药学学报  2016, Vol. 51 Issue (7): 1125-1129   PDF    
大鼠血浆中左旋多沙唑嗪SPE-LC-MS/MS的微量检测
都倩, 孔德志, 张盼盼, 任雷鸣     
河北医科大学中西医结合研究所, 河北 石家庄 050017
摘要: 目前多沙唑嗪及其对映体的生物样本最低定量限未超过0.1 ng·mL-1,本研究建立了一种新的大鼠血浆左旋多沙唑嗪微量检测液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法。血浆样本加入内标哌唑嗪后经C18固相萃取小柱萃取,碱性条件下采用Acquity BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱进行分离,在正离子模式下以MRM(多反应离子监测)方式测定左旋多沙唑嗪的含量。结果表明,左旋多沙唑嗪在10.4 pg·mL-1~13 ng·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9922),最低定量限为10.4 pg·mL-1。采用提取后加入法及柱后灌注法评价血浆样本的基质效应,不存在明显的基质效应。并用本法可测定大鼠尾静脉注射左旋多沙唑嗪(3 mg·kg-1)48 h后的血药浓度,结果为0.0344±0.0102 ng·mL-1。此方法特异性强,灵敏度高,适用于左旋多沙唑嗪的血药浓度测定,也为其他药物血药浓度的分析提供了参考。
关键词: 多沙唑嗪     大鼠血浆     固相萃取     LC-MS/MS    
Quantification of (-)doxazosin at very low concentration in rat plasma samples by SPE-LC-MS/MS
DU Qian, KONG De-zhi, ZHANG Pan-pan, REN Lei-ming     
Institute of Chinese Integrative Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
Abstract: Previous publications showed that the value of LLOQ (lowest limit of quantification) for doxazosin and its enantiomers in biological samples were above 0.1 ng·mL-1. The present study was designed to establish a new liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the quantification at very low concentration of (-)doxazosin in rat plasma after intravenous administration of (-)doxazosin (3.0 mg·kg-1). The plasma samples containing prazosin as an internal standard were extracted by solid-phase extraction (SPE) and separated on Acquity BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column under alkaline conditions of the mobile phase. (-)Doxazosin was monitored under positive ionization condition by multiple reaction monitoring (MRM) with an ESI source. The good linear range of (-)doxazosin varied from 10.4 pg·mL-1 to 13 ng·mL-1(r=0.9922), and the lowest limit of quantification was 10.4 pg·mL-1. An assessment of the matrix effect using post-extraction spiking method and post-column infusion method demonstrated that co-eluting matrix components did not significantly influenced the ionization of (-)doxazosin and prazosin (IS). Using the new method, we accurately measured (-)doxazosin concentration at 48 h after intravenous administration in the rats, and the concentration was 0.0344±0.0102 ng·mL-1. The method is specific, sensitive, and suitable for determining (-)doxazosin at very low concentration in rat plasma samples.
Key words: (-)doxazosin     rat plasma     solid-phase extraction     LC-MS/MS    

多沙唑嗪 (doxazosin) 属长效、高选择性α1受体阻断剂,是临床治疗良性前列腺增生一线用药中的推荐药物[1, 2, 3]。在国际高血压治疗推荐方案中,包括多沙唑嗪在内的α1受体阻断剂也是应用广泛的添加药物[4]。多沙唑嗪的分子结构中存在一个手性碳原子,临床应用其消旋体。多沙唑嗪由等量左旋多沙唑嗪和右旋多沙唑嗪组成。在动物实验研究中,两个对映体在药代动力学[5, 6]、药理作用和毒性作用[7, 8]方面有明显的手性差异; 在治疗良性前列腺增生方面,左旋多沙唑嗪可能具有一定的优势。

在人体药代动力学研究中,成人口服多沙唑嗪2 mg后,测定24 h内血药浓度条件下,多沙唑嗪的消除半衰期分别为9 h[9]和10.14 h[10]。当多沙唑嗪血药浓度测定延长至96 h,同剂量药物的消除半衰期延长至22 h[11]。Li等[6]采用高效液相色谱荧光检测法 (HPLC-FLD) 研究了大鼠口服消旋多沙唑嗪后左旋多沙唑嗪与右旋多沙唑嗪在药动学方面的相互作用,发现单独口服两个对映体时,右旋多沙唑嗪的消除半衰期 (2.8 h) 显著长于左旋多沙唑嗪 (2.2 h)[6]。该实验中大鼠口服两个对映体后的有效数据 (可测定浓度) 取血时间分别为18 h (右旋体) 和14 h (左旋体)[6]。鉴于上述人体药代动力学中,多沙唑嗪消除 半衰期与血样采样时间的特殊关系; 作者推测,大鼠体内左旋多沙唑嗪消除半衰期过短可能与采血时间太短有关,如果大幅度提高血药浓度测定的灵敏度,即显著延长给药后的取样时间,左旋多沙唑嗪的消除相时段将更为完整,此时所得到的药动学参数更趋近大鼠的真实水平。本研究采用固相萃取 (solid-&nb sp; phase extraction,SPE) 结合UPLC-MS/MS法测定血浆中多沙唑嗪的含量。该方法具有样品量小、萃取效率高、干扰物质少、特异性强、灵敏度高的特点,最低定量限为10.4 pg·mL-1。用该法可以准确测定大鼠给予左旋多沙唑嗪 (3 mg·kg-1) 48 h后的血药浓度。

材料与方法 仪器与试药

Waters Acquity H-Class超高效 液相色谱仪 (美国Waters公司),Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱仪 (美国Waters公司); 固相萃取小柱Cleanert S C18 (天津博纳艾杰尔科技有限公司); MS104S分析天平和Seven Easy pH仪 (梅特勒-托利多仪器有限公司); G560E涡旋混合器 (美国Scientific Industries公司); Nanopure超纯水仪 (Thermo Fisher Scientific公司)。甲磺酸左旋多沙唑嗪 (光学纯度大于99.9%,华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供); 哌唑嗪 (prazosin,内标,Sigma公司); 甲醇 (色谱纯,Fisher公司); 乙腈 (色谱纯,Fisher公司); 氨水 (色谱纯,北京迈瑞达科技有限公司)。

实验动物

健康雄性SD大鼠,河北省实验动物中心提供。实验期间,饲以河北省实验动物中心提供的固体饲料,自由饮食饮水。

色谱和质谱条件

Acquity BEH C18 (50 mm × 2.1 mm,1.7 μm) 色谱柱,柱温40 ℃,进样体积2 µL。流动相: A为乙腈 (含0.1% 氨水) 溶液,B为0.1% 氨水溶液。梯度洗脱过程: 0~0.5 min,55% A; 0.5~ 2 min,55%~90% A; 2~3 min,90%~55% A; 3~ 4 min,55% A。流速: 0.45 mL·min-1。采用电喷雾离 子源(ESI),正离子方式检测。扫描方式: 多反应监测 (MRM); 雾化气压力为7 bar (1 bar = 100 kPa); 干燥气流速为1 000 L·h-1,干燥气温度为500 ℃; 毛细管电压3 kV。用于定量分析的离子反应分别为m/z 452.2→344.2 (多沙唑嗪),m/z 384.3→247.2 (内标,哌唑嗪),扫描时间均为2 min,驻留时间 (dwell time) 均为33 ms。

储备液的配制

精密称取左旋多沙唑嗪10.4 mg置于50 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成208 µg·mL-1的储备液。

多沙唑嗪标准系列溶液和质控溶液的制备

取上述储备液适量,用水稀释800倍,配制成质量浓度为260 ng·mL-1的左旋多沙唑嗪溶液,再将此溶液逐级稀释成130、65、26、13、5.2、2.6、1.04、0.52和0.104 ng·mL-1的左旋多沙唑嗪系列溶液及104、5.2和0.26 ng·mL-1的左旋多沙唑嗪质控溶液。

内标溶液的配制

精密称取哌唑嗪10.0 mg置 于50 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成200 µg·mL-1的储备液。取上述储备液适量,用水稀释 20 000倍配制成质量浓度为10 ng·mL-1的内标溶液。

大鼠尾静脉注射用左旋多沙唑嗪溶液的配制

精密称取左旋多沙唑嗪60.0 mg置于100 mL量瓶中,加入适量5% 葡萄糖等渗溶液,室温静置4 h后超声溶解并定容,即得0.6 mg·mL-1左旋多沙唑嗪等渗溶液。

血浆样品预处理

将C18萃取小柱进行活化,即依次使用甲醇2 mL、水1 mL处理后,再使用0.1% 氨水1 mL平衡小柱。取血浆样品300 µL,加入内标溶液30 µL,加入水200 µL,涡旋混匀1 min后上样。依次使用5% 甲醇-0.1% 氨水1 mL、0.1% 氨水1 mL淋洗杂质并抽干。最后使用甲醇800 µL进行洗脱,收集洗脱液,55 ℃条件下进行真空浓缩至溶剂完全挥发,残留物用流动相溶液100 µL复溶,涡旋4 min,离心力13 000×g,离心时间5 min,取上清液2 µL,进样。

方法学考察

专属性 取空白血浆、模拟血浆样品、血浆样品各300 µL,按“血浆样品预处理”项下方法处理,取2 µL进样分析,并记录色谱图。

标准曲线与线性范围 分别取左旋多沙唑嗪标准系列溶液30 µL,再分别加入空白血浆270 µL,使血浆中的左旋多沙唑嗪的质量浓度分别13、6.5、2.6、1.3、0.52、0.26、0.104、0.052和0.010 4ng·mL-1,再加入内标溶液30 µL,按“血浆样品预处理”项下进行操作。以左旋多沙唑嗪浓度 (C) 为横坐标,以左旋多沙唑嗪与内标的峰面积比值 (Y) 为纵坐标进行线性回归 (权重W = 1/X 2),所得方程即为标准曲线 (n = 9)。

日内、日间精密度 取大鼠空白血浆配制的质控样品,每个浓度制备5个样本,按“血浆样品预处理”项下操作,进样测定,连续测定3天,根据随行测定的标准曲线计算质控样品的实测浓度,即可求得方法的日内和日间精密度。

样品稳定性 本实验室前期研究表明,左旋多沙唑嗪血浆样品在室温下放置4 h、3次冻融循环、-20 ℃冷冻1个月均稳定,本研究主要考察左旋多沙唑嗪处理过程及流动相复溶后放置24 h的稳定性。

提取回收率和基质效应 取大鼠空白血浆配制的质控样品,再加入内标溶液30 µL,按“血浆样品预处理”项下进行操作,每个浓度测定5个样本。以处理后的色谱峰面积 (A1) 与空白血浆处理后加入标准品溶液复溶后,进样获得的峰面积 (A2) 之比(A1/A2×100%),考察方法的提取回收率。同时,将标准品溶液用流动相稀释至相同浓度,每个浓度进样5份进行分析,得到峰面积A3,以A2/A3×100% 计算方法的基质效应。同时以柱后灌注法,进一步考察乙酸乙酯-正己烷 (1∶1) 萃取、甲醇沉淀蛋白以及固相萃取处理大鼠空白血浆的基质效应。

动物实验 雄性SD大鼠经尾静脉单次注射给药,给药剂量为3 mg·kg-1。于给药后3、6、12、24和 48 h取血,每个时间点6只大鼠。全血置肝素化的离心管中,离心力3 000×g,离心10 min,上清液即为血浆,所得血浆按“血浆样品预处理”项下方法处理。

结果 1 方法学考察 1.1 专属性、标准曲线与线性范围

图 1所示,左旋多沙唑嗪和内标哌唑嗪的保留时间分别为0.47和0.35 min,血浆中内源性物质不干扰多沙唑嗪及内标物的测定。左旋多沙唑嗪的回归方程为Y = 0.749 263 C + 0.004 058 04 (r = 0.992 2),血浆药物浓度在10.4 pg·mL-1~13 ng·mL-1内线性关系良好。本法血浆中左旋多沙唑嗪的检测限为2 pg·mL-1,最低定量限为10.4 pg·mL-1,见图 1B

Figure 1 MRM chromatograms. A: Blank rat plasma; B: Blank rat plasma spiked with (-)doxazosin 10.4 pg·mL-1; C: Rat plasma sample. m/z 452.2→344.2 (doxazosin),m/z 384.3→247.2 (prazosin)
1.2 日内日间精密度与稳定性

结果表明,左旋多沙唑嗪低、中、高3个浓度的血浆样品质控溶液的日内RSD分别为11.21%、9.66% 和8.23%,日间RSD分别为13.02%、10.49% 和9.56%。左旋多沙唑嗪在处理过程及流动相复溶后放置24 h稳定 (RE为 -4.6%~1.5%)。

1.3 提取回收率和基质效应

结果表明,左旋多沙唑嗪低、中、高3个浓度 的血浆样品质控溶液的平均回收率分别为74.63%、90.35% 和135.63%,RSD分别为4.23%、6.72% 和16.71%。左旋多沙唑嗪低、中、高3个浓度的血浆样品质控溶液的平均基质效应分别为94.12%、80.02% 和89.67%,RSD分别为9.41%、3.94% 和4.07%。以柱后灌注法考察了乙酸乙酯-正己烷 (1∶1) 萃取法、甲醇沉淀蛋白法、固相萃取法,处理大鼠空白血浆后的基质效应。结果如图 2所示,固相萃取法处理后的基质基本不影响左旋多沙唑嗪的响应。

Figure 2 MRM chromatograms. A: Mobile phase; B: Blank plasma processed by solid phase extraction column; C: Blank plasma processed by methanol precipitation; D: Blank plasma processed by hexyl hydride-ethyl acetate (1∶1) extraction
2 洗脱溶液甲醇体积的选择

本研究考察了不同体积的甲醇,对13 ng·mL-1浓度左旋多沙唑嗪的各模拟血浆样品的洗脱能力。250 µL甲醇的洗脱效果仅为88.39%,800 µL甲醇的洗脱效果为92.92%,进一步增加甲醇体积时洗脱效果不再增加。最终选择800 µL甲醇对血浆样品进行洗脱。

3 样品含量测定

采用上述方法,测定了大鼠尾静脉注射左旋多沙唑嗪后3、6、12、24和48 h的血药浓度。结果显示,给药48 h时的血药浓度仍可准确测定。左旋多沙唑嗪的半对数药-时曲线见图 3,表明左旋多沙唑嗪在大鼠体内的消除需较长时间。

Figure 3 Semi-logarithmic curve of (-)doxazosin over time after intravenous administration of (-)doxazosin (3.0 mg·kg-1). n = 6,± s
讨论

本研究室曾建立了多沙唑嗪及其对映体的HPLC- FLD检测方法[5, 6, 12],并对大鼠口服多沙唑嗪后的药代动力学进行了研究,发现大鼠血浆中药物的消除半衰期[6]与人体试验结果[11]相差巨大。Kaye等[9]采用质 谱技术分析大鼠血浆中的多沙唑嗪含量,也得到相似的结果。其原因可能与大鼠给药后的采血时间较 短(未超过24 h) 和最低定量限较高 (1 ng·mL-1以上)[6, 9]有关。此外,包括多沙唑嗪的人体药代动力学研究[13, 14, 15, 16]方面,对于多沙唑嗪生物样品的测定,多采用液液萃取、有机溶剂沉淀蛋白、离子液体萃取等样品前处理方法,最低定量限均大于或等于0.1 ng·mL-1

为了大幅度延长大鼠给药后的采血时间,本研究探索了生物样本的固相萃取技术,以期提高大鼠血浆多沙唑嗪测定的灵敏度。在SPE条件的考察中,作者使用20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液、0.1 mol·L-1 Na2CO3溶液及0.1% 氨水改变上样环境的酸碱性,发现碱性条件 (0.1% 氨水) 下左旋多沙唑嗪在小柱上的保留优于酸性条件,与文献[17]报道一致。碱性上样条件不仅使左旋多沙唑嗪的萃取回收率高,亦使淋洗过程中有机相的比例有较宽的选择范围,去除更多的杂质。

质谱扫描参数的确定: 将左旋多沙唑嗪配制成浓度为40 ng·mL-1的乙腈-水 (50∶50) 溶液,蠕动泵进样 (10 μL·min-1),MS一级扫描可见其 [M+H]+ m/z 452.2,手动优化毛细管电压使其 [M+H]+响应最高,采用Masslynx工作站中的IntelliStart进行自动调谐,确定二级碎片离子 (m/z 344.2、m/z 247.1、m/z 221.3,图 4) 的锥孔电压 (CV)、碰撞能量 (CE)。液相条件的优化: 多沙唑嗪pKa值为6.9,在溶液pH大于8.9时,多沙唑嗪绝大多数以分子形式存在,在溶液pH小于4.9时,以离子的形式存在,而已有测定多沙唑嗪的方法[13, 14, 15]均在酸性条件下 (pH ≤ 4.28) 测定。本实验考察了0.1% 甲酸(pH 2.6)、5mmol·L-1乙酸铵 (pH 4.5) 以及0.1% 氨水 (pH 9.7) 作为流动相对左旋多沙唑嗪测定的影响,调节有机相的比例使物质分离良好,发现左旋多沙唑嗪0.1% 氨水条件下峰形良好、所监测的MRM离子对m/z 452.2 → 344.2响应最高。可能是碱性条件下,多沙唑嗪的容量因子 (k) 增加,此时采用较高比例的有机相洗脱,从而增加了检测物的质谱响应。这一现象与正离子模式下采用酸性条件质谱响应较高的理论并不矛盾。

Figure 4 Product ion spectra of [M+H]+ of (-)doxazosin

综上,本文建立的方法特异性强、灵敏度高、操作简单、不受内源性物质干扰,最低定量浓度可达10.4 pg·mL-1。采用该方法可以准确测定大鼠尾静脉注射左旋多沙唑嗪 (3 mg·kg-1) 48 h后的血药浓度,适用于多沙唑嗪的血药浓度测定和药代动力学研究,也可参考用于其他药物的血药浓度监测。

参考文献
[1] McVary KT, Roehrborn CG, Avins AL, et al. Update on AUA guideline on the management of benign prostatic hyperplasia[J]. J Urol, 2011, 185:1793-1803.
[2] Oelke M, Bachmann A, Descazeaud A, et al. Guidelines on the treatment of non-neurogenic male LUTS[M/OL]. 2011. http://www.uroweb.org/gls/pdf/12_Male_LUTS.pdf
[3] Yoshimura K, Kadoyama K, Sakaeda T, et al. A Survey of the FAERS database concerning the adverse event profiles of α1-adrenoreceptor blockers for lower urinary tract symptoms[J]. Int J Med Sci, 2013, 10:864-969.
[4] Sever PS, Messerli FH. Hypertension management 2011:optimal combination therapy[J]. Eur Heart J, 2011, 32:2499-2506.
[5] Kong D, Li Q, Zhang P, et al. The truth about the lower plasma concentration of the (-)-isomer after racemic doxazosin administration in rats:stereoselective inhibition of the (-)-isomer by the (+)-isomer at CYP3A[J]. Eur J Pharm Sci, 2015, 77:238-245.
[6] Li Q, Kong D, Du Q, et al. Enantioselective pharmacokinetics of doxazosin and pharmacokinetic interaction between the isomers in rats[J]. Chirality, 2015, 27:738-744.
[7] Zhao D, Duan LH, Wang FY, et al. Chiral recognition of doxazosin enantiomers in 3 targets for therapy as well as adverse drug reactions in animal experiments[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2012, 90:1623-1633.
[8] Zhao J, Kong DZ, Li Q, et al. (-)Doxazosin is necessary component for the hypotensive effect of (±)doxazosin during long-term administration in conscious rats[J] Acta Pharmacol Sin, 2014, 35:48-57.
[9] Kaye B, Cussans NJ, Faulkner JK, et al. The metabolism and kinetics of doxazosin in man, mouse, rat and dog[J]. Br J Clin Pharmacol, 1986, 21:19S-25S.
[10] Ebihara A, Tsuru M, Ohashi K, et al. Pharmacokinetic and pharmacological properties of doxazosin mesilate in Japanese healthy adult volunteers[J]. Jpn J Clin Pharmacol Ther, 1988, 19:445-452.
[11] Penenberg D, Chung M, Walmsley P, et al. The effects of hepatic impairment on the pharmacokinetics of doxazosin[J]. J Clin Pharmacol, 2000, 40:67-73.
[12] Zhen YQ, Kong DZ, Li Q, et al. Determination of doxazosin enantiomers in rat plasma and investigation of their chiral inversion[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48:901-905.
[13] Chytil L, Strauch B, Cvacka J, et al. Determination of doxazosin and verapamil in human serum by fast LC-MS/MS:application to document non-compliance of patients[J]. J Chromatogr B, 2010, 878:3167-3173.
[14] Liu K, Zhong DF, Chen XY. Enantioselective determination of doxazosin in human plasma by liquid chromatographytandem mass spectrometry using ovomucoid chiral stationary phase[J]. J Chromatogr B, 2010, 878:2415-2420.
[15] Ma N, Liu WY, Li HD, et al. LC-MS determination and relative bioavailability of doxazosin mesylate tablets in healthy Chinese male volunteers[J]. J Pharm Biomed Anal, 2007, 43:1049-1056.
[16] Chen CP, Chen HX, Chang YF, et al. Determination of doxazosin mesylate by ionic liquids extraction-fluorescence spectrophotometry[J]. J Anal Sci (分析科学学报), 2014, 30:381-384.
[17] Chen ZQ, Yu Y, Li LJ. Determination of doxazosin in plasma by revesre-phase high performance liquid chromatography[J]. J Southwest China Norm Univ (西南师范大学学报·自然科学版), 2005, 30:1066-1069.