研究35种氮芳香环和氮杂环化合物,发现化合物还原电势和脂水分配系数会显著影响乏氧细胞放射增敏性,SERP越高,越容易被还原,提示乏氧敏感性越好; 设计连接基团时,发现当侧链与咪唑环间隔两个以上碳键时对SERP影响较小[24]。而对于Cu-ATSM,SERP越低,乏氧选择性越好[25]。这可能是由于SERP对常氧细胞的影响更大。化合物SERP较低时,常氧细胞中的内源性还原物质会影响其还原从而使其排出细胞,常氧细胞的摄取下降,乏氧敏感程度增加[26]。
2.6 脂水分配系数 (LogP)如前所述,许多通过修饰靶标、连接基团和改变化合物亲脂性来增加乏氧敏感性的例子。研究考察了11种P值从0.000 2到5的N3S型氨基酸类化合物,P值跨度4个数量级,而在细胞中的摄取区别跨度仅30倍,在常氧、乏氧细胞中,细胞摄取均随着P值增加而增加,但仅有4个化合物表现出乏氧细胞选择性[27]。说明P值仅在一个较小的范围内对乏氧选择性有影响,这可能是由于化合物在细胞外产生了疏水作用力、氢键等作用,也说明亲脂性并不是影响细胞摄取的唯一因素。
2.7 其他良好的药物动力学特征对显像剂十分重要,从血液中快速清除可以降低背景信号,但是过快的血液清除会影响向肿瘤组织的扩散,导致在肿瘤中滞留时间过短,而化合物的氧化还原是需要一定时间反复循环才能完成; 两种甲硝唑衍生物dtcTc1、dtcTc2,只有dtcTc1表现出良好的稳定性及生物学性质,原因在于dtcTc2血浆蛋白结合率高达75%,造成T/B仅0.28、T/M仅1.50[28]; 由于细胞膜的负电荷性,如果显像剂带正电荷则可能会增加细胞摄取[17]; 除了考虑化合物与放射性元素螯合的稳定程度,对化合物本身如咪唑环是否完整也应进行考察,如果在肿瘤组织外被内源性还原物质还原,化合物是否还拥有乏氧选择性也需重点关注。
3 结论随着研究的深入,已经有越来越多的硝基咪唑类乏氧显像剂进入临床阶段,展现出该类显像剂广阔的应用前景。但是,目前研究者对于同种显像剂,常采用乏氧程度不同的肿瘤模型,因此数据常不具备可比性; 在同一研究中,也鲜有较为复杂的化合物构效关系的设计,这无疑给系统性开发先导化合物造成了困扰。尽管如此,依然有较多规律性的内容被发现,并在后续的研究中得到验证。把握这些规律,进行合理的结构设计,开发出更为理想的乏氧显像剂,有十分重要的意义。
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