亚硝酸盐长期以来被认为是一种毒性物质,近年来发现其具有一定的生理活性和药用价值,将其开发为治疗心血管病、代谢综合征和衰老的药物是最近研究的热点^[1]。体外补充少量的亚硝酸盐能减少器官缺血再灌注损伤,降低肺动脉高压,预防动脉粥样硬化^[2]。有人认为少量亚硝酸盐对非癌症人群心血管病预防和治疗或许是安全有效的^[3]。但是应用于合并癌症的患者,就不得不考虑在癌症微环境中亚硝酸盐对癌细胞生物学的影响。与正常组织不同,癌细胞生存的微环境一个显著的特点是含有较高浓度的氨。这是因为恶性肿瘤细胞依靠线粒体氧化磷酸化获取能量障碍,转而利用谷氨酸盐分解来弥补。一个谷氨酸盐分子分解代谢会产生两个氨分子,从而使肿瘤组织内部含有较高浓度的氨^[4]; 肿瘤微环境另一个特点是缺氧且呈酸性,亚硝酸盐在缺氧酸性环境下还原为一氧化氮,外源性给予亚硝酸盐,会显著提高肿瘤组织内部一氧化氮的水平^[5]。有学者根据肿瘤组织代谢亚硝酸盐的特点,提出在给予化疗药物之前,先用亚硝酸盐提高肿瘤内部一氧化氮水平,增加血管通透性,从而达到化疗药物大量进入肿瘤内部的目的^[6]。

有文献^[7]报道,氨和一氧化氮作为癌细胞的代谢产物有促进肿瘤细胞生长的作用。本课题组前期研 究也发现,外源性补充亚硝酸盐有促进肝癌细胞增殖和侵袭作用^[8]。肿瘤组织内部不但有高浓度的氨,而且亚硝酸盐含量也高于周围正常组织^[9]。因此,在开发亚硝酸盐作为药物应用于临床之前,首先要明确亚硝酸盐在肿瘤组织高氨环境下对肿瘤细胞生物学行为的影响。肝癌是一种常见的恶性肿瘤,侵袭能力强、死亡率高。肝癌细胞谷氨酰胺分解会产生大 量氨^[10],课题组前期发现,外源性给予亚硝酸盐会导致肝癌组织内部亚硝酸盐蓄积,促进癌细胞肺转移^[11]。为此,本实验用氯化铵代表铵盐,用亚硝酸钠代表亚硝酸盐,观察它们联合暴露对肝癌细胞增殖和运动侵袭能力的影响。

材料和主要仪器

人肝癌SMMC-7721细胞株 购自中国医学科学院基础医学研究所。生长在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置5% CO₂、37 ℃培 养箱培养。亚硝酸钠 (sodium nitrite,SN) 和氯化铵 (ammonium chloride,AC) 购自天津市晨福化学试 剂厂 (分析纯); 胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青 生物公司; 二甲基亚砜 (DMSO)、噻唑兰 [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dephenyl tetrazolium bromide,MTT]、DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)、二氟甲基鸟氨酸 (difluoromethylor­nithine,DFMO) 和N-乙酰半胱氨酸 (N-acetycysteine,NAC) 购自Sigma公 司; Matrigel胶包被的transwell和FITC标记的山羊 抗兔二抗购自BD公司; 活性氧检测试剂盒 (reactive oxygen species assay kit)、兔抗人MMP-2、兔抗人MMP-9、兔抗人ODC1、鼠抗鸡囊 (C4) β-actin单抗和ECL Western blot化学发光检测试剂盒均购自Santa Cruz公司。细胞形态观察用DM2500徕卡荧光显微镜 (德国); 蛋白质定量用UV-540紫外−可见分光光度计 (美国UNICAM公司)。DYY-7C型电泳仪和WD-9413B凝胶成像分析仪 (北京市六一仪器厂)。

SMMC-7721细胞于5% CO₂、37 ℃恒温培养,至对数生长期,用胰酶和EDTA消化,调整细胞数为每毫升1×10⁴个 (每孔0.2 mL),接种到96孔细胞培养板,继续培养24 h后换液。分别 用不同浓度的亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物处理细胞24 h,每孔加入5 g·L⁻¹ MTT 20 μL培养4 h,然后吸去培养液,每孔加入DMSO 150 μL于振荡器上振摇,待紫色晶体完全溶解后,在酶标仪上测定570 nm处的吸光度值 (A)。以含有等体积的培养液和DMSO的无细胞孔测得A为空白对照。

实验分4组: 对照组加等体积的培养液; 亚硝酸钠 (sodium nitrite,SN) 组用150 μmol·L⁻¹亚硝酸钠孵育; 氯化铵 (ammonium chloride,AC) 组用150 μmol·L⁻¹氯化铵处理; 亚硝 酸钠和氯化铵混合物 (SN+AC) 组用150 μmol·L⁻¹亚硝酸钠和氯化铵 (1∶1) 处理。根据不同的实验目的加或不加NAC (5 mmol·L⁻¹) 或DFMO (5 mmol·L⁻¹)。当细胞生长到对数生长期,各组细胞培养24 h,消化收获细胞,用无血清DMEM培养基洗3次,各组分别接种1.0×10⁵个细胞于已行matrigel包被的transwell小室中,滤膜微孔直径为8 μm,小室内的培养基为无血清的DMEM,各组加入相应剂量的亚硝酸钠或氯化铵,体积200 μL,然后于小室外即24孔板的孔内加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基800 μL,以提供细胞侵袭运动的趋化因子。每组3个复孔,培养24 h后自24孔板中取出transwell小室,PBS轻轻冲洗3次,用自备小棉签小心擦净小室底部微孔滤膜上层的细胞,然后将小室置于甲醇固定液中放置10 min,取出小室放于结晶紫中染色5 min; 沿小室底部边缘剪下滤膜,显微镜下观察穿过matrigel及微孔至滤膜反面的细胞,实验重复3次,于200倍光学显微镜下计数5个视野的细胞,取平均值。

细胞分组处理同上,实验结束时取出盖玻片,按试剂盒说明书用示踪剂DCFH-DA处理,使用488 nm激发波长、525 nm发射波长,在DM2500徕卡荧光显微镜下拍照。用image-pro plus图像分析软件分析荧光强度。

实验分组同上,各组以1×10⁴个细胞接种于6孔板中,板内预置经多聚赖氨酸预处理的盖玻片。各组细胞培养24 h后,取 出盖玻片,冷丙酮固定6 min,自然干燥。3% H₂O₂室温孵育15 min,10% BSA 4 ℃封闭过夜,PBS冲洗 3次,每张盖玻片加兔抗人ODC1工作液100 µL,4 ℃过夜孵育,PBS洗3次,加FITC标记的山羊抗兔IgG二抗,DAPI复染,37 ℃孵育30 min,PBS洗3次,自 来水冲洗,自然干燥,硅油封片,实验重复3次,徕卡DM2500荧光显微镜下拍照。

消化收获各种处理的细胞,用RIPA 200 μL充分裂解提取蛋白,考马斯亮蓝G-250法测样品蛋白浓度,均衡每组蛋白浓 度后,以12% SDS-PAGE凝胶电泳分离。电转移蛋 白至NC膜,5%脱脂奶粉封闭过夜,加入各种一抗 (1∶200) 于4 ℃封闭袋中孵育过夜,二抗孵育1 h。化学发光法显示结果,压片曝光。凝胶图像分析系统拍照,采用IPP软件对目的条带进行灰度分析。实验重复3次。

数据均采用均数 ± 标准差 (± s) 表示,应用SPSS13.0软件包处理,正态分析和方差齐性检验后,进行单因素方差分析处理组与对照组的差别,各处理组之间两两比较采用行×列表的卡方检验。P < 0.05被认为统计学具有显著性差异。

不同浓度的亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯 化铵混合物孵育人肝癌SMMC-7721细胞24 h,加 入MTT,酶标仪检测A值表示细胞活力。结果显示,亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物在 1 200 μmol·L⁻¹浓度以下,对细胞活力都有非浓度依赖性的促进作用; 各组化合物在150 μmol·L⁻¹时,细胞活力达到最大,A值超过对照组的30% 以上,其 中亚硝酸钠和氯化铵混合物促进细胞活力效应最显著。亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物 在2 400 μmol·L⁻¹浓度以上,对细胞活力都有抑制作用。结果显示,亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物对人肝癌SMMC-7721细胞活力具有双向 剂量效应关系,亚硝酸钠 (150 μmol·L⁻¹) 和氯化铵 (150 μmol·L⁻¹) 联合暴露能显著促进细胞活力 (图 1)。

Figure 1

Figure 1 The dose response relationship of isolated and combined exposure to sodium nitrite (SN) and ammonia chloride (AC) on cell viability of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. SMMC-7721 cells treated with a serial dose of SN,AC,SN and AC mixture for 24 h,the viability of cells was reflected by the MTT absorbance. n = 3,± s

肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶 (MMP) 可以溶解基底膜,有助于细胞侵袭转移。用matrigel包被的transwell小室,模拟基底膜可以用于检测肿瘤细胞的侵袭能力。图 2A结果显示,亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物处理的细胞穿过小室底部微孔滤膜背面每视野的细胞数均高于对照组,其中亚硝酸钠和氯化铵混合物处理组穿膜细胞数高于单独亚硝酸钠或氯化铵处理组 (图 2B)。图 2D Western blot条带灰度扫描结果显示,亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物处理的细胞MMP-2蛋白表达量均高于对照组,且单纯氯化铵组高于亚硝酸钠组,亚硝酸钠和氯化铵混合物组高于单独应用氯化铵或亚硝酸钠处理组。MMP-9蛋白表达在对照组和单独亚硝酸钠或氯化铵处理组之间无明显差异,亚硝酸钠和氯化铵混合物组明显高于其他3组。结果提示,亚硝酸钠和氯化铵联合暴露,可显著增加肝癌细胞侵袭能力。

Figure 2

Figure 2 Effect of isolated and combined exposure to SN and AC on the ability of invasion in SMMC-7721 cells. A: Cell invasion tested by transwell chamber in SMMC-7721 cells exposure to vehicle (control),SN (150 μmol·L−1),AC (150 μmol·L−1),SN+AC (150 μmol·L−1); B: The quantified results of A; C: The expression of MMP-2 and MMP-9 detected by Western blot; D: The histogram showed the protein relative optical density. n = 3,± s. P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs SN group

150 μmol·L⁻¹亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物作用人肝癌SMMC-7721细胞24 h,荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS荧光强度可以反映细胞内ROS水平。结果如图 3所示,亚硝酸钠和氯化铵混合物组比对照组和单用亚硝酸钠或氯化铵组细胞内ROS荧光强度都明显增强,用ROS清除剂NAC处理后,上述现象被逆转。结果提示,亚硝酸钠和氯化 铵联合暴露,可显著增加肝癌细胞内ROS水平。

Figure 3

Figure 3 Effect of combined exposure to SN and AC on the ROS levels of SMMC-7721 cells. SMMC-7721 cells treated with 150 μmol·L−1 SN,AC,or SN+AC for 24 h,added ROS scavenger N-acetycysteine (NAC) or not,the ROS levels were detected by fluorescence microscope

Transwell侵袭实验结果 (图 4A) 显示,亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物处理的细胞穿过小室底部微孔滤膜背面每视野的细胞数均高于对照组。加入ROS清除剂NAC后,各组穿膜细胞数均相应减少 (图 4B)。Western blot结果显示,亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物处理的细胞MMP-2蛋白表达量均高于对照组,亚硝酸钠和氯化铵混合物组高于单独应用氯化铵或亚硝酸钠处理组 (图 4C )。加入ROS清除剂NAC后,各组MMP-2蛋白表达量均相应减少。亚硝酸钠和氯化铵混合物组MMP-9蛋白表达明显高于其他3组,加入ROS清除剂NAC后,MMP-9蛋白表达量均明显减少。结果表明,亚硝酸钠和氯化铵联合暴露,通过增强细胞内ROS水平,进而促进肝癌细胞侵袭能力。

Figure 4

Figure 4 SN and AC mixture promoted cell invasion via enhancing ROS pathway. A: Cell invasion tested by transwell chamber in SMMC-7721 cells treated with vehicle (control),SN (150 μmol·L−1),AC (150 μmol·L−1),SN+AC (150 μmol·L−1) or ROS scavenger NAC (5 mmol·L−1); B: The quantified results of A; C: The expression of MMP-2 and MMP-9 detected by Western blot. n = 3,± s. P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs SN group; △P < 0.05 vs same group free NAC

150 μmol·L⁻¹亚硝酸钠、氯化铵、亚硝酸钠和氯化铵混合物作用人肝癌SMMC-7721细胞24 h,ODC1免疫荧光检测细胞内ODC荧光颗粒可以反映细胞内ODC分布。结果如图 5所示,与对照组相比,亚硝酸钠组和氯化铵组细胞内ODC荧光颗粒强度明显比对照组强; 亚硝酸钠和氯化铵混合物组比对照组和单用亚硝酸钠或氯化铵组细胞内ODC荧光颗粒强度都明显增强,用ROS清除剂NAC处理后,上述现象被逆转。Western blot检测ODC蛋白表达也得到同样结果。结果提示,亚硝酸钠和氯化铵联合暴露,可显著增加肝癌细胞内ODC水平。

Figure 5

Figure 5 Effect of combined exposure to SN and AC on the ornithine decarboxylase (ODC) levels of SMMC-7721 cells. A: The ODC levels detected by immunofluoresent assay in SMMC-7721 cells exposure to vehicle (control),SN (150 μmol·L−1),AC (150 μmol·L−1),SN+AC (150 μmol·L−1) or ROS scavenger NAC (5 mmol·L−1); B: The expression of ODC in cells detected by Western blot; C: The histogram showed the ODC relative optical density. n = 3,± s. P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs SN group; △P < 0.05 vs same group free NAC

DFMO是ODC特异性抑制剂,通过抑制ODC活性,减少多胺的合成。图 6 transwell侵袭实验结果显示,亚硝酸钠和氯化铵混合物处理组,细胞穿过小室底部微孔滤膜背面每视野的细胞数显著高于对照组和氯化铵组; 加入ODC特异性抑制剂DFMO后,各组穿膜细胞数均相应减少,其中亚硝酸钠和氯化铵混合物处理组减少更加明显 (图 6C)。图 6B细胞内ROS检测结果显示,亚硝酸钠和氯化铵混合物处理组,细胞内ROS水平明显高于对照组和亚硝酸钠组; 加入ODC特异性抑制剂DFMO后,各组细胞内ROS水平均有升高趋势,其中亚硝酸钠和氯化铵混合物组ROS水平明显升高。结果提示,细胞内ROS水平轻度升高不一定增强细胞侵袭能力,ROS过量升高反而会减弱细胞侵袭能力。细胞内ROS水平只有维持在一个适当的范围才有可能促进细胞侵袭。综合图 5和图 6结果表明,亚硝酸钠和氯化铵联合暴露,增强细胞内ROS水平,由此反馈性增加ODC表达,ODC表达增加在一定程度上对冲了细胞内ROS过度增高,使细胞内ROS水平维持在一定范围内,进而促进了肝癌细胞侵袭能力。

Figure 6

Figure 6 SN and AC mixture promoted cell invasion via enhancing ROS/ODC pathway. A: Cell invasion tested by transwell chamber in SMMC-7721 cells exposure to vehicle (control),SN (150 μmol·L−1),AC (150 μmol·L−1),SN+AC (150 μmol·L−1) or the specific ODC inhibitor DFMO (5 mmol·L−1); B: The histogram showed ROS levels detected by fluorescence microscope; C: The quantified results of A. n = 3,± s. P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs SN group; △P < 0.05 vs same group free DFMO. DFMO: Difluoromethylornithine

亚硝酸盐在体内具有独特的氧化还原能力: 在缺氧环境下,被单电子还原为NO; 在常氧条件下,亚硝酸盐可被单电子氧化为NO₂^•[12]。NO₂^•本身是ROS家族的一员。亚硝酸盐作用于细胞的靶点主要是线粒体复合物,通过抑制线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ,使得O₂不能与其结合,从而导致细胞内ROS水平增加^[13]。亚硝酸盐常氧下促进细胞内ROS水平增加有细胞选择性,对于正常人呼吸道上皮细胞,50 μmol·L⁻¹亚硝酸钠处理24 h可明显增加细胞内ROS水平,促进细胞迁移和增殖^[12]。对于急性粒细胞性白血病细胞(HL-60),亚硝酸钠 (0.5～5mmol·L⁻¹) 常氧下处理,发现细胞内ROS水平呈剂量依赖性增加,同时促进细胞增殖,用10 mmol·L⁻¹亚硝酸钠处理HL-60细胞,ROS进 一步增加,细胞增殖被抑制,细胞凋亡增多^[14]。本实验在常氧下单独用亚硝酸钠 (150 μmol·L⁻¹) 处理SMMC-7721细胞,发现细胞内ROS水平增加,细胞活力增强,但是促进细胞侵袭的作用不明显。这种现象可能与亚硝酸钠作用剂量小,ROS水平升高幅度不大有关。因为用300 μmol·L⁻¹亚硝酸钠处理SMMC- 7721细胞24 h,细胞内ROS水平明显升高,细胞侵袭能力明显增强^[15]。由此可见,相对于正常细胞,肿瘤细胞可能有较强的抗氧化能力,需要较高剂量的亚硝酸盐才能升高细胞内ROS水平达到一定范围,从而促进细胞增殖和侵袭; 细胞内过高的ROS反而会抑制细胞增殖,促进细胞凋亡^[16]。

氨是细胞代谢产生的废物,通常由肝细胞以合成尿素的方式排出体外。肝癌细胞不同于正常肝细胞,它失去将氨合成尿素的能力,从而使癌细胞内氨蓄积^[17]。对于肿瘤细胞而言,氨是维护癌细胞内pH值稳定的主要物质,它还具有抑制细胞自噬溶酶体形成,促进细胞增殖和侵袭的作用^[18]。本实验所用氯化铵浓度是150 μmol·L⁻¹,明显低于肿瘤组织内部氨的浓度^[4]。结果发现,氯化铵增加细胞活力和侵袭能力,细胞内ROS水平无明显变化。这种现象提示,单独用较低浓度的氯化铵处理SMMC-7721细胞还不足以提升细胞内ROS水平,其促癌作用是不依赖ROS的。

本实验发现,亚硝酸钠联合氯化铵处理SMMC-7721细胞24 h,细胞活力、侵袭能力和ROS水平明显比单独应用亚硝酸钠组升高,这些现象可以被ROS清除剂NAC逆转,结果表明亚硝酸盐遇到铵盐时,可进一步增加肝癌细胞内ROS水平,进而促进肝癌细胞侵袭。这种现象很有可能与铵盐协助亚硝酸盐大量进入癌细胞内有关。因为NO₂⁻¹是一个带电离子,本身不能自由通过细胞膜,NO₂⁻¹只有在H⁺协助下才 能通过细胞膜进入线粒体内^[19]。铵离子在细胞外解离为NH₃和H⁺,H⁺协助NO₂⁻¹通过细胞膜进入细胞质,在肝癌细胞内H₂O₂作用下,NO₂⁻¹被氧化为NO₂^•。相对于正常细胞而言,肝癌细胞内糖酵解增强,细胞内H⁺蓄积,H⁺进一步协助NO₂⁻¹通过线粒体外膜进入线粒体基质,从而使大量线粒体呼吸链复合物被抑制,由此导致ROS产生增加。在一定程度范围内升高肝癌细胞内ROS水平,对癌细胞有促进作用^[20]。癌细胞内ROS水平增加势必会反馈性增加细胞抗氧化能力,ODC就是癌细胞抗氧化系统中的一员。ODC是多胺合成途径的关键酶,其合成的产物精胺本身就是ROS清除剂^[21]。另外,ODC本身也是公认的促癌标志分子,增加细胞内ODC表达可以促进肝癌细胞增殖和侵袭^[22]。本实验发现,亚硝酸钠和氯化铵混合物明显促进细胞内ODC表达,活性氧清除剂NAC可逆转这种现象。结果提示,亚硝酸盐和铵盐联合暴露促进细胞内ROS增加,从而反馈性增加细胞内ODC表达。用ODC特异性抑制剂DFMO处理细胞,进一步增加了各组ROS水平,其中亚硝酸钠和氯化铵混合物组ROS的增加具有明显差异。与此同时,细胞的侵袭能力反而明显下降。这些现象表明,癌细胞内ROS对细胞的侵袭作用是有浓度适用范围的,癌细胞内ROS水 平过低对细胞侵袭作用不明显; ROS水平过高导致细胞损伤,反而会抑制细胞侵袭能力^[23]。

综上所述,在铵盐存在下,亚硝酸盐促进SMMC- 7721细胞增殖活性和侵袭能力的作用明显增强。铵盐促进亚硝酸盐大量通过细胞膜进入细胞质,使细胞内ROS增加,进而反馈性增加ODC表达,从而使ROS维持在一个合适的浓度范围,由此增强细胞的侵袭能力。本实验结果提示,在临床应用亚硝酸盐时,一定要考虑癌症患者肿瘤内部高氨环境,避免亚硝酸盐对癌细胞侵袭的促进作用。