自1994年Grundemann等^[1]克隆了第1个有机 阳离子转运体OCT1以来,不断有新的转运体被证实介导有机阳离子药物的转运。目前已经报道并在分子水平得到证实的相关转运体包括有机阳离子转运体 (organic cation transporter family,OCT1-3)、有机阳离子/肉毒碱转运体 (organic cation/carnitine transporter family,OCTN1-2)、多药及毒性化合物外排转运体 (multidrug and to xin extrusion family,MATE1-2) 以及细胞膜单胺转运体 (the plasma membrane monoaminetransporter,PMAT)^{[2, 3]}等。

这些有机阳离子转运体在不同的组织表达,选择性地吸收或外排不同的有机阳离子药物,大多数有机阳离子药物都被证实经由上述报道的有机阳离子转运体转运,如三乙胺 (TEA)、肉毒碱^{[4, 5]}等。然而,Yamazaki等^{[6, 7]}发现,H₁-拮抗剂美吡拉敏能被牛脑毛细血管内皮细胞(BCEC) 以转运体转运的方式摄取,但其转运特点却不符合已报道的有机阳离子转运体特征,这种新的转运不能被典型有机阳离子转运体底物抑制,但转运呈温度和浓度依赖,包含一个可饱和及一个不饱和的摄取过程,能被某些H₁-拮抗剂或碱性脂质药物所竞争性抑制,且转运刺激实验结果表明,预先孵育未标记的美吡拉敏可增加³H标记的美吡拉敏的摄取量。

越来越多的有机阳离子类药物,像苯海拉明^[8]、氧可酮^[9]、普拉克索^[10]等均被发现不具备OCTs、OCTNs、MATE和PMAT等转运体底物的特征,相反地,在特定的细胞和组织中,其吸收或外排均呈pH依赖性 (H⁺逆向转运),对Na⁺和膜电位不敏感,能被美吡拉敏等药物抑制。因此,研究者猜测可能存在一种新型的有机阳离子转运体介导了这些药物的转运,并把这种转运体定义为美吡拉敏敏感的、逆质子有机阳离子转运体 (pyrilamine-sensitive H⁺/OC antiporter)。本文将对这种新型的有机阳离子转运体的研究进展进行全面的归纳和阐述。

对H⁺逆向转运体来说,酸化外部环境会造成H⁺内流,减少对底物的摄取,相反,碱化外部环境则可以促进吸收。同理,酸化细胞内部环境会造成H⁺外流,摄取增加,而碱化内部环境摄取减少。以苯海拉明在TR-BBB13细胞 (大鼠脑毛细血管内皮细胞) 上的摄取为例,pH 6.0和8.4的给药基质和pH 7.4相比,分别能显著减少和增加药物的摄取。NH₄Cl在水相介质中可解离出NH₃和H⁺,分子形式的NH₃能自由扩散透过细胞膜,进而带动H⁺的流动。当用NH₄Cl处理细胞,就会造成H⁺内流。而用NH₄Cl预处理细胞,再将细胞暴露在无NH₄Cl的环境中,细胞中NH₃扩散出细胞膜,H⁺则会外流。实验中发现,摄取时共给药苯海拉明和NH₄Cl,细胞对苯海拉明的摄取减少,而预处理则摄取增加。此外,在给药基质中加入碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙 (FCCP),一种可跨细胞膜的质子载体,使H⁺内流,苯海拉明的摄取也会减少^[8]。

在Caco-2细胞 (pH 7.4) 孵育亚甲二氧基甲基苯丙胺 (MDMA) 一段时间,达到摄取平衡后,再加入NaOH碱化给药基质,细胞对药物的摄取在已平衡的基础上还能继续增加。而预孵育药物结束后,用不含药物的培养基清洗细胞,pH 6.0空白培养基比pH 7.4空白培养基能带走更多细胞内已经摄取的药物,促进药物外排^[11]。因此,可以看出美吡拉敏转运体对药物的转运是一个双向的 (吸收和外排)、依赖H⁺的逆向转运过程。

许多转运体都需要Na⁺的协助才能完成转运,如OCTN2转运体每转运1个肉毒碱分子需要1个Na⁺的协助^[4]。而小鼠脑灌流摄取实验显示,当灌流液中Na⁺用K⁺或胆碱代替时,大脑对可乐定的摄取并没有发生显著性变化,说明美吡拉敏转运体对可乐定的转运呈非Na⁺依赖^[12]。同样,曲马多在hCMEC/D3 (人脑毛细管内皮细胞) 上的摄取也不受葡甲胺或K⁺替代Na⁺的影响^[13]。

缬氨霉素是一种脂溶性抗生素,与K⁺有特异性的亲和力,能携带K⁺自由扩散通过细胞膜。细胞培养基中加入缬氨霉素,可引起K⁺内流,造成细胞膜电位变化。在RBEC细胞 (大鼠脑毛细血管内皮细胞) 培养基内加入缬氨霉素时,普拉克索的摄取并未见显著变化,说明这种转运与膜电位的变化无关^[10]。

这种新的转运体叫作美吡拉敏敏感的、逆质子有机阳离子转运体,这是因为科学家发现其第1个底物是美吡拉敏^{[6, 7]},且它可以作为抑制剂抑制其他底物的转运过程。随后发现这种转运体的底物均是其抑制剂,可以竞争性的抑制其他底物的转运。在TR-BBB13细胞上,苯海拉明可以抑制氧可酮的摄取,同样,氧可酮也可减少苯海拉明的吸收,两者之间是一种相互竞争的抑制过程^[8]。研究中常用的抑制剂有: 美吡拉敏、苯海拉明和氧可酮等。

Yamazaki等^[6]对美吡拉敏进行早期吸收机制研究时发现,一些碱性的脂质药物能抑制其摄取。Mizuuchi等^[14]发现,具有N-二甲基和N-二乙基的叔胺结构药物能抑制苯海拉明的摄取,而乙醇胺结构则无此抑制作用。André等^[12]推测这种转运体的底物应具有如下特征: 脂肪族的仲胺或叔胺基团,通过1～4个原子 (碳原子或杂原子) 连接一个平面芳香结构 (苯环或吡啶环)。

Kubo等^[15]通过分析不同有机阳离子药物对普萘洛尔摄取的抑制效果,将抑制率或半数抑制率 (IC₅₀) 对抑制剂的logD值 (特定pH下,在正辛醇/水中的分配系数) 进行相关性研究。结果显示,有机阳离子药物可以分为3类,① 含有伯、仲、叔胺结构的药物,对普萘洛尔的抑制率随logD增大而增大,抑制率和logD的线性回归相关系数R² = 0.734; ② 典型阳离子转运体 (OCTs、OCTNs等) 的底物,如季胺结构的阳离子药物,对普萘洛尔吸收没有抑制作用; ③ 维拉帕米和可乐定等药物,虽然具有抑制作用,但抑制率和logD的线性相关性不好。因此,研究者认为这种转运体的底物可能是脂肪族的伯、仲、叔胺类有机阳离子。

本课题组对美吡拉敏转运体的底物特征也进行了较为深入的研究。最初发现小分子胺能够作为脑靶向修饰载体,提高布洛芬、多巴胺和苯丁酸氮芥等药物的入脑量^{[16, 17, 18, 19]}。其中,分别用叔胺、仲胺和伯胺等小分子有机胺对布洛芬进行结构修饰,并对这一系列布洛芬衍生物进行了入脑机制的研究^[20]。研究发现,伯胺结构的衍生物入脑呈非能量依赖,而叔胺和仲胺结构的衍生物入脑则呈能量依赖,且入脑特性符合美吡拉敏转运体机制 (pH依赖,对Na⁺ 和膜电 位不敏感,能被美吡拉敏等底物竞争性抑制)。同时,衍生物对美吡拉敏转运体的亲和力为: 叔胺 > 仲胺 > 伯胺,特别是可能由于空间位阻的影响,N原子上的修饰基团对亲和力也具有影响,其亲和力为: N上甲基 > N上乙基。此外,美吡拉敏转运体的底物必须具备一定的脂溶性。当用乙醇胺修饰水溶性药物多巴胺时,其入脑量并没有显著增加,而将多巴胺的羟基酯化增加分子脂溶性后,入脑量则明显增加,且这种增加主要是由美吡拉敏转运体介导的^[18]。

目前,已经报道的美吡拉敏转运体的底物主要有美吡拉敏、苯海拉明和氧可酮等 (表 1)^{[21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]},结合各自结构特点及研究结果,作者认为,美吡拉敏转运体的底物特点为: ① 具有一定的脂溶性,且随着脂溶性增大,亲和力增加; ② 具有氨基基团 (除季铵),亲和力: 叔胺 > 仲胺 > 伯胺。

表1(Table 1)

Table 1 The published substrates of pyrilamine-sensitive H+/OC antiporter. MDMA: 3,4-Methylenedioxymethamphetamine Substrate Chemical structure Cell line / animal model Reference Pyrilamine BCEC,TR-BBB13,hCMEC/D3,rat brain perfusion [6, 7, 21, 22] Pramipexole RBEC1,rat brain perfusion [10] Oxycodone TR-BBB13,rat brain perfusion [8, 22] Diphenhydramine hCMEC/D3,Caco-2,rat brain perfusion [8, 14, 21, 23] Apomorphine hCMEC/D3 [24] Tramadol hCMEC/D3 [13] Memantine hCMEC/D3 [25] Verapamil RPE/Hu,ARPE-19 [26] Nicotine TR-BBB13,rat brain perfusion [3] Propranolol TR-iBRB2 [15] MDMA Caco-2 [11] Codeine Caco-2,RBE4 [27] Clonidine mouse brain perfusion [12]

Table 1 The published substrates of pyrilamine-sensitive H+/OC antiporter. MDMA: 3,4-Methylenedioxymethamphetamine

值得注意的是,很多转运体的底物都没有明显的结构相似性,如PMAT转运体,研究发现其高亲和底物需要一定的分子量、阳离子结构和至少一个平面的芳香结构,但没有化学结构式上的明显规律来定义此类底物。对PMAT来说,一定程度的脂溶性是必要条件,但脂溶性则不能过高,如高脂溶性的维拉帕米不是PMAT的底物^[9]。所以,对某些转运体来说,难以单从结构上去判断某药物是否为底物。美吡拉敏转运体的底物,其结构特点是具有脂溶性和氨基基团,但是也缺少结构式上的明显规律,因此,其更多的底物还需要靠具体实验来发现和验证。

关于该转运体的研究主要集中于脑、小肠及视 网膜。已证实的体外细胞水平的模型有: 牛脑毛细 血管内皮细胞 (BCEC)^{[6, 7]}、大鼠脑毛细血管内皮细胞 (RBEC1、TR-BBB13、RBE4)^{[2, 10, 22, 27]}、人脑毛细血管内皮细胞 (hCMEC/D3)^{[13, 21, 24, 25]}、人小肠细胞 (Caco-2)^{[11, 23, 27]}、人视网膜色素细胞 (RPE/Hu、ARPE-19)^[26]和视网膜内皮细胞 (TR-iBRB2)^[15]。在动物水平上,Okura等^{[10, 21, 22]}通过大鼠脑灌流实验证实,大鼠脑毛细血管表达美吡拉敏转运体,且苯海拉明、美吡拉敏和氧可酮等药物的摄取可被相互抑制。André等^[12]通过小鼠脑灌流实验,研究了可乐定在脑中的吸收特性,在体内证实了美吡拉敏转运体的一系列转运特性。鉴于有机阳离子类转运体在脑、胃肠道、肝脏和肾脏等有大量表达,美吡拉敏转运体的表达也可能不局限于脑、小肠及视网膜。由于美吡拉敏转运体尚未在分子水平上得到验证,无法借助其mRNA序列信息进行全面的组织检测,其详细的组织表达信息还有待完善。

有机阳离子类的转运体,除OCTs有严格的非pH、Na⁺依赖,只依赖膜电位外,其他转运体的转运特性比较复杂 (表 2)^{[4, 28,29,30]}。美吡拉敏转运体呈pH依赖性 (H⁺ 逆向转运),对Na⁺ 和膜电位不敏感。但 这些特性并不足以和其他转运体区别。这些已知转 运体的底物或抑制剂,如TEA、1-甲基-4-苯基吡啶离子 (MPP⁺) 和肉毒碱,对美吡拉敏转运体没有明显的抑制作用,而美吡拉敏转运体的底物之间存在相互竞争性的抑制。

表2(Table 2)

Table 2 The differences between pyrilamine-sensitive H+/OC antiporter and other organic cation transporters[4, 28,29,30]. TEA: Triethylamine; MPP+: 1-Methyl-4-phenylpyridinium iodide; “+”: Dependent; “-”: Independent. MATE: H+ or Na+ dependent Organic cation transporter H+ Na+ Membrane potential Typical substrate OCT1 - - + TEA,MPP+ OCT2 - - + TEA,MPP+ OCT3 - - + TEA,MPP+ OCTN1 + - - TEA not clear + - Carnitine OCTN2 + - - TEA not clear + - Carnitine PMAT - - + MPP+ MATE - TEA Pyrilamine-sensitive + - - Pyrilamine

Table 2 The differences between pyrilamine-sensitive H+/OC antiporter and other organic cation transporters[4, 28,29,30]. TEA: Triethylamine; MPP+: 1-Methyl-4-phenylpyridinium iodide; “+”: Dependent; “-”: Independent. MATE: H+ or Na+ dependent

更重要的是,Shimomura等^[21]曾在hCMEC/D3 细胞上对各种有机阳离子在mRNA水平的表达进 行了验证。结果发现,检测到的相关转运体,按表达量依次为OCTN2、OCTN1、PMAT、OCT3和OCT1,MATE1-2和OCT2几乎测不到,这些表达的转运体的底物又不能抑制美吡拉敏等摄取。因而,推断这种美吡拉敏敏感的、逆质子有机阳离子转运体是一种全新的有机阳离子转运体。

关于美吡拉敏转运体的研究还处在初步阶段,还有许多亟待解决的问题。首先,这种转运是主动转运还是易化扩散,是否能量依赖存在争议。Yamazaki等在研究美吡拉敏时,发现其在BCEC细胞上的摄取呈温度依赖性; 能量抑制不能改变美吡拉敏的摄取,推测这种转运是一种易化扩散。当模型细胞变为TR-iBBB13^{[8, 22]}或hCMEC/D3^{[13, 21, 24]}时,能量抑制 可以明显抑制底物的转运。其次,由于缺乏化学结构式上的规律,不通过摄取实验很难判断某个药物是否为美吡拉敏转运体的底物。Yabuuchi等^[5]报道在OCTN1基因导入的爪蟾卵母细胞中,美吡拉敏的摄取显著增加,推测它可能也是OCTN1转运体的底物。然而,在hCMEC/D3细胞上,美吡拉敏的摄取又被证明不是由OCTN1介导的^[21]。由此可见,同样的药物在不同的组织或细胞,甚至在细胞两侧的吸收/外排机制都是不同的,这又为美吡拉敏转运体的研究增加了难度。

此外,由于转运体分子结构信息的缺乏,目前无法获得美吡拉敏转运体在机体内表达的具体位置,这为进一步研究其转运特性造成了很多困扰。转运体在不同的组织、不同的位置,其功能也不尽相同。在大鼠脑灌流实验中,美吡拉敏转运体介导尼古丁的双向转运,血到脑 (influx) 的速率是脑到血 (efflux) 的2倍。整体来看,这是一个净摄取的过程^[2]。在正常生理情况下,美吡拉敏转运体的作用还是未知的。

美吡拉敏转运体的研究还需要更多的实验验证。当务之急是从分子水平上验证转运体,获取转运体蛋白的详细信息,进而完善转运体的转运特点。分子水平的研究主要是借助分子克隆技术,设计合理的引物mRNA,反转录获取编码转运体蛋白的cDNA序列,进而分析体内各组织该基因的含量,表达蛋白验证性状等^{[31, 32]}。未知分子的克隆难点在于引物mRNA的设计和筛选。功能相近的转运体一般具有相似的DNA序列,可以通过参照已知的序列,设计未知的引物mRNA进而减少筛选工作量。对美吡拉敏转运体,可以参照已知的阳离子转运体的序列来优化筛选过程,但不可否认,仍需要大量的工作。

综上所述,美吡拉敏敏感的、逆质子有机阳离子转运体是一种全新的有机阳离子转运体,其转运特性为pH依赖 (H⁺逆向转运)、对Na⁺和膜电位不敏感、转运过程能被美吡拉敏等药物抑制。目前在脑、小肠及视网膜细胞上发现有转运表达,推测底物必须具有一定的脂溶性和氨基基团 (除季铵),典型的底物为美吡拉敏、苯海拉明和氧可酮。在分子水平,美吡拉敏转运体暂未得到验证。不过,这种美吡拉敏转运体完全独立于现有的有机阳离子转运体,其转运特性和底物特征,都与目前证实的其他阳离子转运体不同。此外,这种新的转运体在脑毛细血管细胞的高度表达,将为小分子脑靶向给药系统提供新的途径。相信未来一定会涌现更多针对此转运体的药物修饰策略,克服血脑屏障,增加治疗药物的入脑量,这也为小分子脑靶向制剂的开发提供更多可能。