2016, Vol. 51
阿尔茨海默病 (Alzheimer’s disease,AD) 是一种神经退行性疾病,临床表现为记忆减退、认知功能下降,在严重影响患者生活质量的同时,也对患者家属和社会造成了沉重的负担。关于AD的发病机制目前还没有定论,但其突出的病理特征已获得广泛共识,包括神经元外β淀粉样蛋白 (amyloid-β,Aβ) 异常沉积、神经元内微管相关蛋白 (tau蛋白) 过度磷酸化形成神经纤维缠结以及皮层、海马等脑区的萎缩[1]。另外,氧化自由基损伤在疾病早期即有发生[2],是中枢神经系统功能减退和神经元死亡的诱因之一。
铁作为人体含量最多的金属元素,参与血红素、肌红素、细胞色素以及多种酶的合成,对机体的代谢活动至关重要。在中枢神经系统中铁参与髓鞘形成[3]和神经递质传递等过程。缺铁性贫血,是常见的营养缺乏症,也是世界范围内造成贫血最常见的原因。孕妇缺铁会对胎儿神经发育造成不可逆转的损害。但过量的铁则会增加氧化自由基的生成,对组织造成损伤。研究[4, 5]显示,脑内铁水平随年龄增长逐渐增加,约在55岁达到平台。一方面,脑内铁沉积可以增加氧化自由基生成,导致炎症反应。另一方面,炎症反应也可以通过诱导铁调素 (hepcidin) 表达,抑制细胞对铁的外排。这可能与“AD患者部分脑区铁沉积,而血浆铁水平降低的现象[6]”有关。此外,铁还影响Aβ前体蛋白 (Aβ precursor protein,APP) 代谢并促进Aβ的聚积。虽然,目前对于铁沉积是AD的诱发因素还是由神经元死亡、炎症反应引起的伴发现象尚无定论,但是铁和AD的关系仍受到广泛的关注。
1 铁离子代谢及其稳态维持 1.1 铁的吸收分布与排泄每日人体需铁量约为30 mg,从饮食中获取的铁只有1～2 mg,其余均来自机体铁循环[7]。
饮食中的铁主要在十二指肠以及空肠近端被吸收。血红素铁通过肠道上皮细胞上的受体摄入。非血红素铁主要以三价形式存在,在肠道环境中被还原成二价,经肠道上皮细胞的二价金属转运体1 (divalent metal transporter 1,DMTI) 介导进入肠道上皮细胞并汇入“可变铁池”(labile iron pool,LIP)。生理状态下LIP中铁水平维持在一定范围,一部分进入线粒体,为合成血红素以及铁硫簇提供原料; 另一部分与肠道上皮细胞基底层的铁转运蛋白 (ferroportin,FPN1) 结合,并在铁氧化酶的协助下释放入血。在血液中 铁主要以转铁蛋白 (transferrin) 结合形式存在,被输送至全身,各组织通过转铁蛋白受体 (transferrin receptor,TfR) 介导对铁的利用,一方面可以防止血液中过量的游离铁产生氧化自由基损伤血管; 另一方面由于不同组织TfR密度不同,可对铁的转运产生靶向作用。细胞内多余的铁与铁蛋白 (ferritin) 结合贮存起来[8]。
机体铁循环再利用是指巨噬细胞吞噬衰老、受损的红细胞作为铁来源并经上述途径在胞内利用、释放入血及贮存。脑组织通过脑微血管上皮细胞 (brain microvascular epithelial cells,BMVEC) 吸收铁。转铁蛋白结合铁由BMVEC顶膜的TfR1介导入胞,释放出的二价铁离子 (Fe2+) 再经基底层FPN1进入脑组织[9]。同肠道对铁的吸收相似,脑组织对铁的需求量也远高于BMVEC对铁的摄取,且循环系统中铁水平的波动对脑组织铁水平影响不大,提示脑存在独立的铁循环机制。
1.2 铁稳态的调节目前尚未发现铁的主动排泄途径,铁丢失只发生于上皮细胞脱落和一些出血情况。机体铁稳态主要从细胞和整体水平对铁吸收和贮存环节进行调节。
细胞内铁稳态的维持依赖于LIP中Fe2+对铁吸收、贮存和外排相关蛋白表达的调节。Ferritin和FPN (不包括肠道上皮细胞和红细胞) 的mRNA 5' 非翻 译区(untranslated regions,UTR) 存在铁反应元件 (iron responsive element,IRE),铁调节蛋白 (iron regulatory protein,IRP) 可与之结合,阻止翻译过程的启动; DMT1和TfR1的mRNA 3' UTR也存在IRE,IRP与之结合,可稳定mRNA结构,延长其半衰期。IRP有两种亚型: IRP-1只受细胞内Fe2+水平的调节; IRP-2受细胞内铁和氧状态的双重调节[10]。当胞内LIP中Fe2+处于高水平时,IRP从IRE上脱落。Ferritin和FPN1翻译过程启动,蛋白表达增加; 而对于DMT1和TfR1,由于mRNA降解加快,蛋白表达降低。此时细胞对铁的摄取减少、贮存增加、外排增加。当LIP中Fe2+处于低水平时,细胞采取与此相反的策略以维持LIP稳定。
整体铁水平受hepcidin调节,循环系统中的hepcidin是肝细胞在高浓度游离铁或炎症因子刺激 下分泌的一种多肽类激素,具有负性调节铁水平的功能。它作用于细胞膜上的FPN1使其内化降解,从而抑制肠道上皮细胞和巨噬细胞向循环系统中释放铁[11]; 同时也抑制DMT1活性以减少铁摄入。外周血中的铁调素不能通过血脑屏障,中枢神经系统中铁稳态的调节需要星型胶质细胞分泌的hepcidin参与[9]。
2 铁稳态失常与AD 2.1 AD患者及模型动物铁稳态异常AD患者脑内铁水平的问题一直存在争议,大量研究报道[12, 13, 14, 15]了AD患者脑组织铁沉积的现象。但在对铁含量的检测方法、入组标准以及样本保存条件等因素严格控制后进行荟萃分析 (meta-analysis),Schrag等[16]发现“以往关于AD患者脑内铁含量显著升高的现象被明显夸大了”。AD患者新皮质中铁含量与同龄对照相比并无显著性改变。在另一项荟萃分析中,Tao等[6]得出AD患者海马等脑区存在铁沉积的结论。提示AD患者脑内铁稳态的失常并不是整体的过量或不足,而是具有脑区特异性的分布紊乱。应用荟萃分析的方法进行综述,得出的结论比较客观,但入选标准的制定对结果的影响很大,针对同一问题仍可得出不同结论: AD患者血液铁水平的变化目前仍没有达成共识[6, 17]。同样值得一提的是,针对AD脑组织铁含量问题的荟萃分析均将应用组化和核磁共振成像 (magnetic resonance imaging,MRI) 等检测方法的研究排除在外[6, 16],原因是这些半定量的方法不够准确且干扰因素较多。但半定量的方法可以提供铁离子价态和细胞内定位的信息,为研究AD机体铁分布情况提供线索。在AD患者铁沉积的脑区特异性受到重视的同时,胞内Fe2+所占比例也应该引起关注,这部分铁既是调节细胞内铁水平的基础也是参与芬顿反应产生氧化自由基的根源。
与此同时,AD转基因动物也表现出铁稳态异常。淀粉样前体蛋白和早老素双转基因 (Aβ precursor protein/presenilin-1,APP/PS1) 小鼠脑组织参与铁吸收过程的DMT1表达升高,介导细胞铁释放的FPN1表达降低。这使得APP/PS1小鼠脑内铁更易蓄积。研究[18]证实,12月龄的APP/PS1小鼠与同龄野生型小鼠及6月龄APP/PS1小鼠相比,脑内铁水平显著增加。另外,tau蛋白基因敲除小鼠从6周龄开始脑组织铁水平显著高于同龄野生型[19]。除了AD模型动物自发出现脑铁沉积的现象外,高铁饮食也能加重多种模型动物AD样行为表现。模型动物与AD临床表现的相似性有助于对抗AD药物的研究和评价,但同时仍需注意到,AD模型小鼠与患者在Aβ斑块组成及脑内铁分布情况上存在差异[20]。
2.2 铁稳态异常促进AD发生 2.2.1 铁沉积加重氧化应激AD病程早期即有氧化应激损伤的发生,表现为核酸、蛋白质和脂质的过氧化产物显著增加[21]。铁沉积在多种神经退行性疾病中均有报道,并被认为与脑组织氧化应激损伤相关[15]。过量的活性氧自由基 (reactive oxygen species,ROS) 和活性氮自由基 (reactive nitrogen species,RNS) 是造成生物大分子氧化损伤的原因。正常情况下它们参与促血红蛋白生成、免疫反应以及平滑肌舒张等生理过程[22],只有机体抗氧化物质与氧化自由基之间平衡被打破时氧化应激才会发生。抗氧化能力的下降与氧化自由基生成的增加,均可导致氧化应激从而对组织造成损害。Fe2+通过芬顿反应 (Fe2++H2O2→Fe3++HO·+OH-) 生成的羟自由基 (HO·) 是最活跃的自由基[23],这是铁沉积加重氧化应激的有力依据。
2.2.2 铁与Aβ相互作用促进AD发生发展铁加重Aβ沉积: 首先,铁上调APP表达。APP具有铁氧化酶活性,协助FPN1向神经元外排铁的作用[24]。研究[25]显示,APP的mRNA 5’UTR存在与ferritin、FPN1铁反应元件同源的茎环结构,其转录也受Fe2+水平 的调节,神经元铁离子内流上调APP表达。其次,铁影响APP代谢,促进Aβ的生成和聚集。在体及体外实验均证实,过量铁促进APP生成Aβ,同时加重实验动物AD样行为[26]。铁还可提高γ分泌酶活性,增加Aβ的产生[27]。另外,Aβ可加重铁造成的氧化应激损伤: Aβ蓄积三价铁离子并使其还原成二价态,加重铁生成氧自由基的能力[28]。
2.2.3 ApoE4携带者的AD易感性与铁稳态失常相关载脂蛋白E (apolipoprotein E,ApoE) 是一个含有299个氨基酸残基的载脂蛋白,其基因是目前已知与AD易感性相关度最高的基因。人类ApoE位于常染色体,有3种编码形式: ApoE2、ApoE3和ApoE4。其中ApoE3所占比例最高,约为60%～70%。ApoE4约为15%～20%。与ApoE3相比,ApoE4在112位和158位的两个氨基酸残基不同,蛋白质三级结构发生了变化。这种差异导致ApoE4对高密度脂蛋白 (high- density lipoprotein,HDL) 具有较低的亲和力。ApoE4是公认的AD高危险因素,而ApoE2则具有抗AD作用[29]。一项为期7年的纵向研究显示,ApoE4携带者的AD易感性与脑内铁稳态失衡有关。对认知正常、轻度认知障碍 (mild cognitive impairment,MCI) 和AD患者脑脊液 (cerebrospinal fluid,CSF) 中ferritin水平进行检测,3组之间虽然没有明显的差异; 但在同一组内,ferritin水平却与7年间的认知功能下降程度相关。特别是在MCI组中,患者初始ferritin水平每毫升提高1 ng,其发展成AD的时间将缩短3个月。且CSF中ferritin水平与ApoE水平呈正相关。ApoE4携带者比非携带者平均ferritin水平高20%[30, 31]。
3 以铁清除为靶点的抗AD药物研发现状 3.1 单靶点铁清除剂脑内铁沉积的现象在多种神经退行性疾病中均有发生,已有将治疗全身性铁超载的药物应用于脑组织疾病的方案进入临床研究。虽然针对AD的临床研究尚未开始,铁清除剂对AD的治疗作用已在细胞和动物水平获得了肯定。
3.1.1 去铁胺去铁胺 (deferoxamine) 是用于治疗全身性铁超载病的药物之一,属于羟肟酸络合剂。羟肟酸基可与Fe3+形成稳定、无毒的水溶性铁胺复合物,由尿排出。早在1991年,《柳叶刀》即发表过一项为期2年的研究[32],结果显示去铁胺可显著改善AD患者的生活能力。但是去铁胺治疗组的25位患者,有 5人出现厌食症状。推测可能的原因为: 去铁胺的脂溶性差,血脑屏障 (blood brain barrier,BBB) 透过率低,在发挥中枢治疗作用的同时容易产生外周不良反应。此后的十几年里几乎没有相关研究,直到2012年Hanson等[33]第一次将经鼻给予去铁胺应用到AD模型动物上。与静脉给药相比,经鼻给药使药物的皮层靶向作用提高了200倍,可大幅度提高药物脑组织利用率,减少外周不良反应。经鼻给予去铁胺,30 min内即在小鼠脑组织内达到有效浓度,连续给药3个月显著缩短APP/PS1小鼠Morris水迷宫寻台潜伏期[34]。后续的研究显示,去铁胺改善APP/PS1小鼠行为学表现的机制包括降低皮层及海马区可溶性Aβ1-40/Aβ1-42水平,并通过抑制糖原合成酶激酶-3 (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β) 活性,改善脑组织氧化应激状态[35]。Guo等[36]研究与上述结果一致: 给予APP/PS1小鼠高铁饮水,可加重其学习记忆功能损害及脑内Aβ沉积现象。滴鼻给予去铁胺能够减少Aβ沉积从而改善APP/PS1小鼠学习记忆功能。去铁胺的治疗作用也可通过上调缺氧诱导因子 (hypoxia- inducible factor,HIF) 表达,进而增加HIF依赖性神经保护因子的表达[37]。另外,去铁胺也可改善tau蛋白基因突变小鼠P301L的认知功能,但其治疗作用并非通过影响tau蛋白代谢,而是通过上调磷酸化GSK-3β和HIF通路发挥作用[38]。
3.1.2 去铁酮去铁酮 (deferiprone) 在2011年获 得FDA批准用于全身性铁超载病,目前也处于治疗脑疾病的临床研究阶段。它是具有BBB透过性的小分子铁清除剂,在细胞水平可以缓解多种因素造成的氧化应激损伤及神经元死亡[39]。高胆固醇饮食造成的AD家兔模型脑组织有明显的铁沉积现象,去铁酮显著改善此模型动物学习记忆功能,同时降低了Aβ沉积及tau蛋白磷酸化水平,但对脑内铁含量并无明显改变[40]。这种现象在2012年Hanson等[34]对去铁胺的研究中即有报道,鉴于铁清除剂对铁具有高亲和力,研究者认为进入脑组织的药物发挥铁清除作用,但可能由于被清除的游离铁只占脑铁总量的一小部分,其变化未能在整体中表现出来。这一说法还有待更精密的检测方法证实。
3.1.3 地拉罗司地拉罗司 (deferasirox) 是2005年被批准的药物,用于治疗输血引起的铁超载。目前还没有应用地拉罗司治疗脑组织疾病的临床研究,这可能与其说明书警告肝肾损害作用在高年龄人群中更易发生有关。但地拉罗司在动物水平的研究仍然为铁清除剂的抗AD作用提供了依据。老年大鼠 (18月龄) 连续给予地拉罗司4个月可防止由年龄引起的皮层铁蓄积、TfR1/ferritin高表达现象,并缓解了随年龄增长而升高的β分泌酶水平以及皮层Aβ沉积[41]。Kamalinia等[42]将铁清除剂与乳铁蛋白联合使用以改善药物BBB透过率,在双侧海马注射Aβ致AD模型大鼠中也取得显著的治疗效果。细胞水平的研究显示,地拉罗司可以通过干扰凋亡通路发挥神经保护作用。
3.1.4 氯碘羟喹氯碘羟喹 (clioquinol,CQ) 是一种外用抗菌药的有效成分。由于其对铁有温和的清除作用,因而受到AD药物研发者的关注。CQ曾一度用于口服治疗肠道寄生虫病,但由于在日本人群中引起过严重的视神经病,已于20世纪80年代停止口服剂型的使用[43]。在抗AD研究中,CQ显著降低模型动物脑组织Aβ沉积现象,改善行为学表现[19,44,45]。但已有研究[46]显示CQ可引起小鼠背外侧膝状核白质病变,与其造成的视神经病相关。PBT2是CQ的结构类似物,具有毒性低和耐受性好的优点,但因没有达到预期治疗效果已于2014年终止了临床试验[47]。近年仍有以CQ为结构基础的新化合物在临床前研究中显示出较好的抗AD活性,此类药物在进行深入开发之前,有必要对核白质不良反应进行监测。
3.2 多靶点铁清除剂由于AD同时存在多种特征性病理改变,开发多靶点药物已成为一种趋势。改善脑内铁沉积是倍受关注的靶点之一。
M30是以色列药学家Youdim研发的铁清除和 单胺氧化酶 (MAO) 双靶点化合物。将第二代单胺氧化酶抑制剂雷沙吉兰的药效基团与铁清除剂VK28进行整合,获得的一系列双靶点活性化合物,M30是其中药效最强的,且具有无毒和BBB透过性好的特点[48]。
M30对大鼠脑匀浆铁清除作用的IC50在 10 μmol∙L-1水平,对MAO-A/B抑制作用的IC50小于1 μmol∙L-1[48]。2011年,Amit课题组[49]对M30研发情况进行了回顾,并详细介绍了M30在细胞水平发挥神经保护作用的机制。之后,M30在动物水平的实验也获得成功: M30可降低APP/PS1小鼠脑内铁水平,缓解Aβ沉积和tau蛋白异常磷酸化[50],其机制可能包括上调HIF和HIF依赖性神经营养通路,以及调节脑内糖代谢[51]。另外,研究者利用M30对侧脑室注射链脲霉素所致散发性AD (sporadic Alzheimer’s disease,sAD) 大鼠的治疗作用也进行了研究。M30能够改善模型动物空间学习记忆能力,降低海马区tau蛋白磷酸化和胰岛素降解酶水平[52]。M30预防性给药可使sAD大鼠海马区过氧化物酶恢复正常水平[53]。HLA20是与M30同期研发的抗AD活性化合物,与M30药效类似,区别为HLA20是MAO-B的选择性抑制剂,在细胞和动物水平也表现出治疗作用。
在抗AD药物的开发中,已有铁清除、Aβ络合和胆碱酯酶抑制三靶点活性化合物参与,其具有保护神经元免受氧化应激损伤的作用[54]。在细胞水平,对以去铁酮和组胺H3受体拮抗剂为结构基础的一系列化合物进行铁清除、Aβ络合、H3受体拮抗和自由基清除活性进行筛选,其中化合物5C的药理学活性、药代动力学性质及BBB透过性均表现良好,有希望进入下一步研究[55]。
天然产物如茶多酚和姜黄素等为AD治疗提供了另一种选择,它们在某些食物中大量存在,容易获得且安全性好。由于其具有高效的抗炎和抗氧化作用,已在多种疾病的治疗中受到关注。在抗AD的研究中,两者表现出很好的神经保护、减少Aβ沉积和缓解模型动物AD样行为的作用[56,57,58]。茶多酚和姜黄素的AD治疗作用是通过多水平发挥的,其中也包括对脑内铁水平的调节。两者均有铁清除活性,并可调节铁代谢相关蛋白的表达[58,59]。没食子儿茶素没食子酸酯 (epigallocatechin gallate,EGCG) 是绿茶中含量最多、抗氧化能力最强的一种多酚,其铁清除活性与去铁敏相当,可上调TfR表达水平并降低APP的生成[58]。EGCG结构中的邻二羟苯基结构具有还原性,可将Fe3+还原成Fe2+,促进铁蛋白铁的释放[60]。姜黄素治疗性给药可逆转高铁饮食造成的外周铁蓄积现象[61],但姜黄素水溶性不好且生物利用度低[62],改良剂型将是提高其抗AD作用的有效途径。
此外,有研究[63]报道经典抗AD药石杉碱甲的治疗作用也与铁稳态调节有关。石杉碱甲下调TfR1表达,减少转铁蛋白结合铁向神经元内的转运过程,从而降低小鼠脑内铁水平,且给予实验动物高铁饮食可破坏石杉碱甲的一系列抗AD作用。
4 小结神经元的受损和丢失是AD患者学习记忆障碍、认知功能下降的基础。脑内过量的铁通过芬顿反应生成活性氧自由基,打破机体氧化自由基平衡,造成生物大分子损伤; 与Aβ相互作用促进Aβ沉积,增加铁氧化毒性,均可使神经元形态和功能发生改变,最终导致神经元死亡。虽然已有大量研究检测AD患者铁水平,但目前就铁水平的变化仍没能达成共识。为了更好地了解铁在AD病程中的作用,应该更加关注铁沉积的脑区分布情况以及铁离子的存在形式。铁清除剂对AD的治疗作用在细胞及动物水平均有较好的效果,但其逆转模型动物行为学表现往往不是通过明显降低脑内铁水平产生的,相关机制还有待进一步探索。机体铁水平随年龄增长而逐渐增加,AD的发生是脑组织衰老过程的快速化和病态化,破解铁稳态和衰老的关系可能会为深入认识AD提供重要线索,成为开发抗AD药物的有利依据。
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