绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein,GFP)是生物学研究中广泛应用的一种基础工具蛋白[1]。GFP的荧光可以作为检测信号追踪细胞、组织或者生物体。GFP也可以作为生物传感器的组件,用于具象化细胞或者组织中的生物化学反应,将微观的难以监测的生化信号转化为荧光信号。相较于其他报告分子,GFP具有原位、实时的优势,在检测过程中也无需外源加入其他辅助因子[2]。GFP已经先后于原核生物和真核生物中成功表达[3,4],没有表现出明显种族特异性,这也是其被广泛应用的原因之一。基于以上特性,通常将目标蛋白与GFP进行融合表达,以便于对目标蛋白的表达和定位等进行研究。
达玛烯二醇-Ⅱ合酶 (dammarenediol-Ⅱ synthase,DS)催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇-Ⅱ[5],是植物中三萜类化合物和甾醇类化合物生物合成分支的关键酶。目前,人参、积雪草等植物的DS基因已得到克隆并进行了功能鉴定[6,7],但是对DS的亚细胞定位及重组表达分析研究较少。本研究从人参细胞中克隆了DS基因,通过与GFP基因在酿酒酵母中进行融合表达,对其在重组菌中的亚细胞定位及功能进行了研究。
材料与方法菌株与质粒 酿酒酵母双倍体菌株INVSc1 (MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52)购于Invitrogen公司。质粒pESC-HIS购于Invitrogen公司。质粒pEASY-Blunt-GFP为实验室构建。
试剂与仪器 Q5 DNA polymerase、T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自New England Biolabs公司; Taq DNA聚合酶、DNA Marker、PCR产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Transgene公司;酵母质粒提取试剂盒购自天根生物技术有限公司;植物RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司;反转录试剂盒购自TOYOBO公司;其他试剂均为国产分析纯。所用引物由睿博兴科生物技术有限公司合成。3K18型低温高速离心机 (Sigma公司); HZQ-Q型振荡器 (哈尔滨东联电子技术开发有限公司); PCR仪 (德国Eppendorf公司);高效液相色谱仪 (Agilent 1200,安捷伦公司); DNA电泳仪 (Bio-Rad公司);凝胶成像仪 (UVP公司);恒温培养箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司); HPLC-LTQ/FTICR-MS (Thermo公司); INOVA-400核磁共振波谱仪 (Varian公司)。
培养基 INVSc1在YPD培养基上培养;重组菌在SD营养缺陷型培养基上筛选和培养,在SG营养缺陷型培养基上诱导表达。YPD培养基: 1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖; SD培养基: 0.67%无氨基酸酵母氮源、2%葡萄糖、必要氨基酸; SG培养基: 0.67%无氨基酸酵母氮源、2%半乳糖、必要氨基酸。
DS基因克隆以茉莉酸甲酯 (MeJA)诱导的人参细胞为材料,提取人参细胞总RNA,反转录得到cDNA。根据GenBank注册的人参DS cDNA序列 (No. AB265170.1)设计引物A、B和C;根据GFP基因序列设计引物D和E (图 1)。以人参cDNA为模板,分别以A和B、A和C为引物扩增得到基因ds和缺失终止密码子TAA的基因ds-1。以质粒pEASY-Blunt-GFP为模板,以D和E为引物,扩增得到基因gfp,C和D含有用于融合PCR的重叠区。以A和E为引物,以基因ds-1和gfp为模板,扩增得到ds-gfp融合基因。PCR反应程序: 98 ℃ 30 s,(98 ℃ 10 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min) × 30循环,72 ℃ 10 min。具体引物序列见表 1。
表达质粒构建将PCR扩增得到的基因片段ds和ds-gfp分别用EcoRI和NotI、EcoRI和SacI双酶切处理,质粒载体pESC-HIS分别用相应内切酶双酶切处理。回收目的片段,用T4 DNA连接酶将ds和ds-gfp片段分别连接到pESC-HIS,得到的重组表达质粒分别命名为pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP。
酿酒酵母转化采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG转化法[8],将pESC-HIS、pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP转入酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-HIS上筛选重组菌株。
重组菌的筛选从SD-HIS平板上挑取转化子,提取质粒作为模板,以GAL10F和GAL10R为引物进行扩增验证。PCR条件: 94 ℃ 10 min,(94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min) × 30循环,72 ℃ 10 min。将pESC-HIS转入INVSc1所得的对照菌命名为INVSc1-HIS;将pESC-HIS-DS转入INVSc1所得的重组菌命名为INVSc1-DS;将pESC-HIS-DS-GFP转入INVSc1所得的重组菌命名为INVSc1-DS-GFP。
重组酶的表达分析和功能验证通过差速离心法制备INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP微粒体和可溶性蛋白[5],在正置荧光显微镜下观察。向INVSc1-HIS和INVSc1-DS-GFP的173 μL微粒体体系中分别加入40 mmol·L-1 2,3-氧化鲨烯5 μL、1 mol·L-1 MgCl2 2 μL、25 mmol·L-1 NADPH 20 μL,至总体积200 μL,充分混匀,30 ℃温育4 h后,加400 μL乙酸乙酯终止反应,进行HPLC检测。
达玛烯二醇-Ⅱ提取分离与鉴定分别称取INVSc1-HIS、INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP冷干菌体各1.0 g,溶解于90 mL 20%氢氧化钾和60 mL 50%乙醇混合溶液中,70 ℃回流2 h,自然冷却后,回流液分别用150 mL正己烷萃取3次,每次静置30 min[9]。合并萃取液并蒸干正己烷,用2 mL甲醇溶解产物。分别取等量样品利用TLC (展开剂为正己烷-丙酮 = 4:1,碘显色)、HPLC (Cosmosil C18反相柱,4.6 mm × 150 mm,流动相为95%乙腈,流速为1 mL·min-1,柱温28 ℃,检测波长203 nm)和LC-MS鉴定目标产物达玛烯二醇-Ⅱ。采用HPLC制备目标产物 (流动相为95%乙腈,流速为4 mL·min-1),1H NMR (溶剂: CD3OD,400 MHz)检测。
达玛烯二醇-Ⅱ含量测定绘制标准曲线:精密称取达玛烯二醇-Ⅱ标准品,甲醇溶解,配制5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg·mL-1的标准液,进行HPLC检测 (方法同上),每次进样30 μL,每个样品进样3次,以峰面积为纵坐标,样品浓度为横坐标,制作标准曲线。取INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP提取产物,进样30 μL,根据标准曲线测定重组菌中达玛烯二醇-Ⅱ含量。
结果 1 重组表达质粒的构建提取人参细胞总RNA,反转录得到cDNA。以cDNA为模板,以A和B为引物扩增得到基因ds(2 343 bp)。以A和C为引物扩增得到缺失终止密码子TAA的基因ds-1 (2 340 bp);以pEASY-Blunt-GFP质粒为模板,以D和E为引物扩增得到基因gfp (720 bp);以ds-1和gfp为模板,以A和E为引物扩增得到融合基因ds-gfp (3 060 bp)。电泳结果显示,扩增基因大小均与理论值相符 (图 2)。
将PCR扩增得到的ds、ds-gfp片段分别用EcoR I和Not I、EcoR I和Sac I双酶切,切胶回收目的片段,分别连接到相应内切酶处理的表达载体pESC-HIS,得到重组表达质粒pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP,测序验证读码框架正确。
2 质粒转化与重组菌筛选采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG方法将空载体pESC-HIS、重组表达质粒pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP转入酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-HIS上筛选重组菌。挑取转化子,提取质粒作为模板,以GAL10F和GAL10R为引物进行PCR扩增,条带大小均与理论值相符 (图 3),确证获得INVSc1-HIS、INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP。
在荧光显微镜下观察INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP的微粒体和可溶性蛋白,结果显示,仅在重组菌INVSc1-DS-GFP微粒体中存在绿色荧光 (图 4B),INVSc1-DS微粒体、INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP可溶性蛋白中均无绿色荧光 (图 4A、C和D),证明达玛烯二醇-Ⅱ合酶为膜结合型蛋白,因此,选用INVSc1-DS-GFP的微粒体进行酶功能验证。
在INVSc1-HIS和INVSc1-DS-GFP的微粒体中加入2,3-氧化鲨烯、MgCl2和NADPH,建立酶促反应体系,反应结束后通过HPLC检测产物,结果显示,重组菌INVSc1-DS-GFP的微粒体反应体系中出现了与达玛烯二醇-Ⅱ紫外吸收和保留时间均一致的化合物,而在INVSc1-HIS微粒体反应体系中未发现此化合物 (图 5)。
提取重组菌INVSc1-HIS、INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP中的产物,通过TLC、HPLC和LC-MS进行检测。TLC结果显示,INVSc1-DS-GFP产物中出现与达玛烯二醇-Ⅱ Rf一致的化合物,但INVSc1-HIS中无此化合物 (图 6)。HPLC结果显示,INVSc1-DS-GFP中出现与达玛烯二醇-Ⅱ紫外吸收和保留时间一致的化合物,但INVSc1-HIS中无此化合物 (图 7)。 LC-MS结果显示,此化合物的碎片离子峰与达玛烯二醇-Ⅱ一致 (图 8)。制备该化合物,1H NMR确证为达玛烯二醇-Ⅱ。
以峰面积为纵坐标,样品浓度为横坐标,制作标准曲线 (图 9)。达玛烯二醇-Ⅱ在0.312 5~5 mg·mL-1内的线性回归方程是Y = 14 592 X -265.13 (R2 = 0.995 8,n = 5)。HPLC定量分析得出,INVSc1-DS中达玛烯二醇-Ⅱ含量为7.53 mg·g-1,INVSc1-DS-GFP中达玛烯二醇-Ⅱ含量为12.24 mg·g-1 (图 10)。
GFP是从维多利亚多管水母中分离到的一种荧光蛋白,其基因于1992年由Prasher克隆得到[10],该蛋白在450~490 nm的蓝光激发下可以发出绿色荧光,这使它成为一种理想的报告分子。随后,众多的研究将目的蛋白与绿色荧光蛋白融合表达,通过观察绿色荧光对目的蛋白进行亚细胞定位,并探索其生物学功能[11, 12, 13, 14]。此外,由于检测方法简单,荧光信号的表现形式直观,GFP通常作为报告分子用于监测细胞或者生物体中的蛋白相互作用或者蛋白表达模式等[15]。
本研究利用GFP作为报告分子对达玛烯二醇-Ⅱ合酶在酿酒酵母中的重组表达、定位及功能进行了研究。首先以茉莉酸甲酯处理的人参细胞为材料,提取RNA,反转录获得了cDNA,克隆到了一条达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds,并采用重叠PCR方法构建了融合基因ds-gfp。将融合基因转入酿酒酵母,获得重组菌INVSc1-DS-GFP。通过观察重组菌中绿色荧光的出现对达玛烯二醇-Ⅱ合酶进行定位分析,结果显示,仅在INVSc1-DS-GFP的微粒体中存在绿色荧光,证明达玛烯二醇-Ⅱ合酶是一种膜结合蛋白。利用INVSc1-DS-GFP微粒体,催化2,3-氧化鲨烯可以产生达玛烯二醇-Ⅱ,确证了ds在酿酒酵母中获得正确表达。采用TLC、HPLC、LC-MS和1H NMR方法检测重组菌INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP中产物,结果显示,两种重组菌中均产生达玛烯二醇-Ⅱ,证明ds编码的达玛烯二醇-Ⅱ合酶可催化酿酒酵母内源的2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-Ⅱ。定量分析显示,INVSc1-DS内达玛烯二醇-Ⅱ含量为7.53 mg·g-1,INVSc1-DS-GFP内达玛烯二醇-Ⅱ含量为12.24 mg·g-1,表明ds与gfp融合表达可显著提高工程菌中达玛烯二醇-Ⅱ含量。Yong等[16]研究表明,通过在目的基因的3'端或5'端融合某种标签基因,表达融合蛋白,可以产生改善蛋白折叠、提高蛋白的溶解性、增强抗蛋白酶降解性和增加蛋白产量等效果。利用TMHMM在线软件对DS的跨膜区进行分析,结果显示跨膜结构域主要分布在DS的C端,将GFP融合在DS的C端可能在一定程度改善了DS的三维结构,从而改善了重组DS的表达和活性,进而提高了工程菌中达玛烯二醇-Ⅱ的产量。
本研究构建了ds-gfp融合基因,通过在酿酒酵母中进行表达,确证了达玛烯二醇-Ⅱ合酶是一种膜结合蛋白,并通过体外酶促反应对其进行了功能鉴定;获得了产达玛烯二醇-Ⅱ的工程菌,为在酿酒酵母中组建人参皂苷代谢途径奠定了基础。ds与gfp融合表达能显著提高工程菌中达玛烯二醇-Ⅱ的产量,这一结果为工程菌中人参皂苷代谢途径的进一步优化提供了新思路,也为提高其他基因的异源表达水平提供了借鉴。
[1] | Hebshi LD, Angres BM, Li XL, et al. Green Fluorescent Protein (GFP)[M]//Encyclopedia of Immunotoxicology. Berlin Heidelberg:Springer, 2016, 10:351-351. |
[2] | Wang H, Zhen W, Yang L, et al. Construction of Saccharomyces cervisiae expression vector with GFP as report gene[J]. Guangdong J Med (广东医学), 2002, 23:1239-1240. |
[3] | Tie L. Studies of cellular distribution of PS1 using PS1/GFP fusing protein[J]. Chin Biotechnol (中国生物工程杂志), 2006, 26:17-22. |
[4] | Soundrarajan N, Cho HS, Ahn B, et al. Green fluorescent protein as a scaffold for high efficiency production of functional bacteriotoxic proteins in Escherichia coli[J]. Sci Rep, 2016, 6:20661. |
[5] | Kushiro T, Ohno Y, Shibuya M, et al. In vitro conversion of 2,3-oxidosqualene into dammarenediol by Panax ginseng microsomes[J]. Biol Pharm Bull, 1997, 20:292-294. |
[6] | Kim OT, Lee JW, Bang KH, et al. Characterization of a dammarenediol synthase in Centella asiatica (L.) Urban[J]. Plant Physiol Biochem, 2009, 47:998-1002. |
[7] | Lee MH, Han JY, Kim HJ, et al. Dammarenediol-Ⅱ production confers TMV tolerance in transgenic tobacco expressing Panax ginseng dammarenediol-Ⅱ synthase[J]. Plant Cell Physiol, 2012, 53:173-182. |
[8] | Gietz RD, Schiestl RH, Willems AR, et al. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAC/SS-DNA/PEG procedure[J]. Yeast, 1995, 11:355-360. |
[9] | Tansakul P, Shibuya M, Kushiro T, et al. Dammarenediol-Ⅱ synthase, the first dedicated enzyme for ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng[J]. FEBS Lett, 2006, 580:5143-5149. |
[10] | Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein[J]. Gene, 1992, 111:229-233. |
[11] | Popova E, Rentzsch B, Bader M, et al. Generation and characterization of a GFP transgenic rat line for embryological research[J]. Transgenic Res, 2008, 17:955-963. |
[12] | Cai XD, Liu WW. GFP expression as an indicator of somatic hybrids between transgenic Satsuma mandarin and Calamondin at embryoid stage[J]. Plant Cell Tiss Org, 2006, 87:245-253. |
[13] | Peng C, Fan X, Chen J. Function and subcellular localization of Gcn5, a histone acetyltransferase in Candida albicans[J]. Fungal Genet Biol, 2015, 81:132-141. |
[14] | Wang H. Expression of the fusion gene of Chlamydomonas reinhardtii actin and green fluorescent protein in yeast[J]. J Agric Biotechnol (农业生物技术学报), 2003, 11:347-350. |
[15] | Bensidoun P, Raymond P, Oeffinger M, et al. Imaging single mRNAs to study dynamics of mRNA export in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Methods, 2016, 98:104-114. |
[16] | Yong JL. Fusion tags technology and their applications[J]. Chin J Biotechnol (生物工程学报), 2006, 22:523-527. |