最新肿瘤流行病学统计数据显示,乳腺癌发病率已跃居全球女性肿瘤第一,占女性肿瘤的29%,致死率已跃居第二,占15%[1]。虽然目前在乳腺癌的治疗方法上有了新的进展,但在美国女性中乳腺癌的死亡率在众多癌症中依然高居第二位[2]。因此寻找有效的抗乳腺癌药物依然为当前研究的热点。
天然产物是新药研发的重要来源。三七 [Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen] 为五加科植物,干燥根入药,又称田七、岑三七等,是我国传统中药材,主产于云南和广西等地。三七具有促凝血和抗血栓的 双向调节作用[3, 4],自古用于创伤止血,被明代著名药学家李时珍誉为“金不换”,在心脑血管疾病中疗效显著。皂苷是三七的主要活性成分,目前已分离到的皂苷成分有70多种。大部分皂苷成分均从三七根中分离得到,而三七皂苷Ft1首次从三七叶中分离得到[5],后续的研究结果显示,Ft1可促进创伤愈合[6],并经由二磷酸腺苷受体 (adenosine phosphate receptor) P2Y12介导促进血小板的聚集[7],但对于其抗肿瘤活性报道甚少。本课题组以往研究发现Ft1能够显著抑制神经母细胞瘤细胞的生长,并促进细胞凋亡[8],但其是否对其他肿瘤细胞也有抑制作用目前尚不清楚。本文旨在研究Ft1对乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的作用,并探讨其分子机制,以期为其潜在的临床应用于乳腺癌治疗提供理论依据。
材料与方法 细胞株人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞由上海中医药大学中药学院沈凯凯馈赠,人BT549细胞、HS578T细胞和MCF-7细胞由美国肯塔基大学徐韧教授馈赠。
主要试剂三七皂苷Ft1由上海中医药大学中药研究所分离获得,经HPLC和质谱鉴定确定纯度 ( > 98%) 和结构。DMEM/High Glucose培养基、RPMI 1640培养基、0.25% 胰酶和胎牛血清 (FBS) 购买于Gibco公司。DMEM/F12 Mixture 培养液、二甲基亚砜 (DMSO) 购于Sigma公司,CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 购于同仁化学公司。本研究所用抗体均购于CST公司。
仪器电子天平购自Sartorius (BP211D),振荡仪购自Qilinbeier (VORTEX-5),台式高速离心机 (Centrifuge 5810R) 和高速离心机 (5415R) 均购自Eppendorf公司,荧光显微镜 (CKX41) 购自Olympus公司,酶标仪 (Varioskan Flash)、CO2培养箱 (HERA cell 150i) 和超净工作台 (1300 SERIES A2) 均购自Thermo公司,细胞计数仪 (Moxiz) 购自Orflo公司,电热恒温水浴锅购自北京市长风仪器仪表公司。
细胞培养和给药MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞和HS-578T细胞于含10% 胎牛血清、100 u∙mL−1青霉素和0.1 mg∙mL−1链霉素的DMEM培养液中,BT-549细胞于含10% 胎牛血清、100 u∙mL−1青霉素和0.1 mg∙mL−1链霉素的RPMI 1640培养液中,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养。实验时,接种细胞数为每毫升1.0×105个,96、24和6孔板分别接种100 μL、400 μL和2 mL,使其贴壁过夜,给予不同 浓度Ft1作用于细胞,每个浓度3个复孔,药物孵育48 h后进行各项检查。
细胞增殖活力检测弃原培养液并加入100 μL新鲜培养基后,加入CCK-8 10 μL,继续孵育1 h,用Thermo Fisher Varioskan Flash酶标仪检测450 nm处吸光度 (A),细胞存活率 = (A给药组/A对照组) × 100% 计算,实验重复3次。
EdU染色法检测细胞增殖从4 ℃取出液态的matrigel胶,取24孔培养板每孔加入matrigel原液120 μL,在孔底部涂抹均匀,避免气泡产生,于37 ℃培养箱中孵育30 min。用0.25% 胰酶消化细胞至单 细胞悬液,调整细胞数至每毫升1.6×104个,悬液为含2% 血清的DMEM/F12 Mixture培养液,在每孔内接种细胞悬液250 μL,于37 ℃培养箱中孵育1 h,将药物稀释在上层胶 (DMEM/F12 Mixture + 2% FBS + 10% matrigel) 中配成不同浓度加入到每孔中。48 h后收集细胞 (收集细胞前18 h加入EdU染料),吸去培养基,用200 μL枪头将matrigel捣碎并均匀地涂 抹在载玻片上,待晾干后,加入4% 多聚甲醛 (paraformaldehyde,PFA) 室温固定30 min,3% BSA洗2遍。加入0.5% Triton X-100,室温孵育25 min,3% BSA洗2遍。加入Cu+ 和叠氮化合物混合的反应溶液,室温、避光30 min,用3% BSA和PBS各洗1遍,加入DAPI,室温避光5 min。PBS清洗,加一滴防淬灭液,最后封片,荧光显微镜下观察。
Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡弃去培养基,4% PFA固定10 min,PBS洗2遍,加入10 μg∙mL−1 Hoechst 33258染色液,染色15 min,PBS洗2遍,荧光显微镜下观察。
Western blot收集细胞,加细胞裂解液150 μL,超声粉碎离心,取上清,每孔分别取20 μg样品蛋白上样,10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,然后4 ℃、100 V湿转120 min,5% BSA室温封闭2 h。分别用一抗 (1∶1 000) 4 ℃孵育过夜,HRP标记二抗 (1∶5 000) 室温孵育2 h,采用ECL显色液显色。
单细胞迁移实验收集细胞前一天先用0.1 g∙L−1多聚赖氨酸包被玻璃培养皿 (培养皿中间分为4个区域),室温放置2 h,用无菌水洗2遍,置于超净台中干燥备用。用0.25% 胰酶消化各组细胞至单细 胞悬液,计数调整细胞数为每毫升2.0×104个细胞,每个1/4区域内加悬液500 μL,置于37 ℃培养箱内 继续培养3 h以上,待细胞贴壁后,将玻璃培养皿置于Nikon Biostation IM仪器中,实时监测细胞8 h。
统计学分析所有数据均以± s表示,采用Graphpad Prism 5软件进行统计分析,多组间比较用One-way ANOVA Dunnett检验,P < 0.05表示差异有统计学意义。
结果 1 Ft1对MDA-MB-231及MCF-7细胞活力的影响
如图 1所示,Ft1能显著抑制MDA-MB-231细胞 (P < 0.05,P < 0.001) 和MCF-7细胞的细胞活力 (P < 0.001)。MDA-MB-231细胞是三阴性乳腺癌,而MCF-7细胞 [雌激素受体 (ER)+,雄激素受体 (PR)+,人类表皮生长因子受体 (HER)−] 是雌激素受体阳性细胞,临床恶性程度和转移能力较MDA-MB-231细胞弱,因此在后续机制研究中,主要以MDA-MB- 231细胞为主。
如图 2所示,采用3D培养技术培养乳腺癌细胞BT-549和MCF-7细胞,EdU染色结果显示,Ft1可明显抑制3D培养下乳腺癌细胞的增殖。
在荧光显微镜下,正常活细胞呈弥散均匀荧光,出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。如图 3A~C所示,control组细胞 呈弥散均匀荧光,而Ft1 (40和80 μmol∙L−1) 作用MDA-MB-231细胞48 h后,均能诱导细胞出现浓染致密的颗粒块状高亮蓝色荧光。进一步Western blot检测结果 (图 3D) 显示,与control组细胞相比,Ft1能显著上调cleaved caspase 3的蛋白表达,下调缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α) 和Bcl-2蛋白的表达,提示Ft1能够诱导MDA-MB-231细胞的凋亡。
如图 4所示,时效实验结果表明,Ft1作用6 h以上能显著降低p-mTOR、p-Akt和p-p70S6K的蛋白表达。与此同时,如图 5所示,Ft1作用6 h后,即能显著抑制p-ERK1/2和p-JNK的蛋白表达,而作用24 h后,却能够显著上调p-JNK的蛋白表达。
Ft1 (80 μmol∙L−1) 干预12 h后进行Western blot检测,结果如图 6显示,Ft1能够显著抑制Akt/mTOR/ p70S6K的蛋白磷酸化 (P < 0.05,P < 0.01,P < 0.001),同时能够抑制ERK1/2蛋白的磷酸化 (P < 0.05),而上调JNK的蛋白磷酸化 (P < 0.001),下调HIF-1α蛋白水平 (P < 0.01)。Ft1也有抑制p-p85 PI3K蛋白表达的趋势,但无统计学意义。
进一步就Ft1对Akt/mTOR和MAPK通路的上游通路EGFR蛋白磷酸化是否有抑制作用进行了考察。结果如图 7显示,80 μmol∙L−1 Ft1干预12 h均能显著抑制p-EGFR (Tyr1068) 和p-EGFR (Ser1046/1047)的蛋白表达 (P < 0.05)。
如图 8所示,单细胞迁移实验结果显示,Ft1干预48 h,能够显著抑制HS578T单细胞迁移路径的长度 (P < 0.01) 和速度 (P < 0.01),也有抑制HS578T细胞单细胞终点与起点的直线距离的趋势,但无统计学差异。
三七主要功用化瘀止血,消肿止痛。有关三七在心脑血管疾病和抗炎方面的研究比较多 [9, 10, 11]。近年来发现三七具有多种抗肿瘤活性。三七总皂苷能够抑制肝癌细胞SMMC-7721和CBRH791的生长并且能诱导SMMC-7721细胞的凋亡,作用呈时间和剂量依赖性[12, 13]。三七皂苷Rg1对S-180和H-22瘤细胞移植性肿瘤均有明显的抑瘤作用[14]。三七皂苷R1可以浓度依赖性地抑制HL-60细胞增殖及促进HL-60细胞凋亡[15]。Ft1最先是从三七叶中分离得到,本课题组前期研究发现Ft1可显著抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖并促进其细胞凋亡[8],但是Ft1对乳腺癌是否也有抑制作用,尚未见文献报道。本研究发现,Ft1可明显降低乳腺癌细胞的生存率并抑制其增殖,同时也可诱导凋亡。乳腺癌往往具有早期转移的特性,本研究同时也考察了Ft1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。单细胞迁移实验结果显示,Ft1能够显著抑制乳腺癌细胞的迁移能力,提示其对乳腺癌的转移也有潜在的抑制作用。
据报道,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路过 度激活贯穿肿瘤整个病理发展进程,在肿瘤细胞生存、增殖、凋亡和迁移中均发挥着广泛的病理生理作用[16]。因此,本研究在确定了Ft1抑制乳腺癌细胞活力和增殖并促进凋亡作用后,首先考察了其对PI3K/ Akt/mTOR/p70S6K信号通路的影响。研究表明,Ft1确实能够显著抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路的过度激活。
PI3K和P70S6K的靶蛋白在细胞生存和增殖方面扮演着重要的角色[17]。HIF-1α为其靶蛋白之一,它通过调控其下游基因如骨髓细胞瘤细胞原癌基因 (cellular-myelocytomatosis,c-MYC)、胰岛素样生长因子-2 (insulin-like growth factor 2,IGF-2)、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1 (pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1,PDK1) 和乳酸脱氢酶A (lactate dehydrogenase A,LDHA) 等,参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移等。HIF-1α的激活受与细胞骨架蛋白tensin同源的在肿瘤的10号染色体有缺失的磷脂酶 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN) 调控,后者负反馈调控PI3K/Akt,而PI3K/Akt又参与调控HIF-1α的合成并介导VEGF的生成[18, 19]。因此PI3K/Akt/mTOR信号通路可以直接或间接参与调控HIF-1α的合成和激活,从而调控肿瘤细胞的活力、增殖、凋亡和迁移。另有研究也证明,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K和MAPK信号通路均参与调控HIF-1α的表达,从而调控肿瘤细胞的生长[20]。EGFR是PI3K/Akt/mTOR/p70S6K和MAPK信号通路的上游信号分子。EGFR通路可以通过促进HIF-1的表达和活性,促进肿瘤发展进程[21]。因此本研究同时也考察了Ft1对EGFR磷酸化的抑制作用,结果显示,Ft1能显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞p-EGFR (Tyr1068) 和p-EGFR (Ser1046/1047) 的蛋白表达。因此,本研究结果提示,Ft1可能通过抑制EGFR的激活,进而抑制Akt/mTOR/p70S6K和MAPK (ERK1/2) 通路的激活,下调HIF-1α的蛋白表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖并促进其凋亡。
Bcl-2是凋亡通路的关键调节分子,在多种肿瘤细胞中均高表达,并通过抑制Bax转位入线粒体,从而下调cleaved caspase 3的表达,抑制肿瘤细胞的凋亡。Akt通过调控凋亡相关蛋白如Bcl-2,Bax和cleaved caspase 3等,参与抑制肿瘤细胞的凋亡[16]。此外,MAPK信号通路 (包括ERK、SAPK/JNK和p38 MAPK),积极参与了药物诱导的肿瘤细胞凋亡作用[22]。同时,MAPK通路也参与调控caspase 3活性和Bcl-2的蛋白表达,从而调控肿瘤细胞的凋亡[8]。本研究结果显示,Ft1可上调cleaved caspase 3,下调Bcl-2,同时Ft1能够显著抑制MDA-MB-231细胞ERK1/2的磷酸 化,进一步提示Ft1可能通过调控Akt/mTOR/p70S6K和MAPK通路从而促进细胞的凋亡。尽管如此,Akt/mTOR/p70S6K和MAPK通路、HIF-1α、Bcl-2和cleaved caspase 3蛋白在介导Ft1抑制乳腺癌作用中的相互关系尚需要进一步深入研究。
综上所述,Ft1可能通过抑制EGFR的激活,从 而对AKT/mTOR/p70S6K和MAPK (ERK1/2) 两条信号通路的双重抑制,下调HIF-1α蛋白表达,从而抑制Bcl-2的蛋白表达,促进cleaved caspase 3的蛋白表达,最终抑制乳腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡,并在抑制肿瘤生长的同时抑制肿瘤的转移,提示Ft1在抗乳腺癌化疗潜在候选药物中的有效性,值得进一步深入研究。
[1] | Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65:5-29. |
[2] | Kurebayashi J. Endocrine-resistant breast cancer:underlying mechanisms and strategies for overcoming resistance[J]. Breast Cancer, 2003, 10:112-119. |
[3] | Zhang HY, Sheng SD, Xue J. Hemostatic and anti-thrombosis effects study of Radix Panax Notoginseng[J]. J Xinjiang Med Univ (新疆医科大学学报), 2012, 35:487-490. |
[4] | Ma LY, Xiao PG. Effects of Panax notoginseng saponins on platelet aggregation in rats with middle cerebral artery occlusion or in vitro and on lipid fluidity of platelet membrane[J]. Phytother Res, 1998, 12:138-140. |
[5] | Chen JT, Li HZ, Wang D, et al. New dammarane monodesmosides from the acidic deglycosylation of notoginseng-leaf saponins[J]. Helv Chim Acta, 2006, 89:1442-1448. |
[6] | Shen K, Ji L, Gong C, et al. Notoginsenoside Ft1 promotes angiogenesis via HIF-1α mediated VEGF secretion and the regulation of PI3K/AKT and Raf/MEK/ERK signaling pathways[J]. Biochem Pharmacol, 2012, 84:784-792. |
[7] | Gao B, Huang L, Liu H, et al. Platelet P2Y12 receptors are involved in the haemostatic effect of notoginsenoside Ft1, a saponin isolated from Panax notoginseng[J]. Br J Pharmacol, 2014, 171:214-223. |
[8] | Gao B, Shi HL, Li X, et al. p38 MAPK and ERK1/2 pathways are involved in the pro-apoptotic effect of notoginsenoside Ft1 on human neuroblastoma SH-SY5Y cells[J]. Life Sci, 2014, 108:63-70. |
[9] | Wang YL, Chen D, Wu JL. Effects and mechanism of total saponins of Panax notoginseng on anti-inflammation and analgesia[J]. Chin J Integr Tradit Chin West Med (中国中西医结合杂志), 1994, 14:35-36. |
[10] | Li SH, Chu Y. Experiment research on the anti-inflammatory effect of saponins of Panax notoginseng[J]. Sichuan J Physiol Sci (四川生理科学杂志), 1999, 21:22. |
[11] | Chen JH, Wang BJ, Liu SQ, et al. Effect of total saponins of Panax notoginseng on adhensive characters of vascular endothelial cell induced by endotoxin[J]. Chin J Hosp Pharm (中国医院药学杂志), 2004, 24:140-141. |
[12] | Shang XL, Fu HQ, Liu J, et al. Inhibitory effects on human hepatocarcinoma cells with Panax notoginseng saponins[J]. Chin J Clin Rehabil (中国临床康复), 2006, 10:121-123. |
[13] | Wu YY, Tan YH, Zhong FY, et al. Inhibitory effects of Panax notogengsing saponins, matrine and danshen injection on rat hepatocarcinoma cell CBRH7919 in vitro[J]. Liaoning J Tradit Chin Med (辽宁中医杂志), 2005, 32:1010-1012. |
[14] | Huang QS, Li HZ, Zhang YL, et al. Anti-mutations and anti-tumor effect of Panax notoginseng saponins Rg1[J]. J Clin Exp Med (临床和实验医学杂志), 2006, 5:1124-1125. |
[15] | Wang GJ, Zhou LM, Wang L, et al. Study on apoptosis of human leukemia HL-60 cells induced by sanchinoside R1[J]. Sichuan J Physiol Sci (四川生理科学杂志), 2004, 26:14-16. |
[16] | Jung KH, Choi MJ, Hong S, et al. HS-116, a novel phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor induces apoptosis and suppresses angiogenesis of hepatocellular carcinoma through inhibition of the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Cancer Lett, 2012, 316:187-195. |
[17] | Harada H, Andersen JS, Mann M, et al. p70S6 kinase signals cell survival as well as growth, inactivating the pro-apoptotic molecule BAD[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98:9666-9670. |
[18] | Jiang BH, Liu LZ. PI3K/PTEN signaling in angiogenesis and tumorigenesis[J]. Adv Cancer Res, 2009, 102:19-65. |
[19] | Liang D, Yang M, Guo B, et al. HIF-1α induced by β-elemene protects human osteosarcoma cells from undergoing apoptosis[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012, 138:1865-1877. |
[20] | Befani CD, Vlachostergios PJ, Hatzidaki E, et al. Bortezomib represses HIF-1α protein expression and nuclear accumulation by inhibiting both PI3K/Akt/TOR and MAPK pathways in prostate cancer cells[J]. J Mol Med, 2012, 90:45-54. |
[21] | Swinson DE, O'Byrne KJ. Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer[J]. Clin Lung Cancer, 2006, 7:250-256. |
[22] | Uehara N, Kanematsu S, Miki H, et al. Requirement of p38 MAPK for a cell-death pathway triggered by vorinostat in MDA-MB-231 human breast cancer cells[J]. Cancer Lett, 2012, 315:112-121. |