药学学报  2016, Vol. 51 Issue (6): 979-984   PDF    
醋酸地塞米松微乳的制备及对皮肤渗透性的影响
梅芬1, 曾维东2, 万涛2, 黄杰伟1, 罗双辉1, 吴传斌2, 徐月红2     
1. 广州白云山医药集团股份有限公司白云山何济公制药厂, 广东 广州 510410;
2. 中山大学药学院, 广东 广州 510006
摘要: 制备水包油型醋酸地塞米松微乳并优化处方,考察其对皮肤渗透性的影响和促进药物透皮的作用。考察醋酸地塞米松在各种脂溶性溶剂、表面活性剂和助表面活性剂中的溶解度;通过伪三元相图和经皮渗透实验,获得最佳微乳处方;采用差示扫描量热法和红外光谱法测定角质层结构在微乳环境下的变化。结果表明,最佳微乳处方为油酸/辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯/丙二醇/水(8/45/15/32, w/w),醋酸地塞米松载药量为0.75% (w/w);醋酸地塞米松微乳是混悬液剂型皮肤渗透速率的6.00倍、24 h皮肤滞留量的4.79倍。在微乳环境下,角质层吸热峰和红外吸收特征峰均发生明显变化,表明微乳影响了角质层脂质和角蛋白结构,减弱其屏障功能,从而促进药物经皮渗透。本文制备的醋酸地塞米松微乳具有良好的透皮作用,增渗机制是角质层脂质和角蛋白结构发生改变。微乳可作为有效的醋酸地塞米松经皮给药载体。
关键词: 醋酸地塞米松     微乳     经皮给药     渗透性     角质层    
Dexamethasone acetate microemulsions: formulation and effect on skin permeability
MEI Fen1, ZENG Wei-dong2, WAN Tao2, HUANG Jie-wei1, LUO Shuang-hui1, WU Chuan-bin2, XU Yue-hong2     
1. Guangzhou Baiyunshan Hejigong Pharmaceutical Co., Ltd, Guangzhou 510410, China;
2. School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China
Abstract: The present project was designed to optimize the microemulsion (ME) formulation of oil in water (O/W) for dexamethasone acetate (DA), and examine its impact on DA percutaneous permeation. The saturated solubility of DA in different oils, surfactants and co-surfactants was tested. The ratio of surfactant to co-surfactant was selected by constructing pseudo three phase diagrams to investigate the maximal microemulsion area. In vitro permeation studies of DA from microemulsion and suspension were performed to optimize the formulation further. Differential scanning calorimetry (DSC) and attenuated total reflection flourier transformed infrared spectroscopy (ATR-FTIR) were performed to investigate the mechanism of microemulsion action on skin. The optimized formulation was composed of oleic acid/Labrasol/propylene glycol/water with 8/45/15/32(w/w), and the DA loading was 0.75% (w/w). The permeation enhancement of microemusion was 6.00-fold as that of suspension, and the DA from microemulsion retained in the skin was 4.79-fold as that of suspension. DSC and ATR-FTIR results suggested that microemulsion could affect the intercellular lipid lamellae and keratin of the stratum corneum. The barrier function of stratum corneum was disordered by the microemulsion so that the dermal drug delivery was enhanced. Therefore, the optimized microemulsion enhanced DA percutaneous permeation significantly through the interaction of microemulsion with skin, microemulsion is a promising approach for DA percutaneous delivery.
Key words: dexamethasone acetate     microemulsion     percutaneous delivery     permeability     stratum corneum    

醋酸地塞米松外用制剂用于接触性皮炎、神经性皮炎、脂溢性皮炎及慢性湿疹等皮肤疾病治疗[1]。长期外用醋酸地塞米松导致并发感染,出现毛细血管扩张、色素沉着、皮肤萎缩和继发感染等不良反应。市售的醋酸地塞米松乳膏剂存在皮肤渗透效果不佳和皮肤靶向性差等问题。上述缺陷影响了醋酸地塞米松外用制剂的使用。因此,设计能促进皮肤渗透和滞留的新型醋酸地塞米松外用制剂有重要的科学意义和应用前景[2, 3, 4]

微乳 (microemulsion,ME)由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例混合而自发形成,粒径为10~100 nm,呈透明或半透明状,低黏度、各向同性的热力学和动力学稳定的油水混合体系。微乳作为皮肤给药载体具备很多优势,如微乳中的表面活性剂可显著增加脂溶性药物溶解度,从而增大药物在皮肤上的浓度梯度; 油相和表面活性剂具有促渗作用; 水相能增加角质层水化,提高药物经皮渗透性; 微乳可经毛囊等附属器渗透进皮肤等[5, 6],但微乳促渗的确切机制尚未见详细报道。本研究制备并优化醋酸地塞米松微乳,通过体外经皮渗透实验证明其促渗作用,并通过红外光谱和差示扫描热的方法研究微乳对皮肤角质层的影响,初步阐释微乳的促渗机制。

材料与方法 药品与试剂

醋酸地塞米松 (dexamethasone acetate,DA)、聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100) 及丙二醇 (propanediol,PG) (药用级,白云山何济公制药厂); 油酸聚乙二醇甘油酯 (Labrafil M 1944Cs)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 (Labrasol) 及二乙二醇单乙基醚 (Transcutol P) (Gattefosse公司); 油酸乙酯 (ethyl oleate,EO)、棕榈酸异丙酯 (isopropyl palmitate,IPP) 及聚氧乙烯蓖麻油 (Cremphor EL) (分析纯,上海阿拉丁试剂有限公司); 油酸 (oleic acid,OA)、聚山梨酯80 (Tween 80)、失水山梨糖醇脂肪酸酯 (Span 80) 及聚乙二醇400 (PEG 400) (分析纯,天津市大茂化学试剂厂); 辛酸癸酸三甘油脂 (GTCC,分析纯,西亚试剂有限公司); 甲醇 (色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司)。

仪器

高效液相色谱仪 (Agilent 1260,美国),磁力搅拌器 (德国IKA公司),HHZS-H型恒温水浴 振荡器 (哈尔滨东明医疗仪器制造厂),高速离心 机 (上海市安亭电子仪器厂),TK-12D型体外透皮 扩散仪 (上海锴凯科技贸易有限公司),DSC 200 F3 Maia®差示扫描量热仪 (德国耐驰公司),Nicolet 6700-Contiuμm傅里叶变换显微红外光谱仪 (美国Thermo Scientific公司)。

动物

SPF级Wistar大鼠,雌性,体重180~ 220 g,由中山大学实验动物中心提供,动物合格证号: SCXK (粤) 2011-0029。

溶解度测定

为了提高微乳的载药量,选择对药物溶解性较好的辅料,使更多的药物能够被包载于微乳中[6],同时药物在微乳中浓度越高,微乳与皮肤之间的浓度梯度越大,越有利于药物渗透进入皮肤。本研究选择5种油相: Labrafil M 1944Cs、EO、IPP、GTCC和OA; 5种表面活性剂: Cremphor EL、Labrasol、Tween 80、Span 80和TritonX-100; 3种助表面活性剂: PEG 400、Transcutol P和PG ,分别测定醋酸地塞米松在其中的饱和溶解度。测定方法如下[7]: 取过量醋酸地塞米松,置于5 mL离心管中,分别加入上述油相、表面活性剂或助表面活性剂2 mL,密封,涡旋使醋酸地塞米松分散均匀,然后将离心管置于37 ℃恒温水浴振荡器中,调节转速为100 r·min-1。振摇48 h后取出,8 000 r·min-1离心5 min,取上清液,甲醇稀释,经高效液相色谱 (HPLC) 测定药物浓度,计算溶解度。实验平行操作3次。

伪三元相图绘制

伪三元相图是进行微乳处方筛选的重要依据,通过伪三元相图的绘制发现微乳区域,并按微乳区域中各项比例优化微乳处方组成。将表面活性剂Labrasol和助表面活性剂PG分别按 照不同比例 (Km) 1:1、2:1和3:1混合均匀,制备成混合表面活性剂,然后将油相OA和混合表面活性剂按照质量比分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2及9:1的比例混合,于磁力搅拌器上搅拌均匀,并在磁力搅拌下慢慢滴加水,记录整个过程中外观由澄清变浑浊或由浑浊变澄清时加入水的量。然后按油相、混合表面活性剂及水在相变点的质量百分比,绘制伪三元相图,确定微乳区域。

微乳处方优化

市售醋酸地塞米松皮肤用制剂的规格为0.075% (w/w),本研究中的微乳将以乳膏或凝胶为基质制备为乳膏剂或凝胶剂,使其载药量为0.075% (w/w); 为了减少后续制备微乳皮肤制剂时微乳的用量,初定微乳中醋酸地塞米松的载药量为0.75%。在微乳区域面积最大的伪三元相图中选择以下处方进行载药考察 (表 1)。在此基础上结合经皮渗透实验确定醋酸地塞米松微乳的最优处方。

Table 1 The formulation of microemulsions and the loading of dexamethasone acetate (DA). OA: Oleic acid; PG: Propylene glycol; ME: Microemulsion
经皮渗透实验

采用20% 乌拉坦麻醉大鼠后,将其腹部毛发仔细剔除,剥离腹部皮肤,去除皮脂肪组织,用生理盐水漂洗,然后将皮肤剪成适当大小,固定在扩散池的供给池和接收池之间,使角质层面向供给池,真皮层面向接收池。将超声脱气过的接收液 (含30% PEG 400生理盐水溶液) 加入到接收池中。分别在供给池中加入0.75% 醋酸地塞米松微乳或混悬液500 μL。扩散池水浴温度为 (37 ± 0.5) ℃,搅拌子转速为250 r·min-1,在实验开始后2、5、8、12和24 h取接收液1 mL,并立即补充相同体积空白接收液。所取接收液样品经0.22 μm微孔滤膜过滤后,用HPLC测定药物的浓度。按照下列公式计算醋酸地塞米松在各个时间点单位面积的累积透过量:

${M_n} = \left[ {{C_n}V + \sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {{C_i}{V_i}} } \right]/A$

其中,A为有效透皮面积,V为扩散介质体积,Vi为每次取样体积,Ci为第i次实测药物浓度,i = 2、5、8、12、24,Cn为第n次实测药物浓度。Mn为单位面积醋酸地塞米松的累积渗透量。以累积渗透量对时 间作图可得到透皮特性曲线,线性部分的斜率为渗透速率。透皮实验结束后取皮肤,分别用水和甲醇擦洗2次除去皮肤表面残留药物,用滤纸吸干表面溶剂。将皮肤置于5 mL离心管中,剪碎皮肤并加入甲醇2 mL,涡旋1 min,提取皮肤中醋酸地塞米松,然后8 000 r·min-1离心10 min,取上清液,0.22 μm微孔滤膜过滤后,经HPLC测定后计算醋酸地塞米松皮肤滞留量。

大鼠腹部皮肤角质层的分离

按照经皮渗透实验处理大鼠皮肤,剪成适当大小,固定于透皮扩散池中。接收池中加入含0.02% 叠氮化钠的0.1% 胰酶溶液,4 ℃放置48 h后,取下皮肤,用纯水洗净皮肤残留胰酶。用镊子小心将皮肤角质层从表皮处剥离,洗净,置于 -20 ℃冷冻保存。使用前自然解冻,置于27% 溴化钠溶液中48 h,使角质层水化程度达到20%。

差示扫描量热法(DSC)考察微乳与角质层相互作用

取上述角质层,剪成约1 cm × 1 cm大小,置于24孔板中,分别加入空白微乳和纯水于37 ℃孵育角质层24 h后,取出角质层,用纯水洗干净表面残留微乳,并用滤纸吸干表面水分。将角质层剪成小块,取约10 mg,置于铝坩埚中,采用差示扫描量热仪测试,扫描的起始温度为20 ℃,终止温度为150 ℃,升温速率为10 ℃·min-1

傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)考察微乳与角质层相互作用

角质层处理同DSC测定,用滤纸吸干表面水分后,置于干燥器中干燥24 h,除去角质层中水分后用溴化钾混合压片,然后采用傅里叶变换红外光谱仪,在37 ℃用光伏MCT探测器扫描角质层的红外光谱,扫描波数为600~4 000 cm-1,分辨率为2 cm-1,扫描次数为20次。

统计学方法

对于体外的透皮实验结果,采用SPSS19.0统计软件进行分析,单因素方差分析 (one-way ANOVA) 用于数据间的比较,P < 0.05为差别有统计学意义。数据均用平均值±标准差 (x±s) 表示。

结果与讨论 1 醋酸地塞米松微乳的油相、表面活性剂及助表面活性剂的选择

醋酸地塞米松在5种油相中溶解度均不高 (图 1),OA是含18个碳原子的长链脂肪酸,常作为微乳的油相,同时也是一个公认的经皮吸收促渗剂,能促进小分子药物透过角质层进入皮肤。因此,在本研究中选择OA作为微乳体系中的油相。在各种表面活性剂中的溶解度比较结果表明,醋酸地塞米松在Labrasol的溶解度最高,因此表面活性剂确定为Labrasol; 在助表面活性剂筛选中,虽然醋酸地塞米松在Transcutol P中的溶解度最好,但该辅料没有取得进口注册证,本处方筛选致力于将来制剂的上市,因此均选用具有批准文号的辅料。因为已上市地塞米松皮肤制剂中以丙二醇作为溶剂,所以采用丙二醇为助表面活性剂。

Figure 1 Solubility of dexamethasone acetate (DA) in different oils,surfactants and co-surfactants. n = 3, x±s
2 伪三元相图绘制确定Km

以上述筛选的OA为油相、Labrasol为表面活性剂、丙二醇为助表面活性剂,绘制伪三元相图确定微乳的区域。微乳的稳定性和微乳区域大小有密切关系,微乳区域越大,在一定范围内,微乳被稀释后乳滴形态和稳定性基本保持不变。因此,以微乳区域大小作为主要的评价指标,筛选不同Km值所形成的微乳体系 (图 2)。采用软件Image-Pro Plus计算微乳区域 (伪三元相图黑色部分) 面积,当Km值为3时,微乳区域面积最大,故选定Km值为3。

Figure 2 Pseudo-ternary phase diagrams of microemulsion composed of oleic acid,Labrasol,propylene glycol and water at Km of 1 (A),2 (B) and 3 (C)
3 微乳处方的优化

Km为3的伪三元相图微乳区域中,选取不同的微乳点,以地塞米松的载药量为指标,考察其对醋酸地塞米松的增溶能力。由表 1可知,药物的加入会影响微乳的形成,不同处方的微乳对地塞米松的增溶能力不同,其中处方6和处方10均能增溶地塞米松至载药量为0.75%,而其余处方在0.75%以下有药物析出。因此选定处方6和10,利用经皮渗透实验进一步优化。

图 3A3B中处方6与处方10的经皮渗透 结果可知,与醋酸地塞米松混悬液比较,两个处方均能够显著增加醋酸地塞米松的经皮累积渗透量和皮肤滞留量 (P < 0.05),其中处方10中醋酸地塞米松的渗透速率是混悬液的6.00倍,24 h皮肤滞留量为混 悬液的4.79倍。另外,处方10的经皮累积渗透量和皮肤滞留量显著高于处方6 (P < 0.05),且处方10的混合表面活性剂在处方中的比例低于处方6。因此,确定处方10作为优选处方即OA/Labrasol/PG/H2O为8/45/15/32进行渗透机制研究。

Figure 3 The cumulative permeated amount (A) and the skin retention amount (B) of DA. n = 3,x±s. P < 0.05 vs suspen­sion; #P < 0.05 vs F6
4 差示扫描量热法考察微乳与角质层相互作用

据文献[8, 9, 10]报道,角质层在DSC扫描中可出现4个与脂质、脂-蛋白及蛋白改变相关的吸热峰 (T1~T4,温度分别约为40 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃以上),但在具体研究中不一定能全部显示。其中,T1表示皮肤中脂质由斜方晶向六角晶转换的吸热峰; T2表示皮肤脂质由六角晶向液态转换的吸热峰; T3表示脂质相关蛋白由凝胶态转换为液态的吸热峰; T4表示角质层中角蛋白变性的吸热峰。在本研究中,皮肤角质层显示了T1和T4两个吸热峰。由图 4可见,角质层经微乳作用后,T1由30.6 ℃下降到28.1 ℃,T4由105.1 ℃下降到91.6 ℃,且峰强度减弱,表明微乳作用于皮肤后,与皮肤中脂质和蛋白均有相互作用,改变了皮肤中脂质的结构和提高了流动性,同时使角蛋白的构象发生了变化。这种综合的相互作用降低了角质层的屏障功能,从而促进所载药物的经皮渗透。

Figure 4 Comparison of stratum corneum differential scanning calorimetry (DSC) thermogram of microemulsion treated and water treated
5 傅里叶变换红外光谱考察微乳与角质层相互作用

皮肤角质层红外图谱中脂质的特征峰在3 000~2 800 cm-1之间,主要是皮肤中脂质CH2的对称和非对称伸缩振动峰,由这两个特征峰的位置和强度的变化可以看出角质层脂质部分结构的变化[11]。CH2的对称伸缩振动频率在2 850~2 860 cm-1之间,非对称伸缩振动频率在2 920~2 930 cm-1之间。由图 5可以看出,当角质层用微乳孵育后,CH2的对称伸缩振动特征峰由2 852 cm-1移动到2 854 cm-1,CH2的非 对称伸缩振动特征峰由2 922 cm-1移动到2 932 cm-1。表明角质层脂质结构发生紊乱,脂质晶型可能由六角相向液态形式转换,这意味着角质层脂质结构屏障功能的减弱[11]。同时微乳孵育角质层后,CH2的对称和非对称伸缩振动峰峰面积减少,表明角质层中的脂质有部分被微乳萃取出来,同样可以降低角质层脂质结构的屏障功能。酰胺I和酰胺II的特征振动 (分别为1 600~1 700 cm-1和1 500~1 600 cm-1) 代表角质层中角蛋白的结构信息[12]。微乳孵育角质层后,酰胺I的振动由1 652 cm-1移动到1 650 cm-1,酰胺II的振动由1 545 cm-1移动到1 543 cm-1,表明角质层中角蛋白可能由α-螺旋转变为无规则卷曲,且角蛋白发生水化。角质层角蛋白水化及结构的改变,同样可以降低角质层的屏障功能。因此,ATR-FTIR的结 果表明,微乳通过对角质层的脂质和角蛋白水化及结构的影响而改变皮肤的屏障功能,从而促进药物的经皮渗透。微乳在经皮给药系统中的此功能也被Hathout等[13]证实。

Figure 5 Comparison of flourier transformed infrared spec­troscopy (FTIR) spectra of stratum corneum treated with microemulsion or water

综上,微乳作为经皮给药的载体,可以对醋酸地塞米松进行增溶、促渗及增加其皮肤滞留,其促渗机制为微乳通过改变角质层的脂质、促进角蛋白水化及改变角蛋白结构而降低其屏障功能。因此,微乳为醋酸地塞米松经皮给药制剂有前景的载体。

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